细胞培养物上清液的过滤的制作方法
【专利说明】细胞培养物上清液的过滤
[0001] 本发明涉及用于过滤细胞培养物上清液的方法。
[0002] 使用用于生产目的的生物技术方法产生了生产这样的物质的重要机会，所述物质 无法或无法经济地通过其他方法例如通过化学合成来生产，并且作为原料在自然中无法以 足够量获得。植物材料的生产目前集中于次级代谢物，其中重组表达产物的比例稳步上升。 大规模生产主要集中于植物细胞培养物或植物。植物中DNA转移的可能性也意味着对植物 成分的定量以及定性修饰是可能的。此外，植物和植物细胞培养物在生产异源蛋白中是令 人感兴趣的（Fischer 等人，Current Opinion in Plant Biology 2004，7:1_7)〇
[0003] -种策略涉及在完整转基因植物中生产异源蛋白。如上所述作为实例的使用完整 植物的一个根本性不利因素在于需要其耗时且高成本的培养以及工业生成规模所需的大 面积栽培。此外，从完整植物中纯化期望的目标物质通常需要复杂的方法步骤，尤其是当对 产物的外观和品质具有高要求时，以及物质用于药物或营养生理目的的情况。
[0004] 在第二种策略中，将转基因植物细胞培养物用于生产抗体。公知的实例是表达抗 体或其他哺乳动物蛋白（Huether等人，Plant Biol. 2005，7: 292-299)及其分泌入培 养基中。由于从细胞中纯化异源蛋白成本非常高，因此目标蛋白分泌入培养基构成了重大 改进。此外，安全性考虑也倾向于在细胞培养物中生产重组的药学上相关的蛋白，这是由于 转基因植物细胞可以排他地在生物反应器中培养并且无需释放。以更大规模用于异养植物 细胞培养物的生物反应器的开发已使得所需的大规模培养成为可能。
[0005] 对于进一步的产物纯化，在第一步中，生物质需要从上清液中分离。为此，已知多 种过滤方法。在重组分泌蛋白的情况下，产物存在于培养物上清液中。因此，目的是在分离 的生物质部分中保留尽可能少的残余水分/上清液，以避免产物的损失。多种实验室规模 的过滤方法是已知的。Buettner-Mainik Annette 等人（Plant Biotechnology Journal 9 (3) (2011) :373-383)描述了在小立碗藓（P. patens)中生产人因子H。使用吸滤器在 真空下通过织物分离含水的细胞培养物。获得的产物是潮湿的并且需要进行干燥。Lucumi 等人（Process Biochemistry 41 (10) (2006) :2180_2187)描述了在小立碗藓生物反 应器中生产 rh VGEF 过程中交叉流过滤。Marta Fernandez Nunez (E-Dissertation, Hamburg University (2010)，p 48，Chapter 2. 11.1)描述了在小立碗藓中细胞分裂素 概况分析（Cytokinin-Profiling)过程中的真空过滤。Fischer Rainer 等人（Journal of Immunological Methods 226 (1-3) (1999): 1-10)涉及在过滤后湿润的烟草愈伤组 织培养物的真空过滤。W0 2005/108596 AI涉及通过在植物细胞中表达的具有胱氨酸结 的环肽的体外合成。用吸滤器在真空下分离细胞悬浮液。Kim Sun Tae等人（Proteomics 9 (5) (2009):1302-1313)描述了稻细胞与真菌稻瘟病菌（M. grisea)在悬浮液的共 培养。通过真空过滤进行分泌蛋白的分离。Ndimba Bongani K. (Proteomics 3 (6) (2003): 1047-1059)涉及检查在悬浮培养物中的拟南芥中的细胞外基质中的变化。将真空 过滤用于研宄培养物上清液。
[0006] -个具体问题是在植物和植物细胞培养物中，与动物细胞和细菌的方法不同，固 体残余物例如在过滤的情况下的滤饼占了相当大的体积。因此，大量的上清液与其在一起 并被保留下来。因此，本发明的一个目的是改进固体生物质与培养物上清液的分离。
[0007]本发明涉及用于分离液体上清液和细胞的方法，其包括以下步骤： a) 提供细胞与液体的混合物， b) 用所述混合物充装滤器盒，其中在所述滤器盒中，在平的基底面上提供具有范围为4 Mffl-50 Mm的孔径的第一滤器，并且所述滤器盒的壁紧密地与筛状穿孔的平的基底面相连， c) 向所述混合物施加至少0.5 bar (500 hPa)的差压，由此将所述混合物的液体部分 挤压穿过滤器，并且含有细胞的滤饼保留在滤器盒中， d) 移除经过滤的液体。
[0008] 用本发明的滤器过滤基本上还可以在不使用平的基底滤器(例如用袋式滤器）和 也无压力（即仅在重力驱动下过滤）的情况下顺利进行。然而，这种类型的过滤将具有滤饼 中保留高水分这一不利因素。只要期望的纯化产物存在于液体中，这就意味着大量的产物 损失。
[0009] 基底面优选筛状穿孔。基底面本身可以是滤器，或者它可以作为单独的滤器的基 座和支撑物。
[0010] 根据本发明，通过使用在特定的基底面上的平面滤器并组合增加的压力，滤饼中 保留的残余水分可以令人惊奇地降低至不显著的最低水平。0% (重量％)的细胞外残余水 分可以达到。在这种情况下，细胞内液体不计算为残余水分。根据本发明，改进了上清液的 分离而不影响细胞内液体，这是由于细胞内残余水分不构成分泌蛋白的产物损失，并且此 外细胞内细胞群（Zellbestand)可能构成污染混合物。
[0011] 根据本发明，在优选的实施方案中，维持差压直至在滤饼中获得低于3% (重 量％)、优选低于2%、尤其优选低于1%或0%的细胞外残余水分。残余水分可以如比较例 1中所述进行测定。具体而言，本发明的滤器盒可以与所述滤器一同使用，以从由植物细胞 形成的滤饼中移除水分一尤其是降至所述残余水分。
[0012] 在优选的实施方案中，所述滤器是平面膜。例如，这些是平面形式使用的非织物、 陶瓷铸件或高分子膜。它们通常难以用于大规模的应用。本发明已显示尽管如此，在植物 细胞过滤中，平面滤器仍可以非常有效地使用，尤其是在加压过滤下，并且甚至可以实现比 例如更常用的袋式或囊式滤器更低的残余水分。
[0013] 用于本发明的方法的本发明的过滤系统尤其针对大规模应用进行开发。以这种方 式，在优选的实施方案中，将滤器盒的尺寸设计为过滤大体积的液体。尤其优选地，滤器盒 的内体积为至少2 L (dm3)，尤其为至少5L、至少8L、至少10L、至少20L、至少30L、至少40L 或至少45L。
[0014]盒的内部可以用更多用于过滤的上清液连续地或不连续地填充。在优选的实施方 案中，将至少2 L (dm3)的上清液过滤，在具体的实施方案中，将至少5L、至少8L、至少10L、 至少20L、至少40L、至少50L、至少75L或至少100L过滤。
[0015]优选地，在方法过程中，使细胞不破裂。这可以通过在低压力下保护性地操作来实 现。避免细胞破裂是有利的，因为细胞内含物不会污染过滤产物，并且进一步，可以将细胞 更有效地过滤掉。
[0016]优选地，在用于移除过滤产物的位置上的绝对压力为至少0.7 bar (700 hPa)。根 据本发明，优选地，不进行真空过滤，但滤液保持在高大气压力下，例如，至少〇. 7 bar、至少 0.8 bar、至少0.9 bar或至少1 bar。以这种方式，液体(尤其是含水）滤液的蒸发得以避 免。这意味着根据本发明的滤器盒中或施加到混合物上(尤其是在滤器盒的进口处)的压力 的增加导致绝对过压，即高于环境压力的压力。
[0017] 本发明的过压(填充的上清液和经过滤的液体之间的差压）可以以不同方式产生。 作为实例，压力可以通过压缩空气来产生(例如，向滤器盒的进口或向单独的空气输送开口 输送)。在进一步的实施方案中，压力可以通过液压，例如作为液体背压或借助于泵来产生。 进一步的可能性是通过离心来增加压力。还可以使用机械压力，例如使用柱塞。当然，所有 这些替代方式也可以彼此组合。优选地，