专利名称：一种多苯并咪唑金属配合物非病毒基因载体及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的非病毒基因载体，具体地讲是一种多苯并咪唑金属配合物
非病毒基因载体及其制备与应用。
背景技术：
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细 胞，以纠正基因缺陷从而达到治疗疾病的目的。基因治疗的关键是获得安全、有效的进行基 因转染的载体。基因治疗的载体一般分为病毒型和非病毒型，前者转染效率较高，但存在导 向性差、携带能力低、具免疫原性和潜在致癌性等缺点；后者则具有低毒性、低免疫原性、低 致癌性、易制备等优点因此近年来备受关注。 非病毒基因释放的载体包括阳离子脂类、金属配合物、聚合物(如聚-L-赖氨酸 和聚胺等)、树状物(端基主要为胺基)、多肽(肽核酸)、纳米粒子(如量子点和碳纳米管 等)和环糊精衍生物等，这些化合物具有低毒性、携带基因能力高、低免疫原性、低致癌性、 易制备等优点。研究表明大多数阳离子基因载体均能通过其带正电基团与DNA的带负电 荷磷酸基发生静电作用，从而减弱DNA链上磷酸根负电荷之间的排斥作用，导致DNA弯曲、 凝聚(压縮)，甚至使DNA被包裹。这些化合物的不足之处主要是(l)由于受到细胞内外 屏障的阻碍，细胞转染效率较低；(2)由于载体-DNA复合物是通过静电作用与生物膜结合， 故不能转染膜表面含大量蛋白多糖的不带负电荷的细胞系；(3)由于载体的细胞毒性通常 与其正电荷密度成正比，表面带过多正电荷的载体-DNA复合物易与血清白蛋白等血液组 分相互作用，从而不利于靶细胞吸收。然而，非病毒基因载体优良的生物兼容性、对基因的 大小基本没有限制和可大剂量生产等优点，使其在基因治疗中具有强大的吸引力和潜在的 应用价值。研究者尽管设计合成了大量可驱动DNA凝聚的阳离子化合物，且在一定程度上 能克服基因治疗中的体内、体外障碍，但金属配合物作为一类潜在有效的基因载体，却一直 没有得到重视。 与其它阳离子化合物相比，多苯并咪唑金属配合物具有水溶性好、结构多样化、正 电荷密度合理、制备容易等特点，故是一类潜力巨大的基因载体。由于这类配合物分子中具 有较多电中性苯并咪唑基团，对细胞内的酸性环境具有显著的缓冲作用，这样由多种驱动 力共同作用(包括静电作用以及金属配合物与DNA分子间碱基对的插入作用)诱导的DNA 凝聚体不会因为稀释或与其他阴离子物种相互作用而解离，并且聚集体表面也不会积聚过 高的正电荷，有助于减弱与血液中带负电物种间的相互作用，从而更加有利于凝聚体进入 细胞核并被细胞吸收。申请人在工作中发现，驱动DNA凝聚的作用力包括静电作用和配合 物与DNA碱基对间的插入作用。这是首次发现以多苯并咪唑为主配体的多核金属配合物对 DNA凝聚具有显著促进作用。
发明内容
本发明目的旨在提供一种多苯并咪唑金属配合物非病毒基因载体及其制备与应 用，该类金属配合物具有较好的水溶性、结构多样性和合理的正电荷密度等特点，而且容易 制备，故是一类潜力巨大的基因载体。
本发明的技术方案包括 —种非病毒基因载体，它是以多苯并咪唑为配体的多核金属配合物，具体是由1， 1，4，7，10，10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺、l，l，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二 乙基三胺、N，N，N'，N'-四(2-苯并咪唑甲基)-1，10-二氮-4，7-二氧癸烷、&&『，『-四 (2-苯并咪唑亚甲基)-l，2-二乙胺、N，N-二 (2-苯并咪唑甲基)亚胺或者三(2-苯并咪唑 基甲基)胺为主配体，以苯环或脂肪链多元羧酸为桥连配体，以H20、Cr、N(V、Ac—或C1(V为 辅助配体或抗衡阴离子，合成的同多核或杂多核Mg2+、 Ca2+、 Zn2+、 Cu2+、 Co2+/3+、 Mn2+、 Fe2+/3+或 Ni2+金属离子的配合物。 其中，所述的配体l，l，4，7，10，10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺(TTHB)的
合成，由三乙四胺六乙酸与邻苯二胺按物质的量之比i : 4 i : s，优选i : e，以乙二醇
为溶剂，160 18(TC共热縮合6 8小时，直到无水蒸汽放出为止；縮合产物冷却至120°C 倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入适量无水乙醇，静置过夜；过 滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2 3次得到白色固体产物，用丙酮洗 涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。 所述的配体1，1，4，7，7_五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺(DTPB)的合成(参 见图1、图2)，由二乙三胺五乙酸(DTPA)与邻苯二胺按物质的量之比1 : 5，以乙二醇为溶 剂，160 18(TC共热縮合6 8小时，直到无水蒸汽放出为止；縮合产物冷却至12(TC倒入 烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红 褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2 3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到 白色固体粉末或无色晶体目的产品。 所述的配体N，N，N'，N'-四(2-苯并咪唑甲基)-l，10-二氮-4，7-二氧癸烷(EGTB) 的合成，由乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)与邻苯二胺按物质的量之比1 : 2 1 : 6，优选1 : 4，以乙二醇为溶剂，160 18(TC共热縮合6 8小时，直到无水蒸汽放出 为止；縮合产物冷却至12(TC倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入 无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2 3次得到 白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。
所述的配体N， N， N'， N'-四(2-苯并咪唑亚甲基)-l，2-二乙胺(EDTB)的合成， 由乙二胺四乙酸(EGTA)和邻苯二胺按物质的量之比l : 2 1 : 6，优选1 : 4，以乙二醇 为溶剂，160 18(TC共热縮合6 8小时，直到无水蒸汽放出为止；縮合产物冷却至120°C 倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得 到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2 3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤， 得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。 所述的配体三(2-苯并咪唑基甲基)胺(NTB)的合成，由胺基三乙酸(NTA)与邻
苯二胺按物质的量之比i : i i : 5，优选i : 3，以乙二醇为溶剂，160 18(rc共热縮
合6 8小时，直到无水蒸汽放出为止；縮合产物冷却至12(TC倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产 品用无水乙醇重结晶2 3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶 体目的产品。 所述的配体N，N-二 (2'-苯并咪唑甲基)亚胺(IDB)的合成，由亚胺基二乙酸与
邻苯二胺按物质的量之比i : i i : 3，优选i : 2，以乙二醇为溶剂，160 lscrc共热
縮合6 8小时，直到无水蒸汽放出为止；縮合产物冷却至12(TC倒入烧杯中，边搅拌边加 入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗 产品用无水乙醇重结晶2 3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色 晶体目的产品。 本发明的非病毒基因载体的制备方法，其特征是，以1， 1，4， 7， 10， 10-六(2-苯并 咪唑甲基)-三乙基四胺(TTHB)、l，l，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺(DTPB)、 N， N， N' ， N'-四-(2-苯并咪唑甲基)-1 ， 10- 二氮-4， 7- 二氧癸烷(EGTB) 、 N， N， N' ， N'-四 (2-苯并咪唑亚甲基)-l，2-二乙胺(EDTB)、或者N，N-二 (2'-苯并咪唑甲基)亚胺(IDB) 为配体的金属配合物的合成将配体溶于甲醇或乙醇溶液，然后加入所述金属离子的可溶 性盐，配体和金属盐的摩尔比为1 : 0. 5 1 : 4，60 9(TC反应1 4小时，然后过滤、干 燥得到产品，用自然挥发或扩散法得到多苯并咪唑金属配合物非病毒基因载体晶体。
以三(2-苯并咪唑基甲基)胺(NTB)为配体的金属配合物的合成，合成步骤为
步骤1 、配合物[Cu (NTB) (H20) ] (C104) 2 5. 2 (H20)的合成: 将4mL CuCl2 *2H20(0. 02mol)乙醇溶液逐滴加入到200mLNTB (0. 02mol)乙醇溶液 中，搅拌，水浴加热30 9(TC，反应半个小时后，加入10mlNaC104(0 . 04mmol)水溶液，继续 使反应进行2 6个小时，冷却静置，过夜，有浅绿色晶体析出，过滤，洗涤，真空干燥得到浅 黄绿色片状固体，即为目的配合物； 步骤2、将步骤1得到的配合物和所述金属离子的可溶性盐按摩尔比1 : 0.5 1 : 4加入蒸馏水中，然后在每一种配体和金属离子的溶液中再分别加入苯甲酸钠、4， 4'-联吡啶、对苯二甲酸、均苯四甲酸、均苯三甲酸、烟酸、异烟酸、丁二酸、反丁烯二酸、戊二 酸或已二酸桥连配体，桥连配体和金属盐的摩尔比为1 : 0.5 1 : 5，调节溶液pH 4.0 9.0，将混合溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中并封闭在80 18(TC反应36 80h，然后以 5°C /h的速率降低反应温度至室温，在混合液中得到适于X-射线单晶衍射的多苯并咪唑金 属配合物非病毒基因载体晶体。 本发明的非病毒基因载体的应用，其特征是，用于诱导DNA凝聚形成凝聚体。该载 体和DNA形成的凝聚体，用于细胞核的转染染色。
图1 、配体DTPB合成路线。 图2、配体DTPB配体分子结构图。 图3、配合物[Cu2(DTPB)Cl2]Cl2 5H20 2(^3011分子结构图。 图4、用ctDNA滴定配合物[Cu2 (DTPB) Cl2] Cl2 5H20 2CH30H的紫夕卜_可见光谱图。 测试方法不同浓度的ctDNA在20mM Tris-HCl (pH7. 4)的缓冲体系中滴定浓度为M的配合物，37t:下反应相同时间，扫描测定体系在200 450nm的吸收值，采用双通道 方法，用相应浓度的ctDNA样品作为空白，测定紫外吸收光谱。
图5、配合物[Cu2 (DTPB) Cl2] Cl2 5H20 2CH30H与入DNA凝聚体电镜图。
测试方法浓度为2 50 ii M的配合物与A DNA在20mM Tris-HCl (pH7. 4)的缓 冲体系中，37°C反应不同的时间，然后取5 L的样品，滴加于铜网上，自然干燥，用Tecnai G220透射电镜在175kV观察(未染色)，单独DNA体系作为对照一并进行。图5中图a、b、 c、 d依次表示的是5. 6iiMADNA和10iiM配合物分别反应30min、30min、60min、 120min形 成凝聚体的形貌。 图6、配合物[Cu2 (EGTB) (C104) 2 (H20) 2] (C104) 2 6H20与入DNA凝聚体在细胞中的 定位。 测试方法5 ii M的配合物和5 ii M的A DNA反应30min后与细胞共培养，然后加入 荧光染料DAPI和Greenview分别对对细胞核和凝聚体进行标记，然后通过倒置荧光显微镜 观察凝聚体在细胞中的定位。图六中箭头所指黄色部分为凝聚体在细胞核内的定位，绿色 部分为整个细胞核。 图7、配合物1、2、3、4与A DNA凝聚体的毒性实验结果。
其中，配合物1为[Cu2 (EGTB) (C104) 2 (H20) 2] (C104) 2 6H20，
配合物2为[Cu2 (DTPB) Cl2 (H20) ] (N03) 2 2CH30H H20，
配合物3为[Co2 (DTPB) Cl3] CI 5H20， 配合物4为[Cu2 (DTPB) (N03) CI (H20) ] (N03) 2 3CH30H 5H20。 测试方法不同浓度的配合物和A DNA反应30min后与细胞共培养，MTT法检测凝
聚体的细胞毒性。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞
数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。 图8、单独配合物1、2、3、4的细胞毒性 其中，配合物1为[Cu2 (EGTB) (C104) 2 (H20) 2] (C104) 2 6H20， 配合物2为[Cu2 (DTPB) Cl2 (H20) ] (N03) 2 2CH30H H20， 配合物3为[Co2 (DTPB) Cl3] CI 5H20， 配合物4为[Cu2 (DTPB) (N03) CI (H20) ] (N03) 2 3CH30H 5H20的细胞毒性。
图9、配合物1、2、3、4与质粒pGL3-Control Vector凝聚体的转染实验结果。
配合物1为[Cu2 (EGTB) (C104) 2 (H20) 2] (C104) 2 6H20，
配合物2为[Cu2 (DTPB) Cl2 (H20) ] (N03) 2 2CH30H H20，
配合物3为[Co2 (DTPB) Cl3] CI 5H20、 配合物4为[Cu2 (DTPB) (N03) CI (H20) ] (N03) 2 3CH30H 5H20。 测试方法不同浓度的配合物和质粒pGL3-Control Vector反应30min后和细胞 共培养，通过荧光素酶检测法分析配合物种类及配合物浓度对pGL3-Contro1 Vector质粒 转染效率的影响。
具体实施方式
实施例1 [Mn2 (TTHB) Cl2] Cl2 □ 2/3C2H50H □ 4H20的合成
称取提纯后的TTHB (0. 5mmo1)粉末溶解于20mL乙醇中，然后加入含有 MnCl2 2H20(1. 5mmo1)乙醇溶液，控温75。C搅拌反应5h，冷却、过滤，得到澄清的无色溶液；
将溶液静置于室温下数周后析出的方形单晶即为目的物。
实施例2 [Cu2 (DTPB) Cl2] Cl2 5H20 2CH30H的合成 称取提纯后的DTPB(O. 5mmo1)粉末溶解于20mL甲醇中，然后加入含有 CuCl2 '2H20(lmmo1)甲醇溶液，控温6(TC搅拌反应2h，冷却、过滤，得到澄清的绿色溶液；将
溶液静置于室温下数周后析出的方形单晶即为目的物(参见图3)。
实施例3 [Cu2 (EGTB) (H20) 2] (C104) 4的合成称取提纯后的EGTB (0. 5mmo1)粉末溶解于20mL甲醇中，然后加入含有 Cu (C104)2 *6H20(lmmol)的甲醇溶液，控温6(TC搅拌反应2h，冷却、过滤，得到绿色的粉末与 绿色溶液；将溶液静置于室温下数周后析出的块状单晶即为目的物。
实施例4 Cu (EDTB) (C104) 2 CH30H的合成 称取提纯后的EDTB(lmmol)粉末溶解于2mL乙二醇中，然后加入含有 (Cu(C104)2 6H20) (lmmol)的10mL水溶液中，控温60。C搅拌反应2h，冷却、过滤，得到绿色
的粉末与绿色溶液；将溶液静置于室温下数周后析出的块状单晶即为目的物。
实施例5 [Cu(IDB)Cl2] CH30H的合成 称取提纯后的IDB(O. 5mmo1)粉末溶解于20mL甲醇中，然后加入含有 CuCl2 '2H20(lmmo1)甲醇溶液，控温6(TC搅拌反应2h，冷却、过滤，得到澄清的绿色溶液；将
溶液静置于室温下数周后析出的方形单晶即为目的物。
实施例6 由芳香羧酸桥连的铜的NTB配合物 步骤1 、 [Cu (NTB) (H20) ] (C104) 2 5H20的合成 将4mL CuCl2 *2H20(0. 02mol)乙醇溶液逐滴加入到200mLNTB (0. 02mol)乙醇溶液 中，搅拌，水浴加热6(TC，反应半个小时后，加入10mLNaC104(0 . 04mmol)水溶液，继续使反应 进行3个小时，冷却静置，过夜，有浅绿色晶体析出。过滤，依次用少量乙醇，乙醚，洗涤，真 空干燥得到浅黄绿色片状固体即为目的物。 步骤2、 [Cu (NTB) (PhCOO) ] C104的合成(PhCOO代表苯甲酸) 将步骤1得到的化合物(0. 2mmo1)加入到15mL蒸馏水中，然后加入lmL苯甲酸钠 (0. 2mmo1)水溶液，并调节溶液pH7. 2，将混合好的溶液转移到25mL聚四氟乙烯反应釜中并 封闭在120°C反应72h，然后以5°C /h的速率降低反应温度至室温，滤液中得到适于X-射线
单晶衍射的黄绿色块状晶体，手工分离出晶体即为目的物。
实施例7 由脂肪羧酸桥连的铜的NTB配合物 {[Cu (NTB) ] 2 (ii -f丽)} (C104) 2 8 (H20)的合成(f丽代表反丁烯二酸根)
将实施例6步骤1得到的化合物(0. 2mmo1)加入到10mL蒸馏水中，然后加入5mL反丁烯二酸(0. lmmol)水溶液，并调节溶液pH值pH7. 2 ;将混合好的溶液转移到25mL聚四 氟乙烯反应釜中并封闭在12(TC反应72h，然后以5°C /h的速率降低反应温度至室温，滤液 中得到适于X-射线单晶衍射的蓝色片状晶体，手工分离出晶体即为目的物。
实施例8 透射电子显微镜(TEM)观察DNA凝聚体形态在20mM Tris-HCl (pH7. 4)缓冲液中，加入5. 6 ii DNA和2 50 ii M浓度的配合 物(Cu2(DTPB)Cl2]Cl2 5H20 2CH30H) ， 37。C反应5min 2h不同时间。然后取5ii L样品， 滴加于铜网上，自然干燥，用Tecnai G2 20透射电镜在175kV观察(未染色)，单独DNA体 系作为对照一并进行，结果见图5。
实施例9 共聚焦显微镜观察凝聚体跨膜实验 凝聚体制备实验在细胞培养用D-Hank' s缓冲液中进行，5iiM的ctDNA分别 与5iiM的配合物(Cu2(EGTB) (C104)2 (H20)2] (C104)2 6H20)于37。C反应30min ;加入荧光 染料Greenview( —种可替代溴化乙锭的新型核酸染料)于37。C继续反应30min，实验中 61^6群1^用于双链0脆凝聚体染色，4，6-二氨基-2-苯基喷哚(DAPI)用于细胞核染色。
细胞培养H印G2肝癌细胞培养于含10%新生小牛血清及双抗(100U/mL青霉素、 100ii g/mL链霉素)的DMEM培养基中，37t:、5X C02的培养箱中进行培养。每隔一天更换 一次细胞培养液，每隔三天细胞传代一次。培养一段时间后以合适的密度接种细胞至6孔 培养板进行分组培养，培养条件为37°C、5% C02的培养箱中培养24h。分组情况为空白组 (加入无血清培养基50 ii L)、配合物系列组(各孔加入对应样品50 ii L)。
细胞样后处理(1)加入药物培养24h后，加入DAPI继续培养20min ; (2)用磷酸 盐缓冲液PBS (含有EDTA的磷酸盐缓冲液称取适量EDTA钠盐溶于pH为8. 3的0. 1M磷酸 盐溶液中配成含有5mM EDTA的磷酸盐缓冲液)洗涤细胞3次；(3)用0. 25%胰蛋白酶消化 细胞使其从培养板上脱落，即时制板于激光共聚焦显微镜下观察，结果参见图6。
实施例10
凝聚体细胞毒性实验 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 ii L，铺板使待测细胞调密度至 1000 10000孔，边缘孔用无菌PBS填充。5% 0)2，371:孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔 平底板)，加入浓度梯度(5、10、20、40、75微摩尔/升)的药物。5XC02，37。C孵育16 48 小时，倒置显微镜下观察；每孔加入20 ii L MTT溶液(5mg/ml，即0. 5% MTT)，继续培养4h。 终止培养，吸去孔内培养液；每孔加入150iiL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结 晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔(培养 基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜) 结果参见图7、图8。
实施例11 荧光素酶报告基因检测试剂盒检测凝聚体的转染效率 采用上述图9中所述的配合物1 : [Cii2(EGTB) (C104) 2 (H20) 2] (C104)2 6H20， 配合物2 : [Cu2 (DTPB) Cl2 (H20) ] (N03) 2 2CH30H H20， 配合物3 : [Co2 (DTPB) Cl3] CI 5H20，
配合物4 : [Cu2 (DTPB) (N03) CI (H20) ] (N03) 2 3CH30H 5H20， 在37°C，5% C02条件下，在含0. 5%双抗和10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养 人肝癌细胞H印G2，当细胞铺满培养瓶壁95%左右时，接种到96孔板在相同的条件下继续 培养24h至细胞铺满率达90X。pGL3-Contro1 Vector质粒分别与不同浓度的配合物反应， 在室温下于pH7. 4， 20mM Tris-HCl缓冲液中反应30min。用180 y L不含血清DMEM培养基 置换培养板中的细胞培养介质，30min后，每孔加入20 L转染溶液(质粒-配合物凝聚体 溶液)，质粒最终碱基对浓度为1. 5 M，配合物浓度依次为1、2、3、4、5 M，细胞在37°C ， 5% C02的培养箱中继续培养4h，然后每孔加入200 L含10%小牛血清的新鲜DMEM培养基溶 液置换原来的培养液。细胞在37°C，5% C02的培养箱中继续培养48h。
荧光素酶检测实验通过荧光素酶检测法分析配合物种类及配合物浓度对 pGL3-Control Vector质粒转染效率的影响。吸净培养基后，每孔细胞用100 y L PBS/ Triton裂解液裂解，然后加入100 y L萤火虫荧光素酶检测试剂，混匀后在酶标仪上设定激 发波长为338nm，最大发射波长为590nm测定荧光强度，结果参见图9。
权利要求
一种非病毒基因载体，其特征是它是以多苯并咪唑为配体的多核金属配合物，具体是由1，1，4，7，10，10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺、1，1，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺、N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑甲基)-1，10-二氮-4，7-二氧癸烷、N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑亚甲基)-1，2-二乙胺、N，N-二(2-苯并咪唑甲基)亚胺或者三(2-苯并咪唑基甲基)胺为主配体，以苯环或脂肪链多元羧酸为桥连配体，以H2O、Cl-、NO3-、Ac-或ClO4-为辅助配体或抗衡阴离子，合成的同多核或杂多核Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Co2+/3+、Mn2+、Fe2+/3+或Ni2+金属离子的配合物。
2. 如权利要求1所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的配体1， 1，4， 7， 10， 10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺，由三乙四胺六乙酸与邻苯二胺按物质的量之比 1 : 4 1 : 8，以乙二醇为溶剂，160 18(TC共热縮合6 8小时，直到无水蒸汽放出为 止；縮合产物冷却至12(TC倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无 水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2 3次得到白 色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。
3. 如权利要求2所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的三乙四胺六乙酸与邻 苯二胺的物质的量之比为1 : 6。
4. 如权利要求l所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的配体l，l，4，7，7-五 (2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺，由二乙三胺五乙酸与邻苯二胺按物质的量之比1 : 5， 以乙二醇为溶剂，160 18(TC共热縮合6 8小时，直到无水蒸汽放出为止；縮合产物冷 却至12(TC倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过 夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2 3次得到白色固体产物，用 丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。
5. 如权利要求1所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的配体N， N， N'， N'-四 (2-苯并咪唑甲基)-1 ， 10- 二氮-4， 7- 二氧癸烷，由乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸与邻 苯二胺按物质的量之比l : 2 1 : 6，以乙二醇为溶剂，160 18(TC共热縮合6 8小时， 直到无水蒸汽放出为止；縮合产物冷却至12(TC倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至 室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重 结晶2 3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。
6. 如权利要求5所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的乙二醇双(2-氨基乙基 醚)四乙酸与邻苯二胺的物质的量之比为1 : 4。
7. 如权利要求1所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的配体N， N， N'， N'-四 (2-苯并咪唑亚甲基)-l，2-二乙胺，由乙二胺四乙酸和邻苯二胺按物质的量之比l : 2 1 : 6，以乙二醇为溶剂，160 18(TC共热縮合6 8小时，直到无水蒸汽放出为止滞合产 物冷却至12(TC倒入烧杯，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置 过夜；过滤得到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2 3次得到白色固体产物， 用丙酮洗涤，得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。
8. 如权利要求7所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的乙二胺四乙酸和邻苯 二胺的物质的量之比为1 : 4。
9. 如权利要求l所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的配体三(2-苯并咪唑基甲基)胺，由胺基三乙酸与邻苯二胺按物质的量之比i : i i : 5，以乙二醇为溶剂，160 18(TC共热縮合6 8小时，直到无水蒸汽放出为止；縮合产物冷却至12(TC倒入烧 杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得到红褐 色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2 3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得到白 色固体粉末或无色晶体目的产品。
10. 如权利要求9所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的胺基三乙酸与邻苯二 胺的物质的量之比为1 : 3。
11. 如权利要求1所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的配体N， N-二 (2-苯并咪唑甲基)亚胺，由亚胺基二乙酸与邻苯二胺按物质的量之比i : i i : 3，以乙二醇为溶剂，160 18(TC共热縮合6 8小时，直到无水蒸汽放出为止；縮合产物冷却至120°C 倒入烧杯中，边搅拌边加入蒸馏水；冷却至室温，变粘稠，加入无水乙醇，静置过夜；过滤得 到红褐色粗产品，然后粗产品用无水乙醇重结晶2 3次得到白色固体产物，用丙酮洗涤， 得到白色固体粉末或无色晶体目的产品。
12. 如权利要求11所述的一种非病毒基因载体，其特征是，所述的亚胺基二乙酸与邻 苯二胺的物质的量之比为1 : 2。
13. 权利要求l所述的一种非病毒基因载体的制备方法，其特征是，以1，1，4，7，10， 10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺、l，l，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺、 N，N，N'，N，-四-(2-苯并咪唑甲基)-1，10-二氮-4，7-二氧癸烷、&&^，『-四(2-苯 并咪唑亚甲基)-l，2-二乙胺，或者N， N-二 (2'-苯并咪唑甲基)亚胺为配体的金属配合 物的合成步骤将配体溶于甲醇或乙醇溶液，然后加入所述金属离子的可溶性盐，配体和金 属盐的摩尔比为l : 0. 5 1 : 4，60 90。C反应l 4小时，然后过滤、干燥得到产品，用 自然挥发或扩散法得到非病毒基因载体晶体。
14. 权利要求l所述的一种非病毒基因载体的制备方法，其特征是，以三(2-苯并咪唑 基甲基)胺为配体的金属配合物的合成步骤为步骤1、配合物[Cu(NTB) (H20)] (C104)2 5. 2(H20)的合成:将4mL CuCl2 2H20(0. 02mol)乙醇溶液逐滴加入到200mLNTB(0. 02mol)乙醇溶液中， 搅拌，水浴加热30 90°C ，反应半个小时后，加入10mlNaC104 (0 . 04mmol)水溶液，继续使反 应进行2 6个小时，冷却静置，过夜，有浅绿色晶体析出，过滤，洗涤，真空干燥得到浅黄绿 色片状固体，即为目的配合物；步骤2、将步骤1得到的配合物和所述金属离子的可溶性盐按摩尔比1 : 0.5 1 : 4 加入蒸馏水中，然后在每一种配体和金属离子的溶液中再分别加入苯甲酸钠、4，4'-联吡 啶、对苯二甲酸、均苯四甲酸、均苯三甲酸、烟酸、异烟酸、丁二酸、反丁烯二酸、戊二酸或己 二酸桥连配体，桥连配体和金属盐的摩尔比为1 : 0. 5 1 : 5，调节溶液pH 4. 0 9. 0， 将混合溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中并封闭在80 18(TC反应36 80h，然后以5°C / h的速率降低反应温度至室温，在混合液中得到适于X-射线单晶衍射的非病毒基因载体晶 体。
15. 权利要求1所述的一种非病毒基因载体的应用，其特征是用于诱导DNA凝聚形成凝 聚体。
16. 按权利要求15所述的一种非病毒基因载体的应用，其特征是，该载体和DNA形成的 凝聚体，用于细胞核的转染染色。
全文摘要
本发明涉及一种非病毒基因载体的制备与应用。该非病毒基因载体为多苯并咪唑金属配合物。它是由多苯并咪唑TTHB、DTPB、EGTB、EDTB、IDB或者NTB为主配体，含苯环或脂肪链多元羧酸为桥连配体，H2O、Cl-、NO3-、Ac-或ClO4-为辅助配体或抗衡阴离子，合成和表征了大量含一个、两个或多个相同及不同的Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Co2+/3+、Mn2+、Fe2+/3+或Ni2+金属离子的配合物。该类配合物作为新型基因载体，具有合成方法简单高效、水溶性好、细胞毒性低和转染效率高的特点。通过紫外-可见吸收光谱、光散射、透射电镜等实验发现这类配合物可有效诱导DNA凝聚；倒置荧光显微镜和细胞转染实验证实多苯并咪唑金属配合物作为载体释放的基因可以有效地进入细胞核内进行表达。
文档编号C07F15/06GK101705245SQ20091027280
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月17日 优先权日2009年11月17日
发明者刘梁, 刘长林, 孟祥高, 张航, 殷俊, 胡思 申请人:华中师范大学