专利名称：应用倾斜旋转瓶进行微载体细胞培养的方法
技术领域：
微载体细胞培养是大规模细胞培养的主要方法，常规的用于微载体细胞培养的生物反应器价格昂贵，结构复杂，需要专业的操作人员使用，本发明涉及的应用倾斜旋转瓶进 行微载体细胞培养的方法，操作简单，使微载体细胞培养如同普通的细胞瓶细胞培养一样容易。
背景技术：
由于传统的转瓶单细胞层培养有着劳动量大，所需瓶数量多，容易污染微生物，耗 能大，产生污物多等缺点，微载体细胞培养技术日益受到关注。而进口的生物反应器价格昂 贵，国产的生物反应器便宜一些，培养效果和稳定性又不好保证。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种应用倾斜的旋转瓶(如3L转瓶等)进行微 载体细胞培养，达到高细胞密度，经济实用。本发明所采用的技术方案是应用转瓶、可以进行倾斜旋转重力混合生物反应试 验的装置于31°C 39°C进行大规模微载体细胞培养的方法。其所用的转瓶可为透明转瓶(如3L玻璃转瓶等)，使用前可对转瓶内部进行浓硫 酸重铬酸钾浸泡过夜后清洗晾干处理，并可进行硅化处理以减少细胞和微载体在转瓶内壁 的吸附。其所用的转瓶在每次使用前可进行干热灭菌或NaOH溶液处理，以除去热源。其所用的微载体可为球状微载体(如GE公司的Cytodex 1等)、片状微载体(如 NBS公司的Disk等)，按照相应的方法水化处理后，装在转瓶内灭菌，接种细胞前，可用预温 处理的含有血清等的DMEM或DMEM/F12等细胞培养液洗涤1 5次；也可在灭菌前用不含 谷氨酰胺的DMEM等溶液洗涤微载体1 5次后高压蒸汽灭菌，接种细胞前补加谷氨酰胺、 血清等。其待接种的细胞经胰蛋白酶等消化成单细胞悬液后，按照每IO7个细胞接种 500 5000cm2的微载体的接种量进行细胞接种，接种的细胞可为原代细胞(如地鼠肾细胞 等)、传代细胞(Vero细胞等)，人二倍体细胞(如MRC-5细胞、2BS细胞等)等，补加培养基 至培养体积。其接种细胞后，放置于37°C温室或温箱内的倾斜旋转重力混合生物反应装置进行 5 80度倾斜旋转培养，旋转速度为1 300转/分钟。根据细胞生长情况，以1次/4天 4次/1天换液频率进行更换细胞培养液。培养5 15天细胞长满微载体。其长满微载体的细胞，可进行单抗的目的蛋白的表达；可接种病毒于31°C 39°C 温室或温箱内5 80度倾斜旋转培养进行病毒扩增培养；可用于作为更大规模培养的细胞 种子。其微载体和细胞为旋转过程中依靠重力主动沉降混合，具有较低的剪切力。
其培养过程中除了定期换液，可不做任何在线检测，可不做任何在线补加氧气、氮 气、二氧化碳气体、压缩空气、酸、碱等操作。
图1应用倾斜旋转瓶进行微载体细胞培养工艺图 具体实施方案本发明所采用的技术方案是应用转瓶、可以进行倾斜旋转重力混合生物反应试 验的装置于31°C 39°C进行大规模微载体细胞培养的方法。其所用的转瓶可为透明转瓶(如3L玻璃转瓶等)，使用前可对转瓶内部进行浓硫 酸重铬酸钾浸泡过夜后清洗晾干处理，并可进行硅化处理以减少细胞和微载体在转瓶内壁 的吸附。其所用的转瓶在每次使用前可进行干热灭菌或NaOH溶液处理，以除去热源。其所用的微载体可为球状微载体(如GE公司的Cytodex 1等)、片状微载体(如 NBS公司的Disk等)，按照相应的方法水化处理后，装在转瓶内灭菌，接种细胞前，可用预温 处理的含有血清等的DMEM或DMEM/F12等细胞培养液洗涤1 5次；也可在灭菌前用不含 谷氨酰胺的DMEM等溶液洗涤微载体1 5次后高压蒸汽灭菌，接种细胞前补加谷氨酰胺、 血清等。其待接种的细胞经胰蛋白酶等消化成单细胞悬液后，按照每IO7个细胞接种 500 5000cm2的微载体的接种量进行细胞接种，接种的细胞可为原代细胞(如地鼠肾细胞 等)、传代细胞(Vero细胞等)，人二倍体细胞(如MRC-5细胞、2BS细胞等)等，补加培养基 至培养体积。其接种细胞后，放置于37°C温室或温箱内的倾斜旋转重力混合生物反应装置进行 5 80度倾斜旋转培养，旋转速度为1 300转/分钟。根据细胞生长情况，以1次/4天 4次/1天换液频率进行更换细胞培养液。培养5 15天细胞长满微载体。其长满微载体的细胞，可进行单抗的目的蛋白的表达；可接种病毒于31°C 39°C 温室或温箱内5 80度倾斜旋转培养进行病毒扩增培养；可用于作为更大规模培养的细胞 种子。其微载体和细胞为旋转过程中依靠重力主动沉降混合，具有较低的剪切力。其培 养过程中除了定期换液，可不做任何在线检测，可不做任何在线补加氧气、氮气、二氧化碳 气体、压缩空气、酸、碱等操作。
权利要求
一种应用转瓶、可以进行倾斜旋转重力混合生物反应试验的装置于31℃～39℃进行大规模微载体细胞培养方法。
2.根据权利要求1所述的倾斜旋转瓶大规模微载体细胞培养方法，其所用的转瓶可为 3L转瓶、15L转瓶等细胞培养转瓶，使用前可对转瓶内部进行浓硫酸重铬酸钾浸泡过夜后 清洗晾干清洁处理，并可进行硅化处理以减少细胞和微载体在转瓶内壁的吸附。
3.根据权利要求1 2中任意一项所述的倾斜旋转瓶大规模微载体细胞培养方法，其 所用的转瓶在每次使用前可进行干热灭菌、NaOH溶液处理，以除去热源。
4.根据权利要求1所述的倾斜旋转瓶大规模微载体细胞培养方法，其所用的微载体可 为球状微载体、片状微载体，按照相应的方法水化处理后，装在转瓶内灭菌，接种细胞前，可 用预温处理的含有血清等的DMEM、MEM/F12等细胞培养液洗涤1 5次；也可在灭菌前用 不含谷氨酰胺的DMEM等溶液洗涤微载体1 5次后高压蒸汽灭菌，接种细胞前补加谷氨酰 胺、血清等。
5.根据权利要求1所述的倾斜旋转瓶大规模微载体细胞培养方法，其待接种的细胞经 胰蛋白酶等消化成单细胞悬液后，按照每IO7个细胞接种500 5000cm2的微载体的接种 量进行细胞接种，接种的细胞可为地鼠肾细胞等原代细胞，Vero细胞等传代细胞，MRC-5细 胞、2BS细胞等人二倍体细胞，补加培养基至培养体积。
6.根据权利要求1所述的倾斜旋转瓶大规模微载体细胞培养方法，其接种细胞后，放 置于37°C温室或温箱内的倾斜旋转重力混合生物反应装置进行5 80度倾斜旋转培养，旋 转速度为1 300转/分钟。根据细胞生长情况，以1次/4天 4次/1天换液频率进行 更换细胞培养液。培养5 15天细胞长满微载体。
7.根据权利要求1所述的倾斜旋转瓶大规模微载体细胞培养方法，其长满微载体的细 胞，可进行单抗的目的蛋白的表达；可接种病毒于31°C 39°C温室或温箱内5 80度倾斜 旋转培养进行病毒扩增培养；可用于作为更大规模培养的细胞种子。
8.根据权利要求1所述的倾斜旋转瓶大规模微载体细胞培养方法，其微载体和细胞为 旋转过程中依靠重力主动沉降混合，具有较低的剪切力。
9.根据权利要求1所述的倾斜旋转瓶大规模微载体细胞培养方法，其培养过程中除 了定期换液，可不做任何在线检测，可不做任何在线补加氧气、氮气、二氧化碳气体、压缩空 气、酸、碱等操作。
全文摘要
应用倾斜旋转瓶进行微载体细胞培养的方法。一种应用转瓶、倾斜旋转重力混合生物反应装置于31℃～39℃进行大规模细胞培养的方法。即用透明的、清洁的转瓶，球状微载体或片状微载体，DMEM或DMEM/F12等细胞培养基，倾斜旋转培养方式，大规模培养原代细胞(如地鼠肾细胞等)、传代细胞(Vero细胞等)，人二倍体细胞(如MRC-5细胞、2BS细胞等)等的方法。培养过程中除了定期换液，可不做任何在线检测，可不做任何在线补加氧气、氮气、二氧化碳气体、压缩空气、酸、碱等操作。
文档编号C12N5/071GK101805722SQ201010102588
公开日2010年8月18日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者杨国松 申请人:福尔生物制药股份有限公司