动物细胞用高表达载体的制作方法

专利名称：：动物细胞用高表达载体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及动物细胞用载体DNA，该载体DNA以动物细胞为宿主，可实现重组蛋白的高水平生产。本发明的载体对于以细菌、真核微生物、昆虫细胞为宿主时无法生产的活性蛋白质的表达特别有用。
背景技术：
：已经开发了很多用于生产重组蛋白的载体，它们在以细菌、真核微生物、昆虫细胞为宿主的表达系中有望获得高的收率。但是，以它们为宿主的表达系有蛋白质修饰的问题，还有失去哺乳动物蛋白质固有特征的问题。因此，例如如果是生物学活性依赖于糖链的蛋白质，则必须以哺乳动物细胞为宿主，生产蛋白质。不仅如此，以哺乳动物细胞为宿主的重组蛋白表达系的生产性通常低，导入基因的稳定性也大多有问题。关于以哺乳动物细胞为宿主的重组蛋白生产的具体事例，可知有红细胞生成素(日本特表2002-529100)、IFN-β(日本特开平7-265084)等报道。另外，关于基因重组单克隆抗体的生产也有很多报道(日本特开平7-67648、日本特开平6-30788、日本特开平6-217786)。
发明内容提高以哺乳动物细胞为宿主的重组蛋白的生产性，这不仅对于治疗药、诊断药等的制造非常重要，对于它们的开发研究也有很大贡献。因此，开发以哺乳动物细胞、特别是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)为宿主，可容易地获得高水平生产性细胞株的载体成为当务之急。为了可容易地获得高水平生产性细胞株，最好是较多目标物质的高水平生产性细胞株存在于更少的转化细胞中。这样容易进行更高水平生产性克隆的选择。有人发现基因表达的水平因在染色体上的位置而显著不同(Annu.Rev.CellBiol.，6，679页，1990年)。为了获得高水平生产性细胞株，根据转化所用的载体DNA的性质、性能，在染色体上基因表达水平高的位置打靶是很重要的。如上所述，本发明要解决的课题是提供一种表达载体，该表达载体以哺乳动物细胞、特别是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)为宿主，可容易地获得高水平生产性细胞株。本发明人开发了一种载体，该载体具有以下结构目标基因盒导入宿主细胞染色体上基因表达水平高的位置，结果有新霉素抗性株存活。为了能对染色体上基因表达水平高的位置打靶，使新霉素磷酸转移酶(以下称为NPT)基因表达量为极微量是很重要的。另外，该载体具有二氢叶酸还原酶(以下称为DHFR)基因，通过想办法限制其表达量，可以因氨甲蝶呤刺激而使基因高效扩增。本发明开发了可以实现上述两者的载体。结果，可制备能以高水准进行稳定的蛋白质生产的载体，从而完成了本发明。即，本发明提供以下内容。(1)表达载体，该表达载体由上游起依次含有强表达诱导性启动子、基因整合用多克隆位点以及聚腺苷酸化信号序列，其下游含有不带有可在动物细胞中起作用的启动子的抗药性基因；该表达载体在动物宿主细胞中诱导基因重组蛋白的高生产性。(2)(1)的表达载体，其中强表达诱导性启动子为人巨细胞病毒主要立即早期(MajorImmediately-Early)抗原启动子、CMV5启动子(合成嵌合启动子)、β-肌动蛋白启动子或SV40早期启动子。(3)(1)或(2)的表达载体，其中抗药性基因为新霉素抗性基因、密码子非最佳化(disoptimized)新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、零霉素抗性基因或者杀稻瘟素抗性基因。(4)(1)-(3)中任一项的表达载体，其中抗药性基因为新霉素磷酸转移酶基因。(5)(1)-(4)中任一项的表达载体，其中抗药性基因为来自大肠杆菌转座子Tn5的新霉素磷酸转移酶基因。(6)(1)-(5)中任一项的表达载体，其中抗药性基因因存在于被聚腺苷酸化信号序列阻断的强表达诱导性启动子的下游而引起连读效果，因此生成极微量的抗药性基因的信使RNA或蛋白质。(7)(1)-(6)中任一项的表达载体，其中抗药性基因的下游还有不带有可在动物细胞中起作用的启动子的二氢叶酸还原酶基因或密码子非最佳化二氢叶酸还原酶基因。(8)(1)-(7)中任一项的表达载体，其中抗药性基因的下游还含有由上游起依次为强表达诱导性启动子、基因整合用多克隆位点以及聚腺苷酸化信号序列，其下游不带有可在动物细胞中起作用的启动子的二氢叶酸还原酶基因或密码子非最佳化二氢叶酸还原酶基因。(9)(1)-(6)中任一项的表达载体，该表达载体具有连接于表达诱导性低的启动子下游的二氢叶酸还原酶基因或密码子非最佳化二氢叶酸还原酶基因。(10)(7)-(9)中任一项的表达载体，其中表达诱导性低的启动子是来自哺乳动物细胞中通常只极微量表达的蛋白质基因的启动子、来自难以感染哺乳动物的病毒抗原基因的启动子、或者从上述启动子上除去增强子序列的启动子。(11)重组表达载体，该重组表达载体通过向(1)-(6)中任一项的表达载体的基因整合用多克隆位点导入目标基因而得到。(12)重组表达载体，该重组表达载体通过向(7)-(10)中任一项的表达载体的基因整合用多克隆位点导入目标基因而得到。(13)转化体，该转化体具有(1)-(10)中任一项的表达载体或者(11)或(12)的重组表达载体。(14)使目标基因高表达的转化体的制备方法，该方法包含将(11)或(12)的重组表达载体导入宿主动物细胞。(15)获得可在无血清培养基中稳定地生产蛋白质的转化体的方法，该方法包括通过将(11)或(12)的重组表达载体导入宿主动物细胞来获得转化体，将所得转化体在无血清培养基中驯化。(16)目标基因的扩增方法，该方法包括将(12)的重组表达载体导入缺失二氢叶酸还原酶的CHO细胞，然后在氨甲蝶呤存在下培养该细胞。附图简述图1表示制备新霉素抗性载体pSV/GKT-Neo的流程图。图2表示制备新霉素抗性/氨甲蝶呤抗性载体pND的流程图。图3表示制备用于所需基因表达的盒质粒pCB的流程图。图4表示制备外源基因表达载体pNOS-GKT2的流程图，其中所述外源基因表达载体pNOS-GKT2具有NPT基因顺反子，NPT基因顺反子不带有在哺乳动物细胞中具有活性的转录启动子。图5表示制备外源基因表达载体pNOS-GKT2B的流程图，其中所述外源基因表达载体pNOS-GKT2B是在不具有启动子的NPT基因顺反子的上游设置有用于终止转录的bGH-polyA。图6表示制备外源基因表达载体pNOS-GKT2B的流程图，其中所述外源基因表达载体pNOS-GKT2B设有用于提高翻译效率的兔β珠蛋白基因内含子。图7表示本发明的表达载体pNOS-GKT2B的图谱。图8表示制备hG-CFS表达用载体pNOS-GKT2B-R/hG-CFS的流程图。图9表示通过转染了本发明的表达载体pNOS-GKT2B的克隆表达的hG-CFS的斑点印迹法检测实例。图10表示转染了本发明的表达载体pNOS-GKT2B的各克隆中hG-CFS表达量的分布。图11表示实施例4中所用的本发明的表达载体pNOS的图谱。图12表示通过转染了本发明的表达载体pNOS/humanG-CSF的克隆表达的hG-CFS的斑点印迹法检测例子。图13表示通过转染了本发明的表达载体pNOS/humanG-CSF的克隆表达的hG-CFS的斑点印迹法检测例子。图14表示转染了本发明的表达载体pNOS/humanG-CSF的各克隆中hG-CFS表达量的分布。图15表示制备CMV5启动子的流程图。图16表示制备CMV5启动子的流程图。图17表示制备pCMV5-萤光素酶的流程图。图18表示通过萤光素酶测定对CMV启动子和CMV5启动子活性的比较。实施发明的最佳方案以下对本发明的实施方案进行详细说明。导入的抗药性基因(例如NPT基因等)的表达不发生或过低，则导入载体DNA的宿主细胞无法获得相应的抗药性(例如新霉素(以下称为NEO)等)。不过，本发明人在以往进行的研究中，包括使用含有市售的载体，且具有通常的NPT基因的载体DNA的所有情况下，都得到了非常多的NEO抗性细胞株。仅基于该结果即可推定由载体DNA提供的NPT基因的表达成为转染得到的细胞是否为转化体的选择性标记，但也仅有该效果。本发明人通过极端限制对NPT表达的诱导，设计为只要NPT基因顺反子不被整合到宿主细胞染色体上基因表达水平高的位置，就不发生获得NEO抗性所必需的水平的NPT表达。由此，只要被整合的载体DNA不被导入染色体上基因表达水平极高位置，所转化的宿主细胞就不会获得NEO抗性的性质，在含有一定量或以上NEO的培养基中不能存活。也有一些在载体DNA的NPT基因顺反子中使用弱的启动子的报道(Mol.CellBiol.，6，2593页，1986年；Mol.CellBiol.，7，1296页，1987年；DNA，7，651页，1988年)，但还不能认为这些例子中可有效且充分地进行高生产性转化体的选择。本发明的原理是通过将DNA片段在不带有在哺乳动物细胞中具有转录活性的启动子的状态下设置于在哺乳动物细胞中具有转录活性的启动子和紧随其后的具有强的转录终止活性的最适合的聚腺苷酸化信号序列的下游，可以显著阻碍并衰减所转化的宿主细胞中NPT的表达；其中所述DNA片段包含来自大肠杆菌转座子Tn5的NPT基因顺反子。本发明的NPT基因顺反子由于不具有启动子，因此定义为“无启动子NPT基因顺反子”。即，本发明提供表达载体，该表达载体由上游依次含有强表达诱导性启动子、基因整合用多克隆位点以及聚腺苷酸化信号序列，其下游含有不带有在哺乳动物细胞中可起作用的启动子的抗药性基因。本发明的表达载体可在动物宿主细胞中诱导基因重组蛋白的高生产性。本发明中，抗药性基因例如可使用新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、零霉素抗性基因或者杀稻瘟素抗性基因，特别优选新霉素磷酸转移酶基因，最优选来自大肠杆菌转座子Tn5的新霉素磷酸转移酶基因。本发明中，通过使用弱表达性的新霉素磷酸转移酶基因(也将其称为密码子非最佳化(disoptimized)新霉素抗性基因)作为抗药性标记，可以构建外源基因表达载体，其中所述弱表达性的新霉素磷酸转移酶基因具有SEQIDNO.50记载的碱基序列，所述SEQIDNO.50通过将新霉素磷酸转移酶基因中的密码子的一部分或全部置换成在CHO细胞中使用频度低的密码子而构建。本发明中，抗药性基因因存在于被聚腺苷酸化信号序列阻断的表达诱导性启动子的下游而引起连读效果，因此生成极微量的抗药性基因的信使RNA或蛋白质。本发明的表达载体整合到宿主细胞染色体上强表达性位置，这可通过在含有与抗药性基因顺反子所具有的特性对应的药物的培养基中选择存活株来实现，但需要染色体上该位置上的目标蛋白质的表达本身受到强烈的诱导。因此，对于导入蛋白质基因的多克隆位点(以下称为MCS)的启动子和聚腺苷酸化信号(以下称为polyA)要从具有最强的表达诱导性的中选择。启动子有人巨细胞病毒立即早期(Immediately-Early)(hCMVMIECell，41，521页，1985年)启动子、β-肌动蛋白启动子(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，4831页，1987年)或SV40早期启动子等。本发明中，使用CMV5启动子替代上述CMV启动子，则可以构建外源基因表达载体，其中所述CMV5启动子具有SEQIDNO.49中记载的碱基序列，SEQIDNO.49可根据MassieB等的文献(JournalofVirology，1998Mar；72(3)2289-96.Inducibleoverexpressionofatoxicproteinbyanadenovirusvectorwithatetracycline-regulatableexpressioncassette.MassieB，CoutureF，LamoureuxL，MosserDD，GuilbaultC，JolicoeurP，BelangerF，LangelierY.)制备。PolyA信号有来自人生长激素的polyA序列等。本说明书中，将具有整合该目标蛋白质基因的MCS的顺反子称为“表达盒”。本发明还涉及将整合有目标基因的本发明的表达载体导入宿主得到的转化体，以及该转化体的制备方法。本发明的表达载体还优选可具有DHFR基因顺反子。该表达载体使用缺失二氢叶酸还原酶的CHO细胞作为宿主细胞，该载体DNA的基因向该宿主细胞进行转染后，可以因氨甲蝶呤使该载体DNA中所含的基因高效扩增。本发明中，可以通过使用弱表达性的二氢叶酸还原酶基因(也可以将其称为密码子非最佳化(disoptimized)二氢叶酸还原酶基因)作为选择标记，构建外源基因表达载体，其中所述弱表达性的二氢叶酸还原酶基因具有SEQIDNO.51的碱基序列，该SEQIDNO.51通过将二氢叶酸还原酶基因密码子的一部分或全部置换成在CHO细胞中使用频度低的密码子而构建。具有SEQIDNO.51的碱基序列的弱表达性二氢叶酸还原酶基因还可以与具有SEQIDNO.50的碱基序列的弱表达性新霉素磷酸转移酶基因组合使用。DHFR基因顺反子与NPT基因顺反子所使用的同样，将其以不带有可在哺乳动物细胞中表达的启动子的形式配置于具有强表达诱导性启动子的基因整合用多克隆抗体位点和紧随其后的最适合的聚腺苷酸化信号序列的下游，或者使DHFR基因顺反子与表达诱导性降低的启动子、例如从通常对CHO细胞为非感染性的SV40的病毒抗原启动子中除去增强子区的启动子连接使用。为了促进基因扩增，本发明人认为通过减弱或抑制DHFR基因的表达诱导性，培养基中含有的MTX可更有效地引导促进整合到宿主细胞染色体中的载体DNA的扩增。本发明还提供获得蛋白质的高水平生产性细胞克隆的方法，该方法包括使用整合有蛋白质基因、具有上述DHFR顺反子的载体DNA进行转染，转化宿主细胞，进行整合到宿主细胞染色体中的载体DNA的扩增。本发明还提供获得在无血清培养基中可稳定地高水平进行蛋白质生产的高水平生产性细胞克隆的方法，该方法包括使用整合有蛋白质基因的上述载体DNA进行转染，转化宿主细胞，将所得转化体在无血清培养基上驯化。本发明还提供载体DNA，该载体DNA具有上述DHFR基因顺反子和在强表达诱导性启动子和最适合聚腺苷酸化信号之间的基因整合用多克隆位点。该载体DNA可用于上述具有无启动子NPT基因顺反子的载体DNA的构建。本发明中，“顺反子”是指以启动子、结构基因、聚腺苷酸化信号(polyA)为基本构成，通过转录·翻译来表达蛋白质的单位，其中可以含有相关或任意的DNA序列作为插入序列。“强表达诱导性启动子”是指在通常的载体DNA中，通常用作蛋白质表达的启动子，优选表达诱导性高的人巨细胞病毒主要立即早期抗原启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子等启动子。本发明的载体DNA通过在主链载体上整合NPT基因顺反子、表达盒，进一步根据需要整合DHFR基因顺反子来获得。对于主链载体没有特别限定，例如可以使用具有ColE1-Ori(ColE1ori)的载体DNA(pUC系Gene，33103页，1985年等)。本发明的载体的使用方法有将蛋白质基因整合到本发明的载体的MCS后，通过阳离子系脂质体法向宿主细胞进行转染，在含有NEO的培养基中进行存活株的选择，获得蛋白质高水平生产性细胞克隆的方法。通过在含有NEO的培养基中进行存活株的选择而得到的大多数细胞已经实现了相对高的表达水平，为从其中选择具有更高生产性的细胞，可以测定蛋白质的表达水平。将所得高生产性细胞反复进行有限稀释，然后继代培养使其稳定。想进一步获得高生产性细胞株时，可以使用也具有DHFR基因顺反子的载体作为本发明的载体，在培养基中加入MTX，然后通过刺激整合到宿主细胞内的DHFR基因来进行基因扩增。实施例记载的本发明的表达载体(pNOS-GKT2B或pNOS-GKT2B-R)的更具体的利用方法还有按照以下顺序利用的方法。(1)克隆目标物质(蛋白质)的基因后，(2)整合进本发明的表达载体(pNOS-GKT2B或pNOS-GKT2B-R)的多克隆位点(MCS)，制备表达构建物。(3)使该表达构建物在大肠杆菌中扩增，(4)通过脂转染法或电穿孔法向CHO细胞(DHFR阴性)进行转染，(5)在培养基中加入G418进行培养，选择G418抗性细胞。(6)一边培养所得细胞，一边反复克隆，(7)选择目标物质的生产量高的克隆，(8)繁殖速度加快，继续培养至稳定。(9)将稳定后的克隆的培养基由添加FCS培养基逐渐降低FCS量，进行在无血清培养基中的驯化。(10)对于高生产性克隆，向培养基中分阶段添加MTX(15nM-1μM)，使导入的构建物的DNA扩增，(11)再次选择高生产性克隆，(12)繁殖速度进一步加快，继续培养至稳定。(13)将稳定后的克隆的培养基由添加FCS培养基逐渐降低FCS量，进行在无血清培养基中的驯化。培养基的去血清可以在(9)和(13)的任一阶段进行。通过以下的实施例进一步具体说明本发明的表达载体的制备方法和使用方法。将本实施例中使用的起始质粒、启动子等构成要素以同等的物质置换实施，这对于本领域技术人员来讲是容易做到的，因此本发明的范围并不受限于实施例。实施例实施例1本发明的表达载体的构建(1)新霉素抗性载体[pSV/GKT-Neo]的制备NEO载体[pSV/GKT-Neo]具有来自于质粒pUC18(Gene，33，103页，1985年)的ColE1-Ori(ColE1ori)和新霉素磷酸转移酶(NPT)基因顺反子。使用具有SEQIDNO.1和2所示碱基序列的引物，通过PCR法，由质粒pUC18扩增ColE1-Ori。PCR在以下条件下实施。PCR试剂盒使用宝酒造销售的试剂盒，10倍浓缩反应缓冲液、dNTP溶液全部使用试剂盒附属品。首先向36.5μl无菌蒸馏水中加入10倍浓缩反应缓冲液、dNTP溶液、各1μl100μMSEQIDNO.1和2中记载的引物、1μl模板DNA、0.5μlPyrobestDNA聚合酶(5U/μl)，完全混合，通过TakaraThermalCyclerPERSONAL(宝热循环仪)实施PCR反应。即在94℃加热处理5分钟，然后将变性(94℃、30秒)、引物退火(55℃、30秒)、扩增(72℃、1分钟)三步骤重复35次，再在72℃处理5分钟，终止反应。以下记述的PCR反应通过同样的反应循环实施。在37℃将反应终止后得到的含有约600个碱基对的PCR产物用限制酶(以下记述的限制酶全部为NEB公司制备)的1μlSacII(20000U/μl)和1μlClaI(5000U/μl)酶切2.5小时。限制酶处理后，将反应液全部添加到1％琼脂糖凝胶中，以60mA进行25分钟的电泳。从凝胶中回收含有约600个碱基对的DNA条带，在-135℃冷冻10分钟后进行离心，在其上清中回收DNA片段(ColE1-Ori盒；36ng/μl)。以下的限制酶处理和DNA片段的回收同样地实施。接着，将3μg质粒pSV(D)S/Neo(日本特开平10-179169)分别用1μl限制酶SacII(20000U/μl)和ClaI(5000U/μl)酶切，制备含有约2200个碱基对、具有处于除去了增强子部分的猿猴病毒40(SV40)早期启动子的下游NPT基因顺反子的DNA片段(NEO盒1；28ng/μl)。将该两个片段通过宝DNA连接反应试剂盒ver.2(Takara连接试剂盒ver.2)(宝酒造公司制造)连接，制备pSVNEO/Ori’。实际上将1μlColE1-Ori盒和1μlNEO盒1混合，向其中加入与混合液等量的宝DNA连接反应试剂盒ver.2-溶液I，在16℃反应30分钟，连接DNA。接着通过氯化铷法转化大肠杆菌(E.coli)XL-1BlueTM感受态细胞。将在含有硫酸卡那霉素(50μg/ml；Sigma公司制造)的LB-琼脂(Difco公司)上得到的大肠杆菌集落接种于含有硫酸卡那霉素(50μg/ml；Sigma公司制造)的Terrific肉汤培养基(1升中含有12g细菌用胰蛋白胨(Difco公司制造)、24g细菌用酵母提取物(Difco公司制造)、4ml甘油(和光纯药社制造)、2.31gKH2PO4(和光纯药社制造)、12.5gK2HPO4(和光纯药社制造))中。培养约20小时后集菌，通过碱-SDS法(CurrentProtocolinMolecularbiology，1-6-3页，1986年)分离质粒，制备pSVNEO/Ori’。以下记述的连接反应、转化、质粒分离完全按照同样的方法进行。接着，将pSVNEO/Ori’分别用1μl限制酶ApaI(1000U/μl)和ClaI(5000U/μl)酶切，纯化，得到含有约2800个碱基对的DNA片段(38ng/μl)，通过连接反应将其与接头(pSVNEO接头)连接，经过转化、质粒分离，制备pSVNEO/Ori，其中所述接头是使新合成的具有SEQIDNO.3和4所示碱基序列的寡核苷酸退火得到的具有多个限制酶切位点的接头。接头的制备如下实施各取50μlSEQIDNO.3和4的寡核苷酸(100μM)装入微量管(1.5ml；Tref公司制造)，通过恒温加热器在70℃加热5分钟，然后用约1小时冷却至25℃。以下的接头的制备也同样实施。另一方面，使用具有SEQIDNO.5和6所示碱基序列的引物，通过PCR，由质粒pSV2Neo(Stratag6ne公司制造)扩增DNA片段，该DNA片断包含在大肠杆菌中负责表达诱导的、NPT基因顺反子的启动子序列。PCR试剂盒使用宝酒造销售的试剂盒，10倍浓缩反应缓冲液、dNTP溶液、10倍浓缩氯化镁溶液全部使用试剂盒附属品。首先向31.5μl无菌蒸馏水中加入5μl10倍浓缩反应缓冲液、5μldNTP溶液、5μl10倍浓缩氯化镁溶液、各1μl100μMSEQIDNO.5和6的引物、1μl模板DNA、0.5μlLATagDNA聚合酶(5U/μl)，完全混合后，通过TakaraThermalCyclerPERSONAL(宝热循环仪)实施PCR反应。以下的使用LATagDNA聚合酶的PCR反应以同样的混合比率进行。通过琼脂糖凝胶对所得含有约400个碱基对的PCR产物进行展开、分离、纯化(GKT片段；58ng/μl)，然后通过连接反应与PCR产物克隆用质粒pT7Blue(R)(50ng/μl；Novagen公司制造)连接，经过转化、质粒分离，制备pT7B-GKT。接着，将6μgpSVNEO/Ori用1μl的限制酶PstI(20000U/μl)酶切，得到含有约2800个碱基对、具有所得的ColE1-Ori、去除了增强子部分的SV40早期启动子、NPT基因顺反子的部分序列的片段(38ng/μl)与用PstI酶切的6μgpT7B-GKT，得到含有约400个碱基对、具有所得NPT基因顺反子的部分序列的片段(GKT盒；9ng/μl)，通过连接反应连接，经过转化、质粒分离，制备pSVGKT-Neo。制备[pSVGKT-Neo]的流程如图1所示。(2)新霉素抗性/氨甲蝶呤抗性载体[pND]的制备将上述5μgpSVGKT-Neo分别用1μl的限制酶EcoRI(20000U/μl)和ClaI(5000U/μl)酶切，用琼脂糖凝胶展开、分离、纯化，得到含有约3000个碱基对的片段pSV/GKT-Neo盒(44ng/μl)。将pSVP(D)S/DHFR(日本特开平10-179169)分别用1μl的限制酶EcoRI(20000U/μl)和ClaI(5000U/μl)酶切，得到含有约1800个碱基对、具有去除了增强子部分的SV40早期启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因顺反子的片段(DHFR盒；25ng/μl)。通过连接反应将pSV/GKT-Neo盒与DHFR盒连接，经过转化、质粒分离，得到pND。制备[pND]的流程图如图2所示。(3)用于所需基因表达的盒质粒[pCB]的制备本载体由启动子、目标蛋白质基因整合用多克隆位点(MCS)和聚腺苷酸信号构成。启动子使用来自被认为具有最强的表达诱导性的启动子之一的人巨细胞病毒(hCMV)MIE抗原启动子(PCMV)。PolyA信号采用了有报道认为具有高生产性且再现性优异的牛生长激素polyA信号(bGH-polyA)。首先，使用具有SEQIDNO.7和8所示碱基序列的引物，通过使用LATagDNA聚合酶的PCR法，由质粒pRc/CMV(Invitrogen公司制造)扩增，通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，得到含有约650个碱基对的PCMV片段，将其通过连接反应与pT7Blue(R)连接，经过转化、质粒分离，制备pT7B-PCMV。另一方面，使用具有SEQIDNO.9和10所示碱基序列的引物，通过使用LATagDNA聚合酶的PCR法，由pRc/CMV扩增，得到含有约650个碱基对的bGH-polyA片段，将其通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，然后通过连接反应与pT7Blue(R)连接，经过转化、质粒分离，制备pT7B-bGH-polyA。将5μg质粒pUC18分别用1μl限制酶EcoRI(20000U/μl)和HindIII(20000U/μl)酶切，将新合成的具有SEQIDNO.11和12所示碱基序列的寡核苷酸退火所得的具有多个限制酶切位点的接头(CB接头)，制备pUC18-CB-接头。接着，将pUC18-CB-接头分别通过1μl限制酶BamHI(20000U/μl)和HindIII(20000U/μl)使其断裂，得到含有约2700个碱基对的DNA片段，将其通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，制备pUB18-CB-接头盒(26ng/μl)。将4.7μgpT7B-PCMV分别用1μl限制酶NotI(10000U/μl)和HindIII(20000U/μl)酶切，通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，得到含有约650个碱基对的DNA片段(PCMV盒；12ng/μl)。再将1.3μgpT7B-bGH-polyA分别用1μl限制酶NotI(10000U/μl)和BamHI(20000U/μl)酶切，通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，得到含有约650个碱基对、包含bGH-polyA的DNA片段(bGH-polyA盒；2ng/μl)。将pUB1g-CB-接头盒、PCMV盒、bGH-polyA盒通过连接反应连接，经过转化、质粒分离，完成[pCB]。用于所需基因表达的盒质粒[pCB]的制备流程图如图3所示。(4)外源基因表达载体[pNOS-GKT2]的制备(所述外源基因表达载体[pNOS-GKT2]具有NPT基因顺反子，该NPT基因顺反子不带有在哺乳动物细胞中具有活性的转录启动子)将5μgpCB分别用1μl限制酶BamHI(20000U/μl)和HindIII(20000U/μl)使其断裂，通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，得到含有约2700个碱基对的DNA片段pCB盒(31ng/μl)。接着使用具有SEQIDNO.13和14所示碱基序列的引物，通过LATagDNA聚合酶进行扩增，得到含有NPT基因顺反子的PCR产物，将其分别用1μl限制酶NotI(10000U/μl)和NheI(5000U/μl)酶切，然后通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，得到含有约2700个碱基对的DNA片段NEO盒2(39ng/μl)。将pCB盒和NEO盒2通过连接反应连接，经过转化、质粒分离，得到pCB/GKT-Neo。再将3μgpCB/GKT-Neo分别用1μl限制酶HindIII(20000U/μl)和EcoRI(20000U/μl)酶切，通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，得到含有约1000个碱基对、包含PCMV、NPT基因、bGH-polyA的DNA片段(CNB盒；11ng/μl)。将5μgpND分别用1μl限制酶SacII(20000U/μl)、EcoRI(20000U/μl)和1.5μl限制酶NaeI(10000U/μl)酶切，通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，得到含有约2300个碱基对、包含DHFR基因顺反子的DNA片段(DHFR盒2；33ng/μl)，其中DHFR基因顺反子具有ColE1-Ori和除去了增强子部分的SV40早期启动子。使新合成的具有SEQIDNO.15和16所示碱基序列的寡核苷酸退火，得到具有限制酶切位点的接头(HS接头)。分别将1μlCNB盒、PCMV盒、DHFR盒2、HS接头通过连接反应连接，经过转化、质粒分离，制成[pNOS-GKT2]。外源基因表达载体[pNOS-GKT2]的制备流程如图4所示，其中所述外源基因具有NPT基因顺反子，该NPT基因顺反子不带有在哺乳动物细胞中具有活性的转录启动子。(5)外源基因表达载体pNOS-GKT2B的制备(所述外源基因表达载体pNOS-GKT2B在不具有启动子的NPT基因顺反子的上游配置有用于终止转录的bGH-polyA)使用具有SEQIDNO.17和18所示碱基序列的引物，通过使用LATagDNA聚合酶的PCR法，由pNOW3(日本特开平10-179169)扩增，通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，得到含有约200个碱基对的DNA片段(bGH-polyA；42ng/μl)。将其通过连接反应与pT7Blue(R)连接，经过转化、质粒分离，制备pT7Blue/BGHpA。将2.2μgpT7Blue/BGHpA分别用1μl限制酶NotI(10000U/μl)和NheI(5000U/μl)酶切，通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，得到含有约200个碱基对、包含bGH-polyA的DNA片段bGH-polyA盒2(3ng/μl)。将5μgpNOS-GKT2分别用1μl限制酶NotI(10000U/μl)和XbaI(20000U/μl)使其断开，通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，得到含有约4200个碱基对的DNA片段pNOS-GKT2盒(13ng/μl)。分别将1μlbGH-polyA盒2和pNOS-GKT2盒通过连接反应连接，经过转化、质粒分离，制备pNOS-GKT2B。外源基因表达载体pNOS-GKT2B的制备流程图如图5所示，其中所述外源基因是在不具有启动子的NPT基因顺反子的上游配置用于终止转录的bGH-polyA得到的。(6)外源基因表达载体[pNOS-GKT2B-R]的制备(所述外源基因表达载体[pNOS-GKT2B-R]配置有用于提高翻译效率的兔β珠蛋白基因内含子)使用具有SEQIDNO.19和20所示碱基序列的引物，通过使用LATagDNA聚合酶的PCR法，由兔基因组DNA(CHlaboratories公司制造)扩增，得到编码含有兔β珠蛋白基因的剪接供体和剪接受体序列的内含子的区(gloSA)的PCR产物(片段长约600碱基对)，将其通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，通过连接反应与pT7Blue(R)连接，经过转化、质粒分离，制备pT7B-gloSA。将5μgpT7B-gloSA分别用1μl限制酶NotI(10000U/μl)和XhoI(20000U/μl)酶切，通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，得到含有约600个碱基对、包含gloSA的DNA片段(gloSA盒；22ng/μl)。将5μgpNOS-GKT2B用1μl限制酶NotI(10000U/μl)和SalI(20000U/μl)使其断开，通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，得到含有约4400个碱基对的DNA片段(pNOS-GKT2盒；13ng/μl)。分别将1μlgloSA盒和pNOS-GKT2盒通过连接反应连接，经过转化、质粒分离，制备pNOS-GKT2B-R。外源基因表达载体[pNOS-GKT2B-R]的制备流程图如图6所示，其中所述外源基因表达载体[pNOS-GKT2B-R]配置有用于提高翻译效率的兔β珠蛋白基因内含子。[pNOS-GKT2B-R]的结构如图7所示，全部的碱基序列如SEQIDNO.21所示。实施例2使用本发明的表达载体进行的人粒细胞集落刺激因子的生产试验作为由表达载体pNOS-GKT2B-R进行的人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的转染和建立G418抗性早期克隆的目标物质，人们选择了集落刺激因子的一种hG-CSF。该蛋白质具有糖链，在以大肠杆菌或酵母为宿主的生产中无法获得正常形态的重组蛋白。(1)hG-CSF表达用载体[pNOS-GKT2B-R/hG-CSF]的制备使用具有SEQIDNO.22和23所示碱基序列的引物，通过使用LATagDNA聚合酶的PCR法，由人脾脏cDNA扩增，通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，得到含有约600个碱基对、包含hG-CSF的cDNA的片段(hG-CSF片段；13ng/μl)。将其通过连接反应与pT7Blue(R)连接，经过转化、质粒分离，制备pT7Blue/hG-CSF。将pT7Blue/hG-CSF分别用1μl限制酶NotI(10000U/μl)和XbaI(20000U/μl)酶切，通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，得到含有约600个碱基对、包含hG-CSF的cDNA的DNA片段(hG-CSF盒；6ng/μl)。将pNOS-GKT2B-R用1μl限制酶NotI(10000U/μl)和XbaI(20000U/μl)使其断开，通过琼脂糖凝胶进行展开、分离、纯化，得到含有约5000个碱基对的DNA片段(pNOS-GKT2B-R盒；19ng/μl)。分别将1μlhG-CSF盒和pNOS-GKT2B-R盒通过连接反应连接，经过转化、质粒分离，制备pNOS-GKT2B。hG-CSF表达用载体[pNOS-GKT2B-R/hG-CSF]的制备流程图如图8所示，全部的碱基序列如SEQIDNO.24所示。(2)hG-CSF表达用载体[pNOS-GKT2B-R/hG-CSF]转染哺乳动物细胞和通过G418选择转化细胞株使用脂转染法(Qiagen公司制造的Effectene转染试剂)，将1μgpNOS-GKT2B-R/hG-CSF转染25cm2培养瓶中的1500000个DHFR缺失CHO细胞(DG44株；GairUrlaub博士提供；Somat.CellMol.Genet.12，555页，1986年)。导入方法根据制造商的使用说明书。48小时后，通过胰蛋白酶处理使细胞剥离，计测细胞数后，将300000个细胞用添加了10％透析胎牛血清的Iscove’sModifiedDalbecco’s培养基稀释，其中胎牛血清中含有100ml0.8mg/mlG418。然后铺于10片96孔微量滴定板(960孔)中，在5％二氧化碳存在下、在37℃培养约3周，只在117个孔中可见细胞的存活(G418抗性细胞株)。从存活细胞中任意选择61株G418抗性克隆，与添加含有1ml0.8mg/mlG418的10％透析胎牛血清的Iscove的改良的Dalbecco’s培养基一起转移到24孔板，培养至汇合。去除培养上清，将1mlPBS(Invitrogen公司制备)加入各孔，再次除去。向其中加入0.5mlCHO细胞用无血清培养基CHO-S-SFMII(Invitrogen公司制备)，在5％二氧化碳存在下、在37℃培养72小时。接着对培养上清中hG-CSF的生产量进行研究。(3)通过pNOS-GKT2B-R/hG-CSF转化细胞克隆检测hG-CSF的生产量生产量的检测通过斑点印迹法实施。将各1μl培养72小时的上清和市售重组hG-CSF(PeproTech公司制造)用CHO细胞用无血清培养基CHO-S-SFMII2倍的系列稀释(8-0.125ng/μl)和CHO-S-SFMII分别在尼龙膜(Nytran0.45μm；Schleicher&Schuell公司制造)上点样，风干1小时，用BlockAce封闭后与1μg/μl浓度的抗hG-CSF抗体(PeproTech公司制造)、随后与辣根过氧化物酶(HRP)标记抗兔IgG抗体(DAKO公司制造)反应。反应的抗体通过用SuperSignalWestPicoReagent试剂(Pierce公司制造)检测HRP活性的方法，使用LuminoCapture(Ato公司制造)进行检测。图9表示通过斑点印迹法得到的结果。(4)通过pNOS-GKT2B-R/hG-CSF转化细胞克隆测定hG-CSF的生产量由本发明的表达载体pNOS-GKT2B表达的hG-CSF各克隆的表达量的分布如图10所示。61株G418抗性株中约三分之二(39株)以显著高的水平(0.25μg/μl)生产hG-CSF。61株中有33株(54.1％)为1μg/μl或以上。更令人惊讶的是，有12株(19.7％)为8μg/μl或以上。显示出的最高生产水平是178μg/ml/3天。这与文献报道的由代表性表达载体进行的基因扩增前的早期克隆数据相比较，为最高水准(DNA，7，651页，Gene，76，19页，1988年；Biotechnology，10，1455页，1992年；Biotechnology，8，662页，1990年；Gene76，19页，1989年；Biotechnology9，64页，1991年)。通过基因扩增进行的重组细胞的筛选通常需要6个月至1年，且因培养条件或扩增刺激剂浓度不同而差异很大，因此，可认为关于表达载体的基本性能比较，以扩增前早期克隆的表达水平进行较为适当。由此可以判断本发明的表达载体的性能极高。结果可以确定“具有被强烈的聚腺苷酸化信号阻断的无启动子NPT基因顺反子的表达载体”，其所得G418抗性株的数量极少，并可以以非常高的效率确立目标物质蛋白质的高生产性细胞株。由此证明本发明的表达载体可以具有非常高的蛋白质表达水平。实施例3G418抗性细胞株的基因扩增G418抗性细胞株中，将hG-CSF的产量为77μg/ml/3天的克隆进行继代培养，使其稳定，然后通过MTX进行基因扩增。开始用含有15nMMTX的培养基扩增2周，再用含有60nMMTX的培养基扩增2周，接着用含有250nMMTX的培养基扩增2周，进一步用含有1μMMTX的培养基扩增2周，此时hG-CSF的生产水平上升至相对于培养基为117μg/ml/3天。基因扩增所用的MTX浓度通常为10nM-10μM之间的多个阶段，终浓度常使用10μM，但由于对细胞的毒性问题，高浓度暴露对于建立稳定的重组细胞株方面有问题。因此，可以以低浓度MTX实现高生产性，这也成为重要的评价标准，本实验中，最高为1μM。包括通常的选择的MTX暴露期间通常为6-12个月，而本实验进行了约8周。即使在这样的实验条件下也可见hG-CSF的生产量增加，对于基因扩增系也可确认本发明载体的高性能。实施例4使用pNOS的重组humanG-CSF的表达(1)pNOS/hG-CSF表达载体的制备直接使用来自大肠杆菌的Tn5作为NO抗性基因，使用HGHpA代替BGHpA，除此之外，与实施例1同样地构建表达载体pNOS。按照实施例2(1)记载的方法，将人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)基因插入克隆位点，构建表达载体pNOS/hG-CSF。pNOS/hG-CSF的结构如图11所示，全部的碱基序列如SEQIDNO.25所示。(2)使用pNOS的重组人G-CSF表达量的测定当在25cm2培养瓶中培养的CHO细胞达到40-80％汇合状态时，使用由Qiagen公司销售的转染试剂，将pNOS-humanG-CSF表达载体整合到CHO细胞中。2天后进行胰蛋白酶处理，将细胞从烧瓶上剥离，通过血细胞计数板确认细胞数，铺于10片96孔板上，使浓度为5×105细胞/100ml。2周后，计数出现的集落，有146个集落。将72个该10片96孔板上出现的单集落转移到24孔板上。转移到24孔板的克隆汇合时，用1×PBS洗涤1次，然后添加无血清培养基，3天后回收培养上清。将各1μl培养3天后的上清和稀释的系列标准品在膜上点样。风干1小时后封闭。然后用TBS/T洗涤1次。洗涤结束后，通过1μg/ml的兔抗人G-CSF抗体进行一次抗体反应。再用TBS/T洗涤3次，用HRP标记抗兔IgG进性二次抗体反应。再用TBS/T洗涤3次，然后通过SuperSignalWestPicoReagent的发光反应确认人G-CSF表达量。由本发明的表达载体pNOS/humanG-CSF表达的hG-CSF通过斑点印迹法检测的例子如图12和图13所示。由pNOS/humanG-CSF表达的hG-CSF各克隆的表达量分布如图14所示。通过斑点印迹法确认的使用pNOS表达载体的humanG-CSF表达量的结果(实施浓度检测的克隆数为46个)显示以65％的概率获得pNOS超过1μg/ml的克隆，并且其中的33％具有超过8μg/ml的表达量。实施例5CMV5启动子的制备(图15和图16)(I-1)由1μlII型腺病毒基因组(adenovirustype2genome)进行L1区的PCR。(PCR试剂盒采用宝酒造制造的产品，缓冲液·dNTP完全使用附属品)。首先，向36.5μl无菌蒸馏水中加入5μl2.5mMdNTP、5μl10×PyrobestPCR缓冲液，以1μlL1区的有义引物[SEQIDNO.26](100μM)和1μ1反义引物[SEQIDNO.27](100μM)、1μlDNA为模板，向其中加入0.5μlDNA聚合酶Pyrobest(5U/μl)，进行移液，完全混合，在以下条件下进行PCR。即在94℃加热处理5分钟，然后将94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒三步骤重复35次，再在72℃处理5分钟，终止反应。PCR结束后，使用1％琼脂糖凝胶，通过电泳确认目标基因区的扩增，可见在40bp附近的条带。(I-2)由1μlII型腺病毒基因组进行L2区的PCR。(PCR试剂盒采用宝酒造制造的产品，缓冲液·dNTP完全使用附属品)。首先，向36.5μl无菌蒸馏水中加入5μl2.5mMdNTP、5μl10×PyrobestPCR缓冲液，以1μlL2区的有义引物[SEQIDNO.28](100μM)和1μl反义引物[SEQIDNO.29](100μM)、1μlDNA为模板，向其中加入0.5μlDNA聚合酶Pyrobest(5U/μl)，进行移液，完全混合，在以下条件下进行PCR。即在94℃加热处理5分钟，然后将94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒三步骤重复35次，再在72℃处理5分钟，终止反应。PCR结束后，使用1％琼脂糖凝胶，通过电泳确认目标基因区的扩增，可见在70bp附近的条带。(I-3)由1μlII型腺病毒基因组进行L3区的PCR。(PCR试剂盒采用宝酒造制造的产品，缓冲液·dNTP完全使用附属品)。首先，向36.5μl无菌蒸馏水中加入5μl2.5mMdNTP、5μl10×PyrobestPCR缓冲液，以1μlL3区的有义引物[SEQIDNO.30](100μM)和1μl反义引物[SEQIDNO.31](100μM)、1μlDNA为模板，向其中加入0.5μlDNA聚合酶Pyrobest(5U/μl)，进行移液，完全混合，在以下条件下进行PCR。即在94℃加热处理5分钟，然后将94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒三步骤重复35次，再在72℃处理5分钟，终止反应。PCR结束后，使用1％琼脂糖凝胶，通过电泳确认目标基因区的扩增，可见在200bp附近的条带。(I-4)由1μlII型腺病毒基因组进行R1、2、3区的PCR。(PCR试剂盒采用宝酒造制造的产品，缓冲液·dNTP完全使用附属品)。首先，向36.5μl无菌蒸馏水中加入5μl2.5mMdNTP、5μl10×PyrobestPCR缓冲液，以1μlR1、2、3区的有义引物[SEQIDNO.32](100μM)和1μl反义引物[SEQIDNO.33](100μM)、1μlDNA为模板，向其中加入0.5μlDNA聚合酶Pyrobest(5U/μl)，进行移液，完全混合，在以下条件下进行PCR。即在98℃加热处理1分钟，然后将98℃5秒、55℃20秒、72℃15秒三步骤重复35次，再在72℃处理2分钟，终止反应。PCR结束后，使用1％琼脂糖凝胶，通过电泳确认目标基因区的扩增，可见在100bp附近的条带。(I-5)以1μlpCMVTnT(10ng/μl)为模板，进行CMV启动子区的PCR。(PCR试剂盒采用宝酒造制造的产品，缓冲液.dNTP·MgCl2完全使用附属品)。首先，向31.5μl无菌蒸馏水中加入5μl2.5mMdNTP、5μl25mMMgCl2、5μl10×LAPCR缓冲液，以1μlCMV启动子的有义引物[SEQIDNO.34](100μM)和1μl反义引物[SEQIDNO.35](100μM)、1μlDNA为模板，向其中加入0.5μlDNA聚合酶·LA-Taq(5U/μl)，进行移液，完全混合，在以下条件下进行PCR。即在94℃加热处理5分钟，然后将94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒三步骤重复35次，再在72℃处理5分钟，终止反应。PCR结束后，使用1％琼脂糖凝胶，通过电泳确认目标基因区的扩增，可见在650bp附近的条带。(I-6)向(I-1)的PCR反应液中加入5μl3MNaoAc和125μl100％乙醇，以14000rpm离心10分钟。离心结束后可见颗粒，静静地除去上清。向其中加入10μl1×DSB，使颗粒完全溶解。将该溶液全部加入1％琼脂糖凝胶中，以50mA进行25分钟电泳。与DNA标记比较，在40bp附近可见条带，回收该条带，在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟。将该离心上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为L1(提取浓度＝82ng/μl)。(I-7)向(I-2)的PCR反应液中加入5μl3MNaoAc和125μl100％乙醇，以14000rpm离心10分钟。离心结束后可见颗粒，静静地除去上清。向其中加入10μl1×DSB，使颗粒完全溶解。将该溶液全部加入1％琼脂糖凝胶中，以50mA进行25分钟电泳。与DNA标记比较，在70bp附近可见条带，回收该条带，在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟。将该离心上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为L2(提取浓度＝104ng/μl)。(I-8)向(I-3)的PCR反应液中加入5μl3MNaoAc和125μl100％乙醇，以14000rpm离心10分钟。离心结束后可见颗粒，静静地除去上清。向其中加入10μl1×DSB，使颗粒完全溶解。将该溶液全部加入1％琼脂糖凝胶中，以50mA进行25分钟电泳。与DNA标记比较，在200bp附近可见条带，回收该条带，在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟。将该离心上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为L3(提取浓度＝88ng/μl)。(I-9)向(I-4)的PCR反应液中加入5μl3MNaoAc和125μl100％乙醇，以14000rpm离心10分钟。离心结束后可见颗粒，静静地除去上清。向其中加入10μl1×DSB，使颗粒完全溶解。将该溶液全部加入1％琼脂糖凝胶中，以50mA进行25分钟电泳。与DNA标记比较，在100bp附近可见条带，回收该条带，在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟。将该离心上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为R123。(I-10)向(I-5)的PCR反应液中加入5μl3MNaoAc和125μl100％乙醇，以14000rpm离心10分钟。离心结束后可见颗粒，静静地除去上清。向其中加入10μl1×DSB，使颗粒完全溶解。将该溶液全部加入1％琼脂糖凝胶中，以50mA进行25分钟电泳。与DNA标记比较，在650bp附近可见条带，回收该条带，在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟。将该离心上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为PCMV(提取浓度＝54ng/μl)。(I-11)分别使用I-6、7、8的提取物进行L123区的PCR。(PCR试剂盒采用宝酒造制造的产品，缓冲液·dNTP·MgCl2完全使用附属品)。首先，向29.5μl无菌蒸馏水中加入5μl2.5mMdNTP、5μl25mMMgCl2、5μl10×LAPCR缓冲液，以1μlL1区的有义引物[SEQIDNO.26](100μM)和1μlL3区的反义引物[SEQIDNO.31](100μM)、DNA共3μl为模板，向其中加入0.5μlDNA聚合酶·LA-Taq(5U/μl)，进行移液，完全混合，在以下条件下进行PCR。即在94℃加热处理5分钟，然后将94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒三步骤重复35次，再在72℃处理5分钟，终止反应。PCR结束后，使用1％琼脂糖凝胶，通过电泳确认目标基因区的扩增，可见在300bp附近的条带。(I-12)向I-11的PCR反应液中加入5μl3MNaoAc和125μl100％乙醇，以14000rpm离心10分钟。离心结束后可见颗粒，静静地除去上清。向其中加入10μl1×DSB，使颗粒完全溶解。将该溶液全部加入1％琼脂糖凝胶中，以50mA进行25分钟电泳。与DNA标记比较，在300bp附近可见条带，回收该条带，在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟。将该离心上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为L123(提取浓度＝80ng/μl)。[SEQIDNO.42](I-13)使用I-9的提取物进行R123’取得PCR。(PCR试剂盒采用宝酒造制造的产品，缓冲液·dNTP完全使用附属品)。首先，向36.5μl无菌蒸馏水中加入5μl2.5mMdNTP、5μl10×PyrobestPCR缓冲液，以1μlR123区的有义引物[SEQIDNO.32](100μM)和1μl反义引物[SEQIDNO.36](100μM)、1μlDNA为模板，向其中加入0.5μlDNA聚合酶Pyrobest(5U/μl)，进行移液，完全混合，在以下条件下进行PCR。即在98℃加热处理1分钟，然后将98℃5秒、55℃20秒、72℃15秒三步骤重复35次，再在72℃处理2分钟，终止反应。PCR结束后，使用1％琼脂糖凝胶，通过电泳确认目标基因区的扩增，可见在150bp附近的条带。(I-14)向I-13的PCR反应液中加入5μl3MNaoAc和125μl100％乙醇，以14000rpm离心10分钟。离心结束后可见颗粒，静静地除去上清。向其中加入10μl1×DSB，使颗粒完全溶解。将该溶液全部加入1％琼脂糖凝胶中，以50mA进行25分钟电泳。与DNA标记比较，在150bp附近可见条带，回收该条带，在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟。将该离心上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为R123-1(提取浓度＝107ng/μl)。(I-15)使用I-14的提取物进行R123’区的PCR。(PCR试剂盒采用宝酒造制造的产品，缓冲液·dNTP完全使用附属品)。首先，向36.5μl无菌蒸馏水中加入5μl2.5mMdNTP、5μl10×PyrobestPCR缓冲液，以1μlR123区的有义引物[SEQIDNO.32](100μM)和1μl反义引物[SEQIDNO.37](100μM)、1μlDNA为模板，向其中加入0.5μlDNA聚合酶Pyrobest(5U/μl)，进行移液，完全混合，在以下条件下进行PCR。即在98℃加热处理1分钟，然后将98℃5秒、55℃20秒、72℃15秒三步骤重复35次，再在72℃处理2分钟，终止反应。PCR结束后，使用1％琼脂糖凝胶，通过电泳确认目标基因区的扩增，可见在150bp附近的条带。(I-16)向I-15的PCR反应液中加入5μl3MNaoAc和125μl100％乙醇，以14000rpm离心10分钟。离心结束后可见颗粒，静静地除去上清。向其中加入10μl1×DSB，使颗粒完全溶解。将该溶液全部加入1％琼脂糖凝胶中，以50mA进行25分钟电泳。与DNA标记比较，在150bp附近可见条带，回收该条带，在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟。将该离心上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为R123-2(提取浓度＝95ng/μl)。[SEQIDNO.43](I-17)将1μl来自I-12的PCR的提取物(提取浓度＝ng/μl)和1μlpT7Blue(Novagen公司·50ng/μl)混合。向其中加入等量的连接反应试剂盒ver.2溶液I(宝酒造株式会社)，在12℃进行2小时连接反应，然后得到大肠杆菌转化体。然后进行序列分析，选择没有碱基置换的质粒，以由此得到质粒为pT7B-L123。(I-18)将1μl来自I-16的PCR的提取物(提取浓度＝ng/μl)和1μlpT7Blue(Novagen公司·50ng/μl)混合。向其中加入等量的连接反应试剂盒ver.2溶液I(宝酒造株式会社)，在12℃进行2小时连接反应，然后得到大肠杆菌转化体。然后进行序列分析，选择没有碱基置换的质粒，以由此得到质粒为pT7B-R123。(I-19)将1μl来自I-10的PCR的提取物(提取浓度＝ng/μl)和1μlpT7Blue(Novagen公司·50ng/μl)混合。向其中加入等量的连接反应试剂盒ver.2溶液I(宝酒造株式会社)，在12℃进行2小时连接反应，然后得到大肠杆菌转化体。然后进行序列分析，选择没有碱基置换的质粒，以由此得到质粒为pT7B-CMV。(I-20)以I-17的pT7B-L123(10ng/μl)为模板，进行L123’区的PCR。(PCR试剂盒采用宝酒造制造的产品，缓冲液·dNTP完全使用附属品)。首先，向36.5μl无菌蒸馏水中加入5μl2.5mMdNTP、5μl10×PyrobestPCR缓冲液，以1μlL123区的有义引物[SEQIDNO.26](100μM)和1μl反义引物[SEQIDNO.38](100μM)、1μlDNA为模板，向其中加入0.5μlDNA聚合酶Pyrobest(5U/μl)，进行移液，完全混合，在以下条件下进行PCR。即在94℃加热处理5分钟，然后将98℃30秒、55℃30秒、72℃30秒三步骤重复35次，再在72℃处理5分钟，终止反应。PCR结束后，使用1％琼脂糖凝胶，通过电泳确认目标基因区的扩增，可见在300bp附近的条带。(I-21)以I-18的pT7B-R123(10ng/μl)为模板，进行R123-IgG3’区的PCR。(PCR试剂盒采用宝酒造制造的产品，缓冲液·dNTP完全使用附属品)。首先，向36.5μl无菌蒸馏水中加入5μl2.5mMdNTP、5μl10×PyrobestPCR缓冲液，以1μlR123区的有义引物[SEQIDNO.39](100μM)和1μl反义引物[SEQIDNO.40](100μM)、1μlDNA为模板，向其中加入0.5μlDNA聚合酶Pyrobest(5U/μl)，进行移液，完全混合，在以下条件下进行PCR。即在94℃加热处理5分钟，然后将95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒三步骤重复35次，再在72℃处理5分钟，终止反应。PCR结束后，使用1％琼脂糖凝胶，通过电泳确认目标基因区的扩增，可见在200bp附近的条带。(I-22)向I-20的PCR反应液中加入5μl3MNaoAc和125μl100％乙醇，以14000rpm离心10分钟。离心结束后可见颗粒，静静地除去上清。向其中加入10μl1×DSB，使颗粒完全溶解。将该溶液全部加入1％琼脂糖凝胶中，以50mA进行25分钟电泳。与DNA标记比较，在300bp附近可见条带，回收该条带，在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟。将该离心上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为L123-1(提取浓度＝87ng/μl)。[SEQIDNO.44](I-23)向I-21的PCR反应液中加入5μl3MNaoAc和125μl100％乙醇，以14000rpm离心10分钟。离心结束后可见颗粒，静静地除去上清。向其中加入10μl1×DSB，使颗粒完全溶解。将该溶液全部加入1％琼脂糖凝胶中，以50mA进行25分钟电泳。与DNA标记比较，在300bp附近可见条带，回收该条带，在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟。将该离心上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为R123-IgG3(提取浓度＝79ng/μl)。[SEQIDNO.45](I-24)分别使用1μlI-22、23的提取物进行L123-R123-IgG3’区的PCR。(PCR试剂盒采用宝酒造制造的产品，缓冲液·dNTP·MgCl2完全使用附属品)。首先，向29.5μl无菌蒸馏水中加入5μl2.5mMdNTP、5μl25mMMgCl2、5μl10×LAPCR缓冲液，以1μlL1区的有义引物[SEQIDNO.1](100μM)和1μlR123-IgG3’区的反义引物[SEQIDNO.15](100μM)、DNA共3μl为模板，向其中加入0.5μlDNA聚合酶·LA-Taq(5U/μl)，进行移液，完全混合，在以下条件下进行PCR。即在98℃加热处理1分钟，然后将98℃5秒、55℃20秒、72℃15秒三步骤重复35次，再在72℃处理2分钟，终止反应。PCR结束后，使用1％琼脂糖凝胶，通过电泳确认目标基因区的扩增，可见在500bp附近的条带。[SEQIDNO.46](I-25)向I-24的PCR反应液中加入5μl3MNaoAc和125μl100％乙醇，以14000rpm离心10分钟。离心结束后可见颗粒，静静地除去上清。向其中加入10μl1×DSB，使颗粒完全溶解。将该溶液全部加入1％琼脂糖凝胶中，以50mA进行25分钟电泳。与DNA标记比较，在500bp附近可见条带，回收该条带，在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟。将该离心上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为LR123(提取浓度＝56ng/μl)。(I-26)将1μl来自I-25的PCR的提取物(提取浓度＝ng/μl)和1μlpT7Blue(Novagen公司·50ng/μl)混合。向其中加入等量的连接反应试剂盒ver.2溶液I(宝酒造株式会社)，在12℃进行2小时连接反应，然后得到大肠杆菌转化体。然后进行序列分析，选择没有碱基置换的质粒，以由此得到质粒为pT7B-LR123。(I-27)使用2.5μg由I-25得到的质粒，在25℃用1μl限制酶(NEB公司)BamHI(20000U/ml)和1μlEcoRI(20000U/ml)进行O/N消化，切取LR123。限制酶处理后向1％琼脂糖凝胶中倒入1μl反应液，以50mA进行25分钟电泳，结果与DNA标记比较，在2800bp和400bp附近可见条带。再次向1％琼脂糖凝胶中倒入全部反应液，以50mA进行25分钟电泳，回收在400bp附近可见的条带。将回收的凝胶提取物在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟。该离心分离上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为LR123消化液(提取浓度＝16ng/μl)。(I-28)使用2.5μg由I-19得到的质粒，在25℃用1μl限制酶(NEB公司)HindIII(20000U/ml)和1μlBglII(10000U/ml)进行O/N消化，切取CMV启动子。限制酶处理后向1％琼脂糖凝胶中倒入1μl反应液，以50mA进行25分钟电泳，结果与DNA标记比较，在2800bp和650bp附近可见条带。再次向1％琼脂糖凝胶中倒入全部反应液，以50mA进行25分钟电泳，回收在650bp附近可见的条带。将回收的凝胶提取物在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟。该离心分离上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为CMV启动子消化液(提取浓度＝14ng/μl)。(I-29)使用2.5μgpCB，在25℃用1μl限制酶(NEB公司)HindIII(20000U/ml)和1μlNotI(10000U/ml)进行O/N消化。限制酶处理后向1％琼脂糖凝胶中倒入全部反应液，以50mA进行25分钟电泳，结果与DNA标记比较，在3500bp附近可见条带，回收该条带。将回收的凝胶提取物在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟左右。该离心分离上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为pCB消化液(提取浓度＝30ng/μl)。(I-30)将1μlI-29中得到的pCB消化液(30ng/μl)、1μlI-26中得到的LR123消化液(16ng/μl)、1μlI-27中得到的CMV启动子消化液(14ng/μl)混合，向其中加入等量(3μl)的连接反应试剂盒ver.2溶液I(宝酒造株式会社)，在16℃进行30分钟连接反应，然后进行大肠杆菌的转化，得到大肠杆菌转化体。由转化体得到的质粒为pCMV5。[SEQIDNO.47]实施例6pCMV5-萤光素酶的制备(图17)(II-1)使用2.5μgpCMV5，在25℃用1μl限制酶(NEB公司)NotI(10000U/ml)和1μlXbaI(20000U/ml)进行O/N消化。限制酶处理后向1％琼脂糖凝胶中倒入全部反应液，以50mA进行25分钟电泳，结果与DNA标记比较，在4000bp附近可见条带，回收该条带。将回收的凝胶提取物在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟左右。该离心分离上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为pCMV5消化液(提取浓度＝19ng/μl)。(II-2)使用2.5μgpCB-萤光素酶，在25℃用1μl限制酶(NEB公司)NotI(10000U/ml)和1μlXbaI(20000U/ml)进行O/N消化。限制酶处理后向1％琼脂糖凝胶中倒入全部反应液，以50mA进行25分钟电泳，结果与DNA标记比较，在3500bp和1600bp附近可见条带。再次将全部反应液倒入1％琼脂糖凝胶中，以50mA进行25分钟电泳，然后回收在1600bp附近可见的条带。将回收的凝胶提取物在-135℃冷冻10分钟。然后以14000rpm离心10分钟左右。该离心上清转移至新的1.5mlEppendorf管中。以该所得提取物为萤光素酶基因消化液(提取浓度＝27ng/μl)。[SEQIDNO.48](II-3)将1μlII-1中得到的pCMV5消化液(19ng/μl)、1μlII-2中得到的萤光素酶基因消化液(27ng/μl)混合，向其中加入等量(2μl)的连接反应试剂盒ver.2溶液I(宝酒造株式会社)，在16℃进行30分钟连接反应，然后进行大肠杆菌的转化，得到转化体。由转化体得到的质粒为pCMV5-萤光素酶。实施例7通过萤光素酶的测定进行CMV5启动子活性的测定(III-1)为了通过CHODG-44-S和HEK293RT测定CMV5启动子的活性，分别在25cm2培养瓶中培养。转染当天，将在25cm2培养瓶中培养的细胞用15ml离心管离心。离心后除去培养上清，向一组中加入5ml含有100mM次黄嘌呤、10mM胸腺啶的CHO-S-SFMII培养基(GIBCO公司制造)。向另一组中添加5mlFreeStyle培养基(GIBCO公司制造)。一起计测细胞数，然后分别向24孔板上添加细胞，使浓度分别为2.5×105细胞/孔。(III-2)分别将0.35ml培养基添加每孔61μl含有166ngDNA(pCMV50-萤光素酶)的转染试剂(QIAGEN公司制造)中，加到24孔板中，培养48小时。(III-3)48小时后，将细胞收集于1.5ml管中，除去上清。向其中添加100μlPLD-30(PickerGeneDualSeaPansy-试剂盒中所附试剂、东洋油墨制造株式会社)，轻轻搅拌后静置15分钟。15分钟后以200×g离心10分钟。将5μl离心上清加到195μlPLD-30试剂中，用荧光测定装置(ATTO公司；Luminescencer-PSN·R)进行荧光测定，可见CMV启动子的强活性。结果如图18所示。产业实用性本发明可提供以哺乳动物细胞为宿主，可高水准生产基因重组蛋白的表达载体。序列表<110>ImmunoJapanInc.<120>动物细胞用高表达载体<130>A41056A<160>51<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>1tttccgcggtttttccataggctccgc27<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>2tttatcgataggatcttcttgagatc26<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>3aagcttaaacgtacgaaagaattcaaaat29<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>4cgattttgaattctttcgtacgtttaagcttggcc35<210>5<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>5ctgcagaccatgggctaccatggcgatagctagac35<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>6tcctgcagttcattcagggc20<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>7ttaagcttcgatgtacgggccagatata28<210>8<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>8ttgcggccgccccgtcgacaatttcgataagccagttaa39<210>9<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>9ttgcggccgccttctagagcctcgactgtgccttct36<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>10ttggatcctccccagcatgcctgct25<210>11<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>11aatttcgtacgaagcttaaaggatccgaattcaacgtacgt41<210>12<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>12agctacgtacgttgaattcggatcctttaagcttcgtacga41<210>13<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>13tgcttaaagcggccgcttatctagaaccatgggctaccatg41<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>14taagctagctcagaagaactcgtcaag27<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>15ggtttatcgttgtgacttta20<210>16<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>16agcttaaagtcacaacgataaaccgc26<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>17gcggccgcttctagagcctcgactgtgcct30<210>18<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>18ttgctagctccccagcatgcctgct25<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>19tgctcgaggagaacttcagggtgagttt28<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述合成DNA<400>20tggcggccgccagcacgttgcccaggagc29<210>21<211>5019<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述质粒<400>23gcggccgcttctagagcctcgacdgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccc60tcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaat120gaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtgggg180caggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggagctagaacca240tgggctaccatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaatt300gccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggcttt360cttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgagg420atcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtgga480gaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgtt540ccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccct600gaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttg660cgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagt720gccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggc780tgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagc840gaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatga900tctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcg960catgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcat1020ggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccg1080ctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggc1140tgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttcta1200tcgccttcttgacgagttcttctgaggatctgcctcgactgtgccttctagttgccagcc1260atctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgt1320cctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattct1380ggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgc1440tggggaggatccttgaattcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactcc1500gcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaat1560tttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtg1620aggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctctgcagatggttcgaccattg1680aactgcatcgtcgccgtgtcccaaaatatggggattggcaagaacggagacctaccctgg1740cctccgctcaggaacgagttcaagtacttccaaagaatgaccacaacctcttcagtggaa1800ggtaaacagaatctggtgattatgggtaggaaaacctggttctccattcctgagaagaat1860cgacctttaaaggacagaat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因重组蛋白的高生产性。文档编号C12N5/06GK1771324SQ20048000939公开日2006年5月10日申请日期2004年2月3日优先权日2003年2月3日发明者冈部真人,中村彻雄申请人:日本免疫股份有限公司