专利名称：基因治疗用载体以及利用该基因治疗用载体在哺乳动物中或培养细胞中进行目的蛋白定 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及可以对在生物体内或培养细胞内生产的目的蛋白质进行简便定量的，用于在生物体内生产目的蛋白质的基因治疗用载体。
背景技术：
在患者体内生产目的蛋白质进行基因治疗时，目的蛋白质的血浓度只有在可以建立该蛋白质的ELISA法等测定方法时可以进行确定，在不能建立上述测定方法时不能进行确定。利用标记蛋白测定上述蛋白浓度的分析方法已实际应用并作为商品销售。但是，这种测定的灵敏度低，尚没有建立用于在基因治疗测定血液浓度的方法。参考文献(Treatment of Murine Lupus with cDNA encoding IFN-γR/Fc，TheJournal of Clinical Investigation，2000年7月，第106卷，第2期，p207-215)中通过不测定目的蛋白质而对受其影响的蛋白质定量化间接地证明了目的蛋白质的表达。显示出血液中浓度测定的难度。
发明的公开本发明的目的在于提供一种基因治疗用载体，其能够在进行基因治疗时高敏感度地监控目的蛋白质的血液中浓度，几乎不会引起由标记引起的不希望的生理作用以及抗原抗体反应。
本申请的发明人进行深入的研究结果发现，通过以整合了编码由通过基因治疗有待在体内生产的目的蛋白质和胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽的融合蛋白质的核酸的载体进行基因治疗，以上述胰高血糖素肽为标记可高敏感度地测定目的蛋白质的血液中浓度，并且发现几乎不会诱导由标记引起的不希望的生理作用以及抗原抗体反应，从而完成本发明。
换言之，本发明提供了一种基因治疗用载体，该载体具有如下结构在哺乳动物细胞用表达载体中整合了编码由胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽区域和有待在体内生产的目的蛋白质区域的融合蛋白质的核酸，其能够在哺乳动物细胞内生产前述融合蛋白质。此外，本发明提供了一种基因治疗方法，其包括将有效量的上述本发明的基因治疗用载体施用于有待上述目的蛋白质在体内或细胞内表达的哺乳动物或培养哺乳动物细胞。进而，本发明还提供了上述本发明的基因治疗用载体在制备基因治疗用药物中的用途。进而，本发明还提供了，通过前述基因治疗用载体的表达对体内或培养哺乳动物细胞内生产的目的蛋白质的定量方法，其包括对从施用了上述本发明的基因治疗用载体的哺乳动物或培养哺乳动物细胞中收集的被检试样中的C末端侧19-29个氨基酸肽区域进行免疫测定。进而，本发明还提供了在哺乳动物体内或培养哺乳动物细胞中由外部施用的表达载体的表达所生产的目的蛋白质的标记剂，其包含胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸的肽。进而，本发明还提供了一种体内或培养细胞内生产的蛋白质的标记方法，其包括通过以与作为标记剂的胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽的融合蛋白质形式表达由外部施用的表达载体产生的目的蛋白质，从而在哺乳动物体内或培养哺乳动物细胞内以胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽对体内或培养细胞内生产的目的肽进行标记。进而，本发明还提供了胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽作为在哺乳动物体内或培养哺乳动物细胞内由外部施用的表达载体产生的目的蛋白质的标记剂的用途。
通过本发明，首次提供了下述基因治疗用载体，其能够以高敏感度测定目的蛋白质的血液中浓度且其标记肽不具有生理作用。胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽由于其没有自体生理作用，在各种哺乳动物中十分保守，且基本不引起免疫反应，因此通过采用市售的免疫测定试剂盒的高敏感度地免疫测定可对其定量。
附图的简要说明
图1表示实施例1中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列。
图2是图1的续。
图3是图2的续。
图4表示实施例1-5中使用的用于哺乳动物表达的载体pCAGGS的基因图谱。
图5表示实施例1中施用基因治疗用载体后的天数与通过测定来自胰高血糖素的标记肽测定的目的蛋白质的血液中浓度之间的关系。
图6表示实施例1中测定的，在采用本发明的载体进行基因治疗时的目的蛋白质的血液中浓度，以及采用本发明的载体进行基因治疗时和采用插入了编码没有融合来自胰高血糖素的标记肽的目的蛋白质的核酸的载体进行基因治疗时的血糖值随时间的变化。
图7表示实施例2中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列的图。
图8是图7的续。
图9是图8的续。
图10表示实施例2中施用基因治疗用载体后的天数与通过测定来自胰高血糖素的标记肽测定的目的蛋白质的血液中浓度之间的关系。
图11表示实施例2和比较例2中，大鼠的移植心脏的附着生长天数。
图12表示实施例3中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列的图。
图13是图12的续。
图14是图13的续。
图15表示比较例3中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列的图。
图16是图15的续。
图17表示实施例3中施用基因治疗用载体后的天数与通过测定来自胰高血糖素的标记肽测定的目的蛋白质的血液中浓度之间的关系。
图18表示实施例3和比较例3中，大鼠的心肌炎病变部位的面积比率。
图19表示实施例4中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列的图。
图20是图19的续。
图21是图20的续。
图22表示实施例4中施用基因治疗用载体后的天数与通过测定来自胰高血糖素的标记肽测定的目的蛋白质的血液中浓度之间的关系。
图23表示实施例4和比较例4中，大鼠的心肌炎病变部位的面积比率。
图24表示实施例5中制备的插入基因治疗用载体中的插入核酸片段的碱基序列以及其编码的氨基酸序列的图。
图25表示实施例5中用于通过测定来自胰高血糖素的标记肽测定的目的蛋白质的血液中浓度，与通过人白介素8测定的目的蛋白质的血液中浓度之间的相互关系。
发明的最佳实施方式通过本发明的载体与目的蛋白质融合表达的所谓“胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽”是指从胰高血糖素的C末端算起从第19位至第29位的合计11个氨基酸构成的肽。即，该肽具有序列表的序列号1所示的氨基酸序列的肽。这个“胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽”作为目的蛋白质的标记使用，下面，方便起见称为“来自胰高血糖素的标记肽”。
本发明的载体中整合了编码来自胰高血糖素的标记肽区域与目的蛋白质区域的融合蛋白质的核酸。
本发明中使用的用于哺乳类动物的表达载体是基因治疗领域公知的，其没有限制只要是用于哺乳类动物的表达载体即可。本发明的特征在于作为目的蛋白质的标记的来自胰高血糖素的肽的区域与目的蛋白质相融合的形式表达，用于哺乳类细胞的表达载体没有任何限定，可以使用在基因治疗领域中使用的公知的任一用于哺乳类细胞的表达载体。可以是质粒载体也可以是病毒载体，从安全性角度考虑，优选使用质粒载体。各种用于哺乳类细胞的表达载体是众所周知的，此外也有市售的，可以优选使用这些周知的或市售的载体。周知或市售的载体的例子可列举为pCAGGS(Efficient selection for high expressiontransfactans with a novel eukaryotic vector，Gene 1991Dec.15，108(2)p193-199，基因图谱示于图4，其碱基序列示于序列表的序列号3)、PROMEGA公司的pCI载体、pSI载体和pTARGET载体以及INVITROGEN公司的pcDNA5/TO等，其不受上述限定。
通过基因治疗于体内生产的目的蛋白质没有任何限定，可举例为如干扰素、白介素和CTLA4之类的各种细胞因子、生长因子、胰岛素等激素和细胞粘着因子等及其受体。此外，任意的抗原蛋白质可通过基因疫苗形式在体内得以生产。此外，目的蛋白质本身也可以是融合蛋白质。例如，也可以在需要与Fc受体结合的所需的细胞因子的一端融合免疫球蛋白，优选IgG，尤其是IgG1的恒定区域(Fc)，以提高与Fc受体的结合能力的目的蛋白质(参照下述实施例1-4)。编码IgG的Fc区域的核酸的碱基序列是周知的，例如编码人的IgG的Fc区域的核酸的碱基序列记载于例如Genebank登录号BC020823等处，编码大鼠的IgG的Fc区域的核酸的碱基序列示于本申请的图1-3等中。
本发明的载体通过在哺乳动物细胞用表达载体的克隆位点处插入编码目的蛋白质与上述标记肽的融合蛋白质的核酸获得。并且，标记肽优选融合于目的蛋白质的一端尤其是C末端。
基因治疗可通过将本发明的基因治疗用载体施用于哺乳动物来进行。施用途径优选静脉注射或肌肉注射之类的非经口腔施用途径。载体的施用量可根据目的蛋白质的性质、有待治疗的疾病的种类和程度等进行相应设定，每1kg体重的载体施用量通常是1mg-10mg左右，优选2mg-4mg左右。作为制剂，可以使用例如溶解于林格氏(ringer)溶液中的基因治疗用载体溶液作为注射液。可以在其中添加医药制剂领域中周知的注射用添加剂。或者，也可以将本发明的基因治疗用载体施用于体外培养的哺乳动物细胞。即，将淋巴细胞或骨髓细胞等细胞取出进行体外培养，对培养细胞施以基因载体，再以获得具有目的蛋白质生产能力的细胞对患者进行的基因治疗，本发明的基因治疗用载体也可施用于培养哺乳动物细胞。或者，可在体外研究基因治疗用载体的治疗效果的实验中施用培养的哺乳动物细胞。
在基因治疗中，通过向体内导入的载体生产上述目的蛋白质与来自胰高血糖素的标记肽的融合蛋白质。另外，对体外培养的哺乳动物细胞施用基因治疗用载体时，该培养细胞内生产出上述目的蛋白质与来自胰高血糖素的标记肽的融合蛋白质。由于目的蛋白质与标记肽融合，可以通过测定来自胰高血糖素的标记肽的浓度来测定目的蛋白质的浓度。并且，由于免疫测定本发明中使用的来自胰高血糖素的标记肽的试剂盒是市售的(DAICHI RADIOISOTOPELABORATORIES，公司等制备的胰高血糖素RIA试剂盒)，可以使用这种市售免疫测定试剂盒容易地进行测定。
定量来自胰高血糖素的标记肽的被检试样是来自施用了本发明的基因治疗用载体的个体的各种体液或组织等或其稀释物，优选是全血，血清或血浆或其稀释物等血液试样。此外是，基因治疗用载体施用于体外培养的哺乳动物的情况下，被检试样是培养细胞的匀浆或培养上清液等。
实施例1、比较例1以经凝集素刺激的大鼠的脾培养细胞的cDNA为模板，用5’-gagaattcatttaaatgagagcggccgccgtgcccagaaactgtg-3’，5’-tcaaccactgcacaaaatcttgggctttacccggagagtgggagagact-3’作为引物进行PCR，进而用以该PCR产物的300倍稀释物为模板，用5’-gagaattcatttaaatgagagcggccgccgtgcccagaaactgtg-3’，5’-gagagagagaattctcaggtattcatcaaccactgcacaaaatcttgggc-3’作为引物进行PCR，用EcoR I将扩增产物整合入用于哺乳类细胞的表达载体pCAGGS的克隆位点。通过这些步骤，获得插入Swa I和Not I的限制性酶切位点的pCAGGS-IgG-glu19-29(在免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc区域的编码区域的下游，结合编码来自胰高血糖素的标记肽的区域的核酸片段插入pCAGGS的EcoR I部位)。
下面，以大鼠心肌炎的心脏的cDNA为模板，用5’-gagaattcatttaaatgattctgctggtggtcctgatg-3’，5’-gcagcatcgcggccgcttcttctctgtcatcatggagaaa-3’作为引物进行PCR，用Swa I和NotI将PCR产物整合入前面制备的pCAGGS-IgG-glu19-29中。
通过这些步骤，在上述用于哺乳类细胞的表达载体pCAGGS的EcoR I位点插入具有序列表的序列号2所示的碱基序列(显示含有限制性酶切位点)的DNA片段，制备出本发明的载体(实施例1)。并且，图1-图3还显示了序列号2的其它信息。如图1至图3所示，插入的核酸片段为，在两端都有EcoR I位点的，且位于编码干扰素γ受体(IFNγR)蛋白质与免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc区域的融合蛋白质的区域的下游，结合编码来自胰高血糖素的标记肽的区域的核酸片段(IFNγR-IgG-胰高血糖素19-29)。
对7只大鼠每一只的尾静脉注射不含来自胰高血糖素的标记肽的质粒载体(比较例1)和以上述方式制备的含有来自胰高血糖素的标记肽的本发明的质粒载体(实施例1)，进行基因治疗。注射液的组成是在20ml的林格氏溶液中溶解了800μg的质粒每只。注射后，随时间推移采血，将采血获得的1-10μl的血浆稀释100-1000倍，用市售的RIA试剂盒，按照该试剂盒附带的说明书测定来自胰高血糖素的标记肽的浓度，进而测定目的蛋白质(本实施例中是IFNγR/IgG1Fc融合蛋白质)的浓度。即，RIA具体是按以下方式进行。在400μl检测用缓冲液中添加200μl标准胰高血糖素溶液或稀释的被检血浆，进而添加100μl胰高血糖素-125I溶液，添加100μl胰高血糖素抗血清，4℃下放置48小时。之后，添加100μl第二抗体，400μl胰高血糖素RIA用沉淀稳定剂，4℃下放置30分钟，离心分离(2000×g30分钟，4℃)后，除去上清液后测定计数率求出浓度。
图5是血液中浓度的测定结果。实施例1中，静脉注射后第1天结果为2870±1062ng/ml(平均±标准偏差)，第3天为1440±334ng/ml，第7天为1120±433ng/ml，第16天为281±162ng/ml，所有的例子均可被测定。另一方面，用不含来自胰高血糖素的标记肽的质粒载体的基因治疗中，以同样方式检测，其结果低于检测限。
图6是质粒静脉注射4，8，12小时后的血糖值和以上述同样方式用RIA测定法检测的蛋白血液中浓度的值。实施例1中，血糖浓度4小时后显示为2815±2318ng/ml，8小时后为6061±2789ng/ml，12小时后为5752±2270ng/ml，显示出最大血液中浓度的8-12小时后的血糖为8小时后89.3±15.1mg/dl(实施例1)vs 81.8±7.5mg/dl(比较例1)，12小时后63.5±5.7mg/dl(实施例1)vs 71.4±6.9mg/dl(比较例1)，没有差异。
从以上结果表明，通过使用本发明的载体，能够在施用载体的数十天后，从极少量的血浆样品中足以测定出目的蛋白质的血液中浓度。
实施例2、比较例2以经凝集素刺激的大鼠的脾培养细胞的cDNA为模板，用5’-gagaattcatttaaatggcttgtcttggactccagagg-3’，5’-gcagcatcgcggccgcgtctgaatctgggcatggttctgg-3’作为引物进行PCR，用Swa I和Not I将PCR扩增产物整合到按实施例1所述的方法制备的pCAGGS-IgG-glu19-29中。
通过这些步骤，制备出在上述用于哺乳类细胞的表达载体pCAGGS的EcoR I位点插入具有图7至9以及序列号4所示的碱基序列(显示含有限制性酶切位点)的大鼠CTLA4-IgG-胰高血糖素19-29(在大鼠CTLA4编码区域的下游结合大鼠IgG Fc编码区域，其下游结合来自胰高血糖素的标记肽编码区域的核酸片段)，在大鼠细胞中表达CTLA4-IgG-胰高血糖素19-29的重组载体(实施例2)。为了比较，制备了插入有不含CTLA4编码区域仅插入IgG-胰高血糖素19-29编码区域的重组载体(比较例2)。
对心脏移植后的大鼠以与实施例1同样方式施用重组载体，测定血液中浓度。同时，研究移植心脏的附着生长天数。
结果示于图10和图11中。如图10所示，实施例2中，CTLA4-IgG-胰高血糖素19-29蛋白的变化如图7所示。就是说，尽管在100倍稀释物中无法测定胰高血糖素之前的值，但一天后急剧上升，显示出超过5000ng/ml的蛋白浓度，尽管这之后缓慢下降，仍然呈现出超过1000ng/ml的蛋白浓度直至为检测进行宰杀后的第105天后。此外，如图11所示，实施例2中，10只中有1只在14天时被排斥，直至检测的第105天剩下的9只都附着生长。用不含CTLA4的pCAGGS-SP-IgG-glu19-29治疗的组中(实施例2)，5只中有1只在第5天时，1只在第6天时，3只在第7天时被排斥，这些显著地显示出pCAGGS-CTLA4-IgG-glu19-29治疗的有效性。
实施例3、比较例3以经凝集素刺激的大鼠的脾培养细胞的cDNA为模板，用5’-gagaattcatttaaatggcactctgggtgactgcagtc-3’，5’-gcagcatcgcggccgcgtggccatagcggaaaagttgctt-3’作为引物进行PCR，用Swa I和NotI将PCR扩增产物整合到按实施例1所述的方法制备的pCAGGS-IgG-glu19-29中。
通过这些步骤，制备出在上述用于哺乳类细胞的表达载体pCAGGS的EcoR I位点插入具有图12至14以及序列号5所示的碱基序列(显示含有限制性酶切位点)的大鼠IL13-IgG-胰高血糖素19-29(在大鼠白介素13(IL13)编码区域的下游结合大鼠IgG Fc编码区域，其下游结合来自胰高血糖素的标记肽编码区域的核酸片段)，在大鼠细胞中表达IL13-IgG-胰高血糖素19-29的重组载体(实施例3)。为了比较，制备了插入有不含IL13编码区域的仅插入有SP-IgG-胰高血糖素19-29编码区域(序列表序列号6及图15和图16)的重组载体(比较例3)。
对自身免疫性心肌炎大鼠(A novel experimental model of giant cellmyocarditis induced in rats by immunization with cardiac myosinfraction.Clinical immunology and immunopathology，1990年11月，第57卷，p250-262)，按与实施例1同样方式施用重组载体，测定血液中浓度。同时，在施用16后宰杀，解剖，研究心肌炎病变部位的病变面积率。
结果示于图17和图18中。IL13-IgG-胰高血糖素19-29蛋白的变化如图17所示。换句话说，第1天时呈现超过2000ng/ml的蛋白浓度，尽管这之后缓慢下降，仍然呈现出约8ng/ml的蛋白浓度直至检测的宰杀后的第16天后。此外，如图18所示，施用本发明基因治疗用载体pCAGGS-IL13-IgG-glu19-29(插入IL13-IgG-glu19-29的载体pCAGGS)的组，与施用不含IL13的pCAGGS-SP-IgG-glu19-29的组相比，心肌炎病变部位的面积明显更小，显示出了pCAGGS-IL13-IgG-glu19-29治疗的有效性。
实施例4、比较例4以经凝集素刺激的大鼠的脾培养细胞的cDNA为模板，用5’-gagaattcatttaaatggaaatctgctggggaccctac-3’，5’-gcagcatcgcggccgcttggtcttcctggaagtagaactt-3’作为引物进行PCR，用Swa I和Not I将PCR扩增产物整合到按实施例1所述的方法制备的pCAGGS-IgG-glu19-29中。
通过这些步骤，制备出在上述用于哺乳类细胞的表达载体pCAGGS的EcoR I位点插入具有图19至21以及序列号7所示的碱基序列(显示含有限制性酶切位点)的大鼠IL1RA-IgG-胰高血糖素19-29(在大鼠白介素1受体拮抗剂编码区域的下游结合大鼠IgG Fc编码区域，其下游结合来自胰高血糖素的标记肽编码区域的核酸片段)，在大鼠细胞中表达IL1RA-IgG-胰高血糖素19-29的重组载体(实施例4)。
对自身免疫性心肌炎大鼠(A novel experimental model of giant cellmyocarditis induced in rats by immunization with cardiac myosinfraction.Clinical immunology and immunopathology，1990年11月，第57卷，p250-262)，按与实施例1同样方式施用重组载体，测定血液中浓度。同时，在施用16后宰杀，解剖，研究心肌炎病变部位的病变面积率。为了比较，施用比较例3的载体(比较例4)。
结果示于图22和图23中。如图22所示，实施例4中，IL1RA-IgG-胰高血糖素19-29蛋白的变化如图22所示。就是说，第1天时呈现超过2000ng/ml的蛋白浓度，尽管这之后缓慢下降，呈现出约20ng/ml的蛋白浓度直至为检测进行宰杀后的第16天后。此外，如图23所示，实施例4与比较例4相比，心肌炎病变部位的面积明显更小，显示出了pCAGGS-IL1RA-IgG-glu19-29治疗的有效性。
实施例5为了制备插入Swa I和Not I的限制性酶切位点的pCAGGS-glu19-29，以5’-gagaattcatttaaatgagagcggccgccccgggtaaagcccaagattttgtgcagtggttg-3’，5’-gagagagagaattctcaggtattcatcaaccactgcacaaaatcttgggc-3’作为引物进行PCR，用EcoR I整合入pCAGGS的克隆位点。
接着，以Cos7细胞的cDNA为模板，以5’-gagaattcatttaaatgacttccaagctggccgtggct-3’，5’-gcagcatcgcggccgctgaattctcagccctcttcaaaaa-3’作为引物进行PCR，用Swa I和Not I将这些PCR产物整合入前面制备的pCAGGS-glu19-29中。
通过这些步骤，制备出在上述用于哺乳类细胞的表达载体pCAGGS的EcoR I位点插入具有图24以及序列号8所示的碱基序列(显示含有限制性酶切位点)的人IL8-胰高血糖素19-29(在人白介素8编码区域的下游结合来自胰高血糖素的标记肽编码区域的核酸片段)，在大鼠细胞中表达IL8-胰高血糖素19-29的重组载体(实施例5)。
对大鼠，按与实施例1同样方式施用重组载体，1天后采血，测定血液中浓度。同时，定量相同试样中人IL-8的浓度。人IL-8的浓度的定量采用BIOSOURSE公司(Nivelles，Belgium)制造的IL-8EASIA试剂盒按照其说明书进行。
结果示于图25中。如图25所示，两者的摩尔浓度大致相同，这证明了用胰高血糖素19-29标记肽的方法的正确性。
序列表<110>NIIGATA TLO CORPORATION<120>基因治疗用载体以及利用该基因治疗用载体在哺乳动物中或培养细胞中进行目的蛋白定量的方法<130>03PF275-PCT<150>JP 2003-3967<151>2003-01-10<160>24<210>1<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>编码人，小鼠或大鼠胰高血糖素C19-29区域的寡肽<400>1Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr1 5 10<210>2<211>1471<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(13)..(1461)<223>编码大鼠IFN-r受体，大鼠IgG Fc区域和胰高血糖素C19-29区域的DNA插入物<400>2gaattcatttaa atg att ctg ctg gtg gtc ctg atg ctg tct gcg gag atc51Met Ile Leu Leu Val Val Leu Met Leu Ser Ala Glu Ile1 5 10ggg agt gga gct ttg atg agc acc gag gat cct aag ccg ccc tcg gtg 99Gly Ser Gly Ala Leu Met Ser Thr Glu Asp Pro Lys Pro Pro Ser Val
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<221>CDS<222>(13)..(1275)<223>编码大鼠IL1受体拮抗剂，大鼠IgG Fc区域和胰高血糖素C19-29区域的DNA插入物<400>7gaattcatttaa atg gaa atc tgc tgg gga ccc tac agt cac cta atc tct51Met Glu Ile Cys Trp Gly Pro Tyr Ser His Leu Ile Ser1 5 10ctc ctt ctc atc ctt ctg ttt cat tca gag gca gcc tgc cgc cct tct 99Leu Leu Leu Ile Leu Leu Phe His Ser Glu Ala Ala Cys Arg Pro Ser15 20 25ggg aaa aga ccc tgc aag atg caa gcc ttc aga atc tgg gat act aac147Gly Lys Arg Pro Cys Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Thr Asn30 35 40 45cag aag acc ttt tac ctg aga aac aac cag ctc att gct ggg tac tta195Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Ile Ala Gly Tyr Leu
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400 405 410ttt gtg cag tgg ttg atg aat acc tgagaattc 1284Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr415 420<210>8<211>369<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(13)..(360)<223>编码人IL8和胰高血糖素C19-29区域的DNA插入物<400>8gaattcattt aa atg act tcc aag ctg gcc gtg gct ctc ttg gca gcc ttc 51Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe1 5 10ctg att tct gca gct ctg tgt gaa ggt gca gtt ttg cca agg agt gct99Leu Ile Ser Ala Ala Leu Cys Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala15 20 25aaa gaa ctt aga tgt cag tgc ata aag aca tac tcc aaa cct ttc cac147Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His30 35 40 45ccc aaa ttt atc aaa gaa ctg aga gtg att gag agt gga cca cac tgc195Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys50 55 60gcc aac aca gaa att att gta aag ctt tct gat gga aga gag ctc tgt243Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys65 70 75ctg gac ccc aag gaa aac tgg gtg cag agg gtt gtg gag aag ttt ttg291Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu80 85 90aag agg gct gag aat tca gcg gcc gcc ccg ggt aaa gcc caa gat ttt339Lys Arg Ala Glu Asn Ser Ala Ala Ala Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe
95 100 105gtg cag tgg ttg atg aat acc tgagaattc 369Val Gln Trp Leu Met Asn Thr110 115<210>9<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物<400>9gagaattcat ttaaatgaga gcggccgccg tgcccagaaa ctgtg45<210>10<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物<400>10tcaaccactg cacaaaatct tgggctttac ccggagagtg ggagagact49<210>11<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物<400>11gagaattcat ttaaatgaga gcggccgccg tgcccagaaa ctgtg 45<210>12<211>50<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物<400>12gagagagaga attctcaggt attcatcaac cactgcacaa aatcttgggc 50<210>13<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IFN-rR-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物<400>13gagaattcat ttaaatgatt ctgctggtgg tcctgatg38<210>14<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IFN-rR-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物<400>14gcagcatcgcggccgcttct tctctgtcat catggagaaa 40<210>15<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-CTLA4-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物<400>15gagaattcatttaaatggct tgtcttggac tccagagg 38<210>16<211>40<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-CTLA4-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物<400>16gcagcatcgc ggccgcgtct gaatctgggc atggttctgg 40<210>17<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IL13-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物<400>17gagaattcat ttaaatggca ctctgggtga ctgcagtc38<210>18<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IL13-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物<400>18gcagcatcgc ggccgcgtgg ccatagcgga aaagttgctt 40<210>19<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IL1RA-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物<400>19gagaattcat ttaaatggaa atctgctggg gaccctac38<210>20<211>40<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IL1RA-IgG-glu19-29的寡核苷酸引物<400>20gcagcatcgc ggccgcttgg tcttcctgga agtagaactt 40<210>21<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-glu19-29的寡核苷酸引物<400>21gagaattcat ttaaatgaga gcggccgccc cgggtaaagc ccaagatttt gtgcagtggt 60tg 62<210>22<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-glu19-29的寡核苷酸引物<400>22gagagagaga attctcaggt attcatcaac cactgcacaa aatcttgggc 50<210>23<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IL8-glu19-29的寡核苷酸引物<400>23gagaattcat ttaaatgact tccaagctgg ccgtggct38<210>24<211>40<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>用于构建载体pCAGGS-IL8-glu19-29的寡核苷酸引物<400>24gcagcatcgc ggccgctgaa ttctcagccc tcttcaaaaa 40
权利要求
1.一种基因治疗用载体，其特征在于，该载体具有在哺乳动物细胞用表达载体中整合了编码下述融合蛋白质的核酸的结构，并能够在哺乳动物细胞中生产上述融合蛋白质，所述融合蛋白质是胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽区域和有待在体内生产的目的蛋白质区域相融合形成的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的载体，其中，所述胰高血糖素C末端侧19-29个氨基酸肽区域结合于所述目的蛋白质区域的C末端。
3.根据权利要求1或2所述的载体，其中，所述目的蛋白质为细胞因子或对细胞因子附加了免疫球蛋白恒定区的融合蛋白质、生长因子、激素或细胞粘着因子或其受体。
4.根据权利要求3所述的载体，其中，所述细胞因子或其受体选自干扰素及其受体、CTLA4、白介素及其受体。
5.一种基因治疗方法，其包括向有待上述目的蛋白质在体内或细胞内表达的哺乳动物或培养哺乳动物细胞中，施用有效量的权利要求1至4中任一项所述的基因治疗用载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，将所述基因治疗用载体施用于哺乳动物。
7.权利要求1至4任一项中所述的基因治疗用载体在制备基因治疗用药物中的用途。
8.通过前述基因治疗用载体的表达对体内或培养哺乳动物细胞内生产的目的蛋白质进行定量的方法，其包括对从施用了权利要求1至4中任一项所述的基因治疗用载体的哺乳动物或培养哺乳动物细胞收集的被检试样中的胰高血糖素C末端侧19-29个氨基酸的肽区域进行免疫测定。
9.根据权利要求8所述的方法，所述被检试样是从施用了前述基因治疗用载体的哺乳动物收集的。
10.根据权利要求9所述的方法，所述被检试样是血液试样。
11.哺乳动物体内或培养哺乳动物细胞中由外部施用的表达载体的表达所生产的目的蛋白质的标记剂，该标记剂包含胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸的肽。
12.哺乳动物体内由外部施用的表达载体的表达所生产的目的蛋白质标记剂，其包含胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸的肽。
13.一种体内或培养细胞内生产的蛋白质的标记方法，其包括在哺乳动物体内或培养哺乳动物细胞内，以与作为标记剂的胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸的肽的融合蛋白质形式，表达由外部施用的表达载体产生的目的蛋白质，从而以胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽对体内或培养细胞内生产的目的肽进行标记。
14.根据权利要求13所述的方法，其包括在哺乳动物体内以与作为标记剂的胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽的融合蛋白质形式，表达由外部施用的表达载体产生的目的蛋白质，从而以胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽对体内生产的目的肽进行标记。
15.胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽作为在哺乳动物体内或培养哺乳动物细胞内由外部施用的表达载体产生的目的蛋白质的标记剂的用途。
16.胰高血糖素的C末端侧19-29个氨基酸肽作为在哺乳动物体内由外部施用的表达载体产生的目的蛋白质的标记剂的用途。
全文摘要
本发明公开了一种基因治疗用载体，其能够在进行基因治疗时以更高敏感度监控目的蛋白质的血液中浓度，并且标记肽不具有生理作用而在多种动物中无免疫原性。基因治疗用载体具有如下结构在哺乳动物细胞用表达载体中整合了编码由胰高血糖素的C末端侧19－29个氨基酸肽区域和有待在体内生产的目的蛋白质区域的融合蛋白质的核酸。
文档编号G01N33/53GK1758924SQ20038011015
公开日2006年4月12日 申请日期2003年12月26日 优先权日2003年1月10日
发明者塙晴雄 申请人:株式会社新潟Tlo