专利名称：抗肿瘤多肽及其基因治疗载体组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的病毒载体介导的抗肿瘤基因治疗组合物，具有靶向性抗肿瘤组织中血管新生作用，从而抑制肿瘤的生长和转移。更具体地说，涉及一种含53个氨基酸多肽(简称p53)的基因重组逆转录病毒载体及其改构体的制备及体内外应用。
实体肿瘤组织中的新生血管是维持肿瘤细胞新陈代谢的重要保障，是肿瘤生长和转移不可缺少的条件之一。由于肿瘤的生长是血管依赖性的，因此，通过抑制肿瘤组织内的血管新生，而切断肿瘤营养供应，就能达到抗肿瘤的目的。目前，肿瘤的治疗常常是采用长期的联合化疗和放疗，全身治疗不仅存在药物抵抗问题，而且会给患者带来诸多严重的、甚至是致死的副作用。近年研究显示，将携带抗血管新生因子基因序列的病毒或非病毒载体，靶向性导入肿瘤组织或周围正常组织，可通过旁分泌作用机制，在肿瘤局部产生高浓度的血管新生抑制因子，发挥选择性抑制血管新生而达到抑制肿瘤生长的目的。动物实验证明，对多种血管新生有抑制作用的基因或基因片段，如血栓敏感蛋白，血管内皮生长因子(VEGF)受体结构域突变体(flk-1)，血管抑素(angiostatin)，内皮抑素(endostatin)和尿激酶氨基末端片段(ATF)等，均具有显著的抑制肿瘤生长作用。另外，针对成纤维细胞生长因子(FGF)和VEGF的反义技术(antisensetechnology)和/或Ribozymes技术，亦可有效降低肿瘤局部FGF和VEGF因子的表达，发挥有效的抗肿瘤作用。综上所述，抗血管新生的基因疗法治疗肿瘤以其靶向性、局部高浓度、避免肿瘤细胞的耐药及最大程度的减少药物的毒副作用等优点，有望成为诸多抗肿瘤治疗方法中最有前途的方法之一。
本发明之目的是要寻找一种有效的抗肿瘤血管新生的基因靶向药物，以克服当前肿瘤临床治疗中存在的毒副作用大、耐药性强和效果差等缺点。具体地讲，目的之一在于提供一种能抑制肿瘤生长和转移的p53肽因子，以及以p53肽基因所构建的病毒载体作为基因治疗组合物；目的之二在于根据已知的p53肽核苷酸序列，通过PCR扩增与突变的方法，克隆及改构一套p53肽类组合物，建立p53肽及其改构多肽的基因病毒、细菌和细胞载体系统，筛选和生产有活性的重组人p53肽及其病毒载体(图3)。
本发明的内容与要点涉及一种含53个氨基酸的抗肿瘤多肽(简称p53肽)，以及用p53肽的基因所构建的病毒载体。为了探讨p53肽在治疗实体瘤中的作用及其机制，本发明构建了p53重组逆转录病毒载体，建立了表达分泌型重组p53人头颈部肿瘤KB细胞系和相应的裸鼠实体瘤动物模型。研究结果证实了逆转录病毒介导的p53有抑制肿瘤血管新生及抗肿瘤的作用。
本发明所描述的p53肽的序列见图1。在实施中，根据已知序列，设计了引物进行PCR扩增，扩增载体外源基因的引物序列上游引物5’-CCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC-3’，下游引物5’-GAGCCTGGGGACTTTCCACACCC-3’。用相同引物对基因组DNA进行PCR扩增。扩增后获得一系列基因片段，其中p53肽基因序列见图2。
将p53肽cDNA与信号肽cDNA连接。藉EcoRⅠ和BamHⅠ位点将含有信号肽的p53 cDNA序列重组于pLXSN/neo中，得到pLXSNp52重组逆转录病毒载体。以pLXSNp53为模板，PCR扩增外源基因p53,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，低熔点胶纯化回收相应条带，酶切后克隆到经相同双酶切的质粒载体M13mp19RF中，转化大肠杆菌JM109，挑取无色噬斑扩增培养后，提取双链DNA进行酶谱分析，提取单链DNA进行双脱氧法DNA序列测定。测序鉴定后，按QIAGEN PlasmidPurification试剂盒说明操作，纯化pLXSN-p52备转染包装细胞系PA317。进一步按lipofecTAMINE TM试剂盒(GIBCOBRL)说明操作，将pLXSN-neo和pLXSNp53分别导入PA317细胞，G418(GIBCOBRL)筛选，收集G418阳性克隆(PA317-neo和PA317-p53)，分别用PA317-neo和PA317-p52培养液上清与NIH3T3共育，G418筛选，计算病毒滴度。分别用PA317-neo和PA317-p53上清与KB细胞共育，G418筛选，收集G418阳性克隆(KB-neo,KB-PF4,KB-p53)，分别混合培养PA317 G418阳性克隆和KB G418阳性克隆，进行鉴定和体内外活性测定。
本发明经过上述过程克隆p53肽基因，构建重组逆转录病毒载体，转染PA317包装细胞系得到病毒上清，用病毒上清感染人头颈部癌KB细胞，并用PCR、RT-PCR和Western blotting方法分析证明导入的目的基因与KB细胞基因组发生了整合，获得了稳定表达重组p53的KB细胞株，并在体外细胞培养水平和体内裸鼠移植瘤水平进行了多参数研究。实验证明(1)逆转录病毒载体介导的p53基因的导入不影响KB肿瘤细胞的生长；(2)转染的PA317-p53细胞和KB-p53细胞的培养液可显著地抑制内皮细胞的增殖；(3)裸鼠移植瘤实验观察到实验组移植瘤生长速度明显缓慢，荷瘤鼠生存时间明显延长，移植瘤中新生血管的密度明显降低。结果证实逆转录病毒载体介导的p53肽基因具有抑制血管内皮细胞体外增殖，继而抑制体内肿瘤生长的作用。
本发明的目的之一在于提供一种能抑制肿瘤生长和转移的p53肽因子，以及以p53肽基因所构建的病毒栽体作为基因治疗组合物。
本发明的目的之二在于根据已知p53肽核苷酸序列，通过PCR扩增与突变的方法，克隆及改构一套p53肽类组合物，建立p53肽及其改构多肽的基因病毒、细菌和细胞栽体系统，筛选和生产有活性的重组人p53肽及其基因病毒栽体。
实施例1，病毒滴度测定、重组逆转录病毒载体整合效果鉴定和Westernblotting分析分别将KB-neo、KB-p53和野型KB细胞在完全培养液中生长。在生长良好时用新鲜完全培养液制备细胞悬液，计数。分别以2×104/ml接种于6孔板和96孔板中，每天各取6孔板中的3孔细胞进行计数，共6天。MTT方法分别在培养0,24,48,72,96,120小时时，加入MTT(Sigma产品)，孵育5小时后，加入DMSO(Sigma产品)，波长570nm测定吸光度。
分别将KB-neo、KB-p53和野型KB三种KB细胞在完全培养液中生长。在生长良好时用新鲜完全培养液制备细胞悬液，计数。分别按200/孔接种于6孔板，大约两周后计数含有大于50个细胞的集落数。PA317-neo和PA317-p53培养液上清分别与NIH3T3共育，测定的病毒滴度为5×106-8×106CFU/ml。
分别提取转染的包装细胞PA317及转染的KB细胞的基因组DNA和细胞总RNA，用PCR和RT-PCR方法鉴定外源基因的整合与mRNA表达情况。提取的总RNA经电泳鉴定，28S与18S条带清晰(结果略)，用pLXSN多克隆位点两侧引物，PCR和RT-PCR扩增，结果在PA317-neo和PA317-p53，以及KB-neo和KB-p53细胞中检测到目的带空载体-139bp,p53-389bp，野型KB细胞和野型PA317细胞中未见特异带。说明重组逆转录病毒载体经脂质体介导已成功地整合于KB细胞基因组中。
Western blotting分析结果在KB-p53培养液上清中分别检测到分子量为24kDa的蛋白，说明有分泌型p53肽的表达。
实施例2,p53肽cDNA转染体外对肿瘤细胞和血管内皮细胞生长的影响首先测定转染的PA317病毒上清和转染的KB细胞上清作用下HUVE细胞及野型KB细胞的生长曲线。具体地说，将HUVE细胞及野型KB细胞(1×104-2×104/m1)接种于96孔板中。同时分别将PA317-neo和PA317-p53细胞在培养液中生长，在生长达到80％汇片时换用新鲜的不含有G418的培养液，24小时后收集培养液，0.45μm滤膜过滤细胞碎片，加入HUVE细胞及野型KB细胞的培养液中，继续培养2-3个细胞生长周期。MTT方法测定发现，KB-p53细胞组分别与野型KB细胞和KB-neo细胞比较细胞生长曲线无差异。PA317-p53与PA317-neo相比对HUVE细胞增殖有抑制作用(图4)。
其次测定转染的KB细胞培养液作用下HUVE细胞及野型KB细胞的生长曲线。其方法是接种HUVE细胞及野型KB细胞(1×104-2×104/m1)于96孔板中。分别使KB-neo和KB-p53细胞在培养液中生长，在生长达到80％汇片时换用新鲜的不含有G418的完全培养液，24小时收集培养液，0.45μm滤膜过滤细胞碎片，加入HUVE细胞及野型KB细胞的培养液中，继续培养2-3个细胞生长周期。结果证实，KB-neo和KB-p53培养液上清对HUVE及野型KB细胞生长的影响与PA317-neo和PA317-p53病毒上清的作用一致。
实施例3。p53肽cDNA转染对移植肿瘤细胞体内生长的影响取雌性、4-6周龄的胸腺免疫缺陷裸鼠(BALB/c-nu)24只(购自中国药品生物制品检定所)，在裸鼠房饲养和实验。共分四组，每组6只。接种细胞前将裸鼠以4GY137Cs的剂量进行全身辐照。于每只裸鼠右侧前肢皮下分别接种KB-neo,KB-p53和野型KB三种KB细胞(107个细胞/每只裸鼠)。每3天观察裸鼠肿瘤的生长情况，并用游标卡尺测量、记录肿瘤的大小，按椭圆体积公式计算肿瘤体积{体积=(4/3)π(长径/2)(短径/2)(长径+短径)/4}，观察并记录动物死亡时间。重复此实验，并在选定的时间里处死动物，剥取瘤体，称重，并将肿瘤组织样本做免疫组织化学和超微结构分析。KB-wt、KB-neo和KB-p53三种KB细胞分别接种于BALB/c-nu裸鼠皮下后移植瘤的平均生长曲线见图5。接种KB-neo细胞移植瘤生长速度最快，接种KB-wt细胞移植瘤生长速度与接种KB-neo细胞移植瘤生长速度无差别(结果略)。接种KB-p53细胞移植瘤生长速度最慢，与接种空载体细胞相比，有显著性差异(p=0.0001)。
肿瘤细胞接种19天，处死动物，剥离瘤块，野型KB瘤体平均重量为1.6983±0.345克，转染空载体pLXSN-neo cDNA者瘤体平均重量为1.943±0.2534克，转染pLXSN-p53 cDNA组的瘤体平均重量为0.8017±0.34克(结果见图6)。
图6表示KB-wt、KB-neo和KB-p53三种KB细胞分别接种于BALB/c-nu裸鼠皮下后动物的生存曲线。KB-p53组分别与KB-neo组和KB-wt组相比，差异显著(p＜0.05)。KB-neo组和KB-wt组相比，无差异。
图1抗肿瘤多肽(p53肽)氨基酸序列图2抗肿瘤多肽(p53肽)DNA序列图3重组p53肽表达载体的构建图4重组病毒上清对HUVE细胞增殖作用图5裸鼠皮下KB细胞移植瘤平均生长曲线图6重组p53肽对裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用
权利要求
1．一种新的抗肿瘤多肽物质，通过病毒载体介导，具有靶向性抑制肿瘤的生长和转移作用，其特征在于基本组成为图1所列氨基酸序列的53肽或其活性片段。
2．根据权利要求1所制造的一种药用组合物，其特征在于，含权利1所述的多肽分子或其突变蛋白。
3．一种抗肿瘤多肽的基因治疗用基因重组病毒载体及其改构体，其特征在于目的基因由图2所列DNA序列或其改构体组成。
4．根据权利要求3，用于表达53肽的质粒，其特征在于，含权利2所述的DNA分子。
5．根据权利要求4所述的质粒，其特征在于，所述质粒选自pET32c。
6．根据权利要求3所述的基因重组病毒载体，其特征在于，所述的病毒可以是逆转录病毒，也可以是其它病毒。
全文摘要
本发明涉及一种含53个氨基酸的多肽(简称p53)及其基因重组逆转录病毒载体,提供了一种病毒载体介导的抗肿瘤p53基因治疗组合物,具有靶向性抗肿瘤组织中血管新生,抑制肿瘤的生长和转移的作用。
文档编号C07K14/00GK1319605SQ0110908
公开日2001年10月31日 申请日期2001年2月28日 优先权日2001年2月28日
发明者韩忠朝, 李妍涵 申请人:中国医学科学院血液学研究所