聚半乳糖醛酸酶优化基因及其表达载体和应用
【专利摘要】本发明公开了聚半乳糖醛酸酶优化基因及其表达载体和应用。本发明首先在不改变聚半乳糖醛酸酶氨基酸序列的前提下，综合考虑密码子偏好性，GC含量的变化，密码子适应指数(CAI)，不稳定序列的删除，mRNA二级结构等因素，对聚半乳糖醛酸酶基因进行多种策略的改造，得到3个聚半乳糖醛酸酶优化基因。进一步将上述3个聚半乳糖醛酸酶基因和1个野生型基因转入到毕赤酵母中进行表达，最终筛选出分泌表达量显著提高、酶活力最强的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的聚半乳糖醛酸酶优化基因。本发明聚半乳糖醛酸酶优化基因所表达的聚半乳糖醛酸酶能有效地降解梨汁中的果胶类物质，提高出汁率和光穿透率，为工业化扩大生产奠定了基础。
【专利说明】
聚半乳糖醛酸酶优化基因及其表达载体和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及聚半乳糖醛酸酶基因，尤其涉及经过优化后的聚半乳糖醛酸酶基因以 及含有优化基因的重组表达载体和重组宿主细胞，还涉及聚半乳糖醛酸酶的制备及在果汁 加工中的应用，属于聚半乳糖醛酸酶基因应用领域。
【背景技术】
[0002] 果胶是植物细胞壁中的重要组成成分，由不同酯化度和不同侧链的半乳糖醛酸以 α-l，4糖苷键连接而成。水果中含有大量的果胶，由于其具有吸水性和粘性，在果汁加工过 程中，果胶的存在会造成果浆粘稠，造成果汁压榨率低和浑浊，影响其产量和口感;其在动 物肠道内增大了食糜粘度，在一定程度上抑制了肠道对养分的吸收速度。这会对畜禽的营 养吸收及利用等造成直接的影响，甚至会影响动物的生产性能，导致动物肠胃功能衰减。
[0003] 果胶酶是一类能够分解果胶类物质的酶的总称。聚半乳糖醛酸酶 (polygalacturonase)是果胶酶家族中的主要成员，能够水解断裂α-l，4糖苷键，从而降解 果胶，迅速降低果胶粘度。从作用方式上可以分为内切型（endo-PG)和外切型（exo-PG)两 种。其广泛的应用在食品工业、纺织工业、医药、造纸、环境保护、生物技术和饲料添加剂等 方面。
[0004] 天然来源的果胶酶通常存在于动植物和微生物中，但来源于动植物的果胶酶产量 很低，不适合用来进行大规模生产，而微生物具有生长速度快，营养要求低，易于大规模培 养等诸多优点成为生产果胶酶的优良生物资源。很多微生物来源的果胶酶已被报道，其中 真菌来源的比较多，如来源于青霉菌、曲霉菌等。
[0005] 目前，中国各企业使用的优良的果胶酶依然依赖于国外进口，但进口酶的价格昂 贵，使企业的生产成本增加。随着中国食品工业的不断发展与壮大，所需的果胶酶也愈来愈 多。尤其是对于产量高、稳定性好、性质优良以及酶活性高的果胶酶制剂的需求也越来越 大。随着生物技术的不断发展，利用基因工程技术已对来源于微生物的多种果胶酶基因进 行了克隆测序，对果胶酶基因的结构、功能以及调控表达等方面有了较为深入的了解。随着 分子生物学技术的深入研究，利用一些高效微生物菌株来生产优良性质的果胶酶已经成为 一种新的有效途径。各国研究专家已经从各种不同微生物中筛选出了大量的具有优良性质 的果胶酶基因，这些果胶酶拥有不同的性质，如高比活、耐热、耐低温、耐酸等。为了提高这 些果胶酶的生产水平，有研究者将这些果胶酶基因在大肠杆菌、毕赤酵母等宿主菌中进行 异源重组表达。但这些报道中关于聚半乳糖醛酸酶的表达水平仍然不高，纯化回收率低，限 制其在工业中的应用。因此，对聚半乳糖醛酸酶基因进行多种策略的改造，得到分泌表达量 有显著提高的聚半乳糖醛酸酶优化基因，具有重要的意义。
[0006] 外源基因在异源宿主中的表达水平受很多因素影响，包括但不限于如下所列：
[0007] 1)密码子偏好性，稀有密码子诱导的翻译中止，在宿主生物体中很少使用的密码 子，对应核苷酸的存在可能对蛋白质翻译有不利影响。
[0008] 2)重复诱导的聚合酶滑动，重复诱导的聚合酶滑动会导致DNA聚合酶滑动或羁泮， 从而导致移码突变。在高GC含量的生物体中，可能存在更高程度的由G或C核苷酸重复组成 的序列。
[0009] 3)mRNA二级结构，二级结构可以隔离RBS序列或起始密码子，与蛋白质表达水平的 降低有关。莖环结构也可能涉及转录中止和衰减等。
[0010]已有报道表明，通过基因密码子优化等手段，可以提高外源基因在基因工程宿主 中的表达水平。但尽管如此，很多从业人员对基因优化的一般策略尚未达成统一意见。一些 人的首选策略是在设计异源基因过程中尽可能多地使用表达宿主物种中的常用密码子。另 一些人首选的策略是对特定的密码子的上下文给予最大重视，从而使表达宿主中频繁出现 的密码子的使用最大化。因此，简单的密码子优化并不能总是提高表达水平，甚至可能降低 表达水平。经常地，还须辅以其他的技术手段，如GC含量在不同基因区域的分布比例，密码 子适应指数(codon adaptation index，CAI)等，并进行大批量的验证，才能得到高效表达 的突变基因。
【发明内容】
[0011] 本发明目的之一是对聚半乳糖醛酸酶基因的序列进行优化，得到一种在酵母中分 泌表达量有显著提高的聚半乳糖醛酸酶优化基因；
[0012] 本发明目的之二是提供含有上述聚半乳糖醛酸酶优化基因的重组表达载体以及 该重组表达载体的重组宿主细胞；
[0013] 本发明目的之三是将所述聚半乳糖醛酸酶的优化基因以及含有该优化基因的重 组表达载体和重组宿主细胞应用于聚半乳糖醛酸酶的生产。
[0014] 本发明为达到以上目的，采取的技术方案为：
[0015] 本发明将黑曲霉(Aspergillus niger)来源的的聚半乳糖醛酸酶基因 pga-zj5a (SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列），在不改变其蛋白质氨基酸序列的情况下，综合考虑密码 子偏好性，GC含量的变化，密码子适应指数(CAI)，不稳定序列的删除，mRNA二级结构等因 素，对聚半乳糖醛酸酶基因进行多种策略的改造，得到3个典型的聚半乳糖醛酸酶优化基 因，pga-zj5a-ml(核苷酸序列如SEQIDN0·2所示），pga-zj5a-m2(核苷酸序列如SEQID N0.3所示），pga-zj5a-m3(核苷酸序列如SEQIDN0.4所示）。
[0016] 本发明进一步提供了含有聚半乳糖醛酸酶优化基因的重组表达载体以及含有该 重组表达载体的宿主细胞;其中，优选的，所述重组表达载体是重组真核表达载体，更优选 为重组毕赤酵母表达载体;优选的，所述的宿主细胞优选为酵母细胞，更优选为毕赤酵母 (Pichia pastoris)细胞。
[0017] 本发明将3个聚半乳糖醛酸酶优化基因及1个野生型基因转入到毕赤酵母中进行 异源表达，结果表明：其中，转pga-z j5a_ml的菌株，其在摇瓶水平分泌表达的聚半乳糖醛酸 酶最高活力为976U/mL，转pga-zj5a_m2的菌株最高酶活力为1778U/mL，转pga-z j5a-m3的菌 株最高酶活力为1316U/mL。转野生型基因 pga-zj5a的菌株最高酶活性为1204U/mL。结果表 明，转pga-z j 5a_m2的菌株的酶活明显高于转pga-z j 5a、pga-z j 5a_ml、pga-z j 5a_m3的菌株。
[0018] 为了进一步验证结果，将上述4株毕赤酵母重组菌株分别在3升发酵罐中诱导产酶 发酵，发酵结果表明：转野生型基因 pga_zj5a的酵母转化子在甲醇诱导120h后聚半乳糖醛 酸酶活力为10436U/mL，而转pga-zj5a-m2的转化子在诱导120h后聚半乳糖醛酸酶活力则达 到了 15428U/mL，同优化前相比提高了48%。但是，转优化基因 pga-zj5a-ml的转化子其酶活 力仅为8572U/ml，与野生型相比降低了 17.9% ;转pga-zj5a-m3的转化子其酶活力为 10527U/ml，与野生型相比无显著变化。
[0019] 本发明将来源于黑曲霉的聚半乳糖醛酸酶基因经多种策略改造后得到了多个优 化基因，pga-zj5a-m2 (核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示)能够明显提高该酶在毕赤酵母中的 分泌表达量，而其它优化基因经优化后仍不能提高表达水平（pga-zj5a-m3)，甚至下降 (pga_zj5a_ml)〇
[0020] 本发明还提供了一种制备聚半乳糖醛酸酶的方法，包括:将SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的聚半乳糖醛酸酶优化基因可操作性的与表达载体相连接得到重 组表达载体;将所述重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株;培养重组菌株，诱导重组 聚半乳糖醛酸酶的表达，回收并纯化所表达的聚半乳糖醛酸酶，即得。
[0021 ]其中，所述重组表达载体是重组真核表达载体，优选为重组毕赤酵母表达载体;所 述的宿主细胞优选为酵母细胞，优选为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。
[0022] 本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：
[0023] 本发明将聚半乳糖醛酸酶优化基因转入到毕赤酵母中，该优化基因在毕赤酵母中 的分泌表达量显著提高，且所表达的聚半乳糖醛酸酶能够有效地降解果汁中的果胶类物 质，为该酶的进一步工业化扩大生产奠定了基础。
[0024] 本发明所涉及的术语定义
[0025]除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0026] 术语"重组宿主细胞"或"宿主细胞"意指包括外源性多核苷酸的细胞，而不管使用 何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的 其他方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
[0027] 术语"多核苷酸"或"核苷酸"意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核 苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸 的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的 核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括 PNA(肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指 定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取 代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或 所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代 (Batzer等人，Nucleic Acid Res · 19:5081 (1991) ;0htsuka等人，J.Biol ·Chem. 260: 2605- 2608( 1985);和Cassol等人，（1992) ;Rossolini等人，Mol Cell.Probes8:91-98( 1994))。
[0028] 术语"表达"指外源基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。
[0029] 术语"转化"指将外源基因引入到宿主细胞中的方法。
[0030] 术语"外源基因"指对特定的宿主细胞而言，该基因序列是属于外来的来源，或是 来自相同的来源但其原始序列进行了修饰或改造。
【附图说明】
[0031]图1聚半乳糖醛酸酶野生型基因 pga-Zj5a密码子使用频率；
[0032]图2本发明优化后聚半乳糖醛酸酶基因 pga-z j 5a_ml密码子使用频率；
[0033]图3本发明优化后聚半乳糖醛酸酶基因 pga-z j 5a_m2密码子使用频率；
[0034]图4本发明优化后聚半乳糖醛酸酶基因 pga-z j5a_m3密码子使用频率；
[0035]图5聚半乳糖醛酸酶野生型基因 pga_zj5a的mRNA二级结构图；
[0036]图6本发明优化后聚半乳糖醛酸酶基因 pga-zj5a-ml的mRNA二级结构图；
[0037]图7本发明优化后聚半乳糖醛酸酶基因 pga-zj5a-m2的mRNA二级结构图；
[0038]图8本发明优化后聚半乳糖醛酸酶基因 pga-zj5a-m3的mRNA二级结构图；
[0039] 图9酵母重组表达质粒构建示意图；
[0040] 图10酵母菌株3升发酵罐中聚半乳糖醛酸酶活力；
[0041 ]图11聚半乳糖醛酸酶的纯化(M:Marker; 1:未纯化的聚半乳糖醛酸酶;2:纯化后的 聚半乳糖醛酸酶;3:经Endo-H消化后的的聚半乳糖醛酸酶;4: Endo-H);
[0042] 图12不同添加量的重组聚半乳糖醛酸酶在梨汁中的应用效果；
[0043] 图13不同作用时间下重组聚半乳糖醛酸酶在梨汁中的应用效果。
【具体实施方式】
[0044]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和 形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0045] 说明：
[0046] 以下具体实施例中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下试验 例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括： Wei Xiao , John M.Walker,Yeast Protocol Senond edition(2006);Kriegler，Gene Transfer and Expression^ Laboratory Manual (1990) ；Ausubel et al,Current Protocols in Molecular Biology(1994)；Sambrook et al,Molecular Cloning,A Laboratory Manual (第3版.2001)。
[0047] 试验例1聚半乳糖醛酸酶基因的优化设计及合成
[0048] 1、试验方法
[0049] 1.1菌株和质粒
[0050] 黑曲霉(Aspergillus niger)，由发明人本实验室保存；
[0051]优化基因片段由南京金斯瑞生物科技公司合成。
[0052] 1.2聚半乳糖醛酸酶基因的优化设计
[0053]根据黑曲霉中克隆获得的聚半乳糖醛酸酶野生型基因的序列，对基因序列进行优 化，此过程中主要根据以下原则：
[0054] l)不改变聚半乳糖醛酸酶基因 pga-Zj5a所编码的氨基酸序列（如SEQIDN0.5所 示）；
[0055] 2)根据密码子使用偏好性，尽可能减少稀有密码子串联的概率，因为稀有密码子 有可能会降低翻译效率；
[0056] 3)根据毕赤酵母中密码子偏好性，改变其CAI值分布范围；
[0057] 4)控制基因 序列中GC含量和分布区域；
[0058] 5)避免高GC和连续AT区域的出现；
[0059 ] 6)对mRNA的茎环结构(能量)进行优化以延长mRNA的半衰期。
[0060] 2、试验结果
[0061 ] 通过优化，得到3个聚半乳糖醛酸酶突变基因 pga-z j5a-ml，pga-z j5a-m2和pga- zj5a-m3，其核苷酸序列分别为SEQIDN0.2、SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示。
[0062] 聚半乳糖醛酸酶基因序列优化前后GC含量变化如表1所示。聚半乳糖醛酸酶基因 优化前后的密码子使用情况如图1、2、3、4所示。聚半乳糖醛酸酶基因优化前后mRNA二级结 构如图5、6、7、8所示。
[0063] 表1聚半乳糖醛酸酶基因序列优化前后GC含量的变化
[0064]
[0065] 试验例2聚半乳糖醛酸酶重组毕赤酵母菌株的构建和酶蛋白的制备
[0066] 1、试验方法
[0067] 1.1菌株和质粒
[0068] Transl-Tl大肠杆菌感受态细胞和pEASY-BLUNT-simple载体购自北京全式金生物 技术有限公司；
[0069] 表达载体pPIC9和毕赤酵母受体菌株GS115为Invitrogen公司产品；
[0070] 带有野生型聚半乳糖醛酸酶基因的质粒
[0071 ] pEASY-BLUNT-simple-pga-z j5a 为本发明人实验室构建；
[0072] 带有优化后聚半乳糖醛酸酶基因的质粒口1^57-8；[1]^16183-2」53-1111、口1]〇57- simple-pga-z j5a-m2、pUC57-simple-pga-z j5a-m3由本发明人设计，委托南京金斯瑞生物 科技公司合成。
[0073] 1.2培养基及其他溶液
[0074] LB培养基:0 · 5 % 酵母提取物，1 · 0 % 蛋白胨，1 · 0 % NaCl，pH 7 · 0，121°C 灭菌20min;
[0075] LB固体培养基:在液体LB中加入2 % (w/v)琼脂粉；
[0076] YH)液体培养基：1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，2 %葡萄糖，108 °C灭菌30min;
[0077] 13.4%YNB(无氨基酸酵母氮源）：称取134g YNB固体用少量的去离子水溶解后定 容到1000mL，0.22ym过滤除菌，4°C保存备用；
[0078] 0.02%生物素:称取20mg的生物素溶于100mL去离子水中，0.22μπι过滤除菌，4°C保 存备用；
[0079] MD固体培养基：1 · 34 % YNB，0 · 00004 %生物素，2 %葡萄糖，1 · 5 %琼脂糖，108 °C灭 菌30min;
[0080] lmo 1 /L山梨醇:将182 · 1 g D-山梨醇溶于1 OOOmL水中，0 · 22μπι过滤灭菌，4Γ保存。
[0081 ] BMGY培养基：1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，磷酸缓冲液（pH 6.0)，1.34 % ΥΝΒ， 0 · 00004%生物素，1 %甘油(v/v);
[0082] ΒΜΜΥ培养基：1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，磷酸缓冲液（pH 6.0)，1.34 % ΥΝΒ， 0.00004%生物素，0.5%甲醇；
[0083] 1.3聚半乳糖醛酸酶野生型基因和优化基因酵母重组表达载体的构建
[0084] 分别提取pEASY-BLUNT-simple-pga-zj5a、pUC57-simple-pga-zj5a-ml、pUC57- simple-pga-zj5b-m2、pUC57-simple-pga_zj5a_m3和pPIC9质粒，并分别用EcoR I(SnaB I) 和Not I对这5个质粒进行双酶切处理，分别将聚半乳糖醛酸酶野生型基因 pga_zj5a及3个 优化基因，及表达载体PPIC9酶切产物进行回收并连接，通过酶切和测序对阳性克隆进行鉴 定，由此分别构建了酵母重组表达载体pPIC9-pga_z j5a和pPIC9-pga_z j5a-ml、pPIC9-pga- zj5a_m2和pPIC9_pga_zj5a_m3(图9)。
[0085] 1.4聚半乳糖醛酸酶野生型基因及其优化基因在毕赤酵母中的表达
[0086]将验证正确的重组质粒用限制性内切酶Sal I进行线性化，经线性化后的质粒片 段经乙醇沉淀后用电击转化仪转化至P. pastor is GS115感受态细胞，涂布到MD平板上，倒 置于28 °C培养箱中培养2天。
[0087] 1.5产聚半乳糖醛酸酶重组毕赤酵母在摇床水平的筛选
[0088]从MD平板上挑取单克隆，点到对应标号的MD平板上;将MD平板置于28°C温箱里培 育48h。选择正常成长的转化子接种于含有600yL BMGY培养基的多孔板中，放在28°C、 200rpm摇床上培育48h;把摇床培育48h后的菌液放在5000r/min离心5min，除去上清液，各 孔添加600yL BMMY培养基，放置在28°C、200rpm诱导培育。每隔12h后补加一次甲醇(补加量 为使体系中甲醇终浓度达到〇 . 5% )，诱导培育48h后，把得到的菌液放置在5000r/min离心 10min，取上清液测定酶活性，从中筛选出具有聚半乳糖醛酸酶活性的转化子。
[0089] 把最初筛选的有聚半乳糖醛酸酶活性的转化子，再次进行复筛。把上述转化子接 种于含有l〇mL BMGY培养基中，28°C，200rpm摇床培育48h，5000r/min离心5min，除去上清， 添加5mL BMMY甲醇诱导培养基重新悬浮后，28°C，200rpm摇床培养，每隔12h补加一次甲醇 (补加量为使体系中甲醇终浓度达到〇. 5 % )，诱导48h后，5000r/min离心10min，取上清液检 测聚半乳糖醛酸酶活力。
[0090] 1.6聚半乳糖醛酸酶重组毕赤酵母的发酵
[0091] 选取复筛中酶活力最高的转化子，研究其在发酵装置里聚半乳糖醛酸酶的表达水 平。选取各转化子的单个菌落接种在50mL YPD液体培养基中，在28°C摇床上培养12h。将其 全部转入含有200mL YH)液体培养基中，28°C，200rpm培养24h，然后将其全部接入3L发酵罐 中，初始培养基装液量为2000ml，在28 °C，1000r/min发酵培养，发酵罐参数设置为pH5.0，温 度30°C，通风比为2:1。培养16小时后，补加碳源(400ml的25%葡萄糖），6h后，开始进行混饲 阶段（100ml的25 %葡萄糖+12.5ml甲醇），混饲4h后，开始流加甲醇，进入诱导产酶阶段。开 始诱导后，每隔12h取发酵样品测定聚半乳糖醛酸酶活力，酶活力随着诱导时间的延长而增 加，当酶活开始下降时，停止发酵，将发酵液离心（l〇〇〇〇r/min，10min，4°C)，收集上清酶液。 [0092] 1.7聚半乳糖醛酸酶活力的测定方法
[0093]聚半乳糖醛酸酶能够分解低酯化果胶或聚半乳糖醛酸为寡聚半乳糖醛酸，产物相 对于底物的还原性增加，因此利用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法测定此酶的活力。一个酶活力 单位(1U)定义为在测定条件下，每分钟释放Ιμπιο? D-( + )半乳糖醛酸所需要的酶量。
[0094] 酶活测定方法:450μ1 0.2%底物(聚半乳糖醛酸）和50μ1酶液(适当稀释)在40°C 反应lOmin，加入750yL DNS溶液终止反应;对照组先加450μ1 0.2%底物和750μ1 DNS终止 液反应lOmin，最后加50μ1酶液(适当稀释）。将反应混合物置沸水浴中5min显色，冷却至室 温，在540nm处测其吸光值。通过标准曲线计算聚半乳糖醛酸酶活力。
[0095] 2、实验结果
[0096] 分别筛选了转聚半乳糖醛酸酶野生型基因（Pga-zj5a)和优化基因（pga-zj5a-ml， pga-z j5a_m2，pga-z j5a_m3)的酵母转化子各120株。其中，挑选出转pga-z j5a的酶活最高的 菌株，其在摇瓶水平下聚半乳糖醛酸酶活力为1204U/mL;转pga-z j5a-ml的菌株最高酶活力 为976U/mL，转pga-zj5a_m2的菌株最高酶活力为1778U/mL，转pga-z j5a-m3的菌株最高酶活 力为1316U/mL。转pga-z j5a_m2的菌株的酶活力显著高于转pga-z j5a、pga_z j5a_ml、pga_ z j5a_m3的菌株。
[0097] 从3L发酵罐中的表达水平可以看出（如图10所示），转野生型基因的酵母转化子 口区&-2」5&在甲醇诱导12011后聚半乳糖醛酸酶的活力达到最高为104361]/1]11^，而转。83-2」5&- m2的酶活诱导120h后则达到了 15428U/mL，同野生型相比提高了48%。但优化基因 pga- zj5a-ml发酵水平仅为8572U/ml，与野生型相比降低了17.9%;pga-zj5a-m3的发酵水平为 10527U/ml，与野生型相比无显著变化。
[0098] 试验例3重组聚半乳糖醛酸酶的纯化和应用
[0099] 1、实验方法
[0100] 1.1重组聚半乳糖醛酸酶的纯化
[0101] 将收集的上层发酵液离心（10000r/min，10min，4°C)去除细胞碎片和不溶解杂质。 上清悬浮液用〇. Ιμπι的微滤膜去除残留的菌体，再用ΙΟ-kDa的超滤膜进行超滤，除去盐分和 色素，便得到粗酶液。使用ΝΤΑ0缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 6.5,0.5M NaCl，10%甘油)预平 衡His-tag镍离子亲和层析柱，将粗酶液载入此预平衡的层析柱，之后用NTA500缓冲液 (20mM Tris-HCl，pH 6·5,0·5Μ NaCl，10% 甘油，0.5M 咪唑）以 4mL/min 的洗脱速率线性洗 脱，收集不同峰的洗脱液;对所有的洗脱液进行酶活测试，将有大量酶活的洗脱液浓度设定 为洗脱目的蛋白的标准；用此浓度的洗脱液对酶液进行纯化，收集后进行酶活测定，所有的 纯化步骤都在4°C下操作，通过SDS-PAGE检测蛋白纯化效果。
[0102] 1.2重组聚半乳糖醛酸酶在梨汁中的应用
[0103] 将新鲜的雪梨去核后切块，称取700g后放入榨汁机中榨汁，并添加3.5g的抗坏血 酸溶液。榨汁后果浆用8层纱布过滤除去果肉残渣得到实验用果汁。为检测不同添加量的酶 液在梨汁中的应用效果，取50mL的梨汁，添加酶液使其终浓度为0、1、2、5、10U/mL果汁，在40 °C处理lh。以不添加酶的梨汁为空白对照。处理完后，用滤纸过滤酶处理的梨汁，并测量前 2min内所得梨汁的滤液体积。过滤完后，用分光光度计测其在波长为660nm处的光穿透率。 [0104] 为了验证重组聚半乳糖醛酸酶在不同时间下对梨汁的应用效果，以5U/ml果汁为 重组酶添加量，测量不同反应时间（15111；[11，30111；[11，60111；[11，90111；[11，120111；[11)下梨汁的出汁率和 光穿透率。其处理梨汁的方法如上所述，以不添加酶的梨汁为空白对照。
[0105] 2、试验结果
[0106] 发酵液经离心后取上清，经过超滤浓缩以及亲和层析纯化后，得到电泳纯的重组 聚半乳糖醛酸酶。经SDS-PAGE分析（图11)，纯化的酶有2条分子量大小相近的带（41kDa左 右），大于理论上的蛋白分子量37kDa。用糖苷水解酶(Endo-H)对重组聚半乳糖醛酸酶脱糖 基化后，只显示出一条蛋白条带，此为电泳纯的重组聚半乳糖醛酸酶。
[0107] 将新鲜榨取的梨汁在40°C用不同浓度的重组聚半乳糖醛酸酶(0，1，2，5，10U/mL果 汁)处理lh后，梨汁的出汁率最大可提高41.8%，光穿透率提高了大约3倍（图12)。另外，以 5U/mL果汁作为酶液添加量，检测了不同反应时间下聚半乳糖醛酸酶对梨汁出汁率和澄清 度(光穿透率)的影响（图13)。结果表明，反应120min时，添加聚半乳糖醛酸酶的梨汁的穿透 率相比反应15min中的57.4%提高到了94.3%;梨汁的出汁率从6.061^(1511^11)提高到了 10.37111以12〇111丨11)，提高了71.12%。
[0108] 由此可见，黑曲霉来源的聚半乳糖醛酸酶在果汁加工等领域有重要的应用潜力， 其基因经多种策略的序列优化后，多个优化基因中，优化基因 pga-zj5a-m2(SEQ ID N0.3) 在毕赤酵母中的分泌表达水平显著提高，而其他优化基因仍不能提高表达水平(pga-zj5a_ m3)，甚至下降(pga-z j5a-ml)。与国内外研究比较，本发明重组聚半乳糖醛酸酶的最终表达 量达到较高的表达水平，为进一步工业化扩大生产奠定了基础。
【主权项】
1. 聚半乳糖醛酸酶优化基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 或SEQ ID NO .4所示。2. 按照权利要求1所述的聚半乳糖醛酸酶优化基因，其特征在于：所述核苷酸序列为 SEQIDN0.3**。3. 含有权利要求1或2所述聚半乳糖醛酸酶优化基因的重组表达载体。4. 根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组表达载体是重组真核表 达载体。5. 按照权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组真核表达载体是重组酵 母表达载体;优选的，所述重组真核表达载体是重组毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载 体。6. 含有权利要求3-5任何一项所述重组表达载体的宿主细胞。7. 按照权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于:所述的宿主细胞为酵母细胞;优选的， 所述的宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。8. 权利要求1或2所述的聚半乳糖醛酸酶优化基因在制备聚半乳糖醛酸酶中的应用。9. 按照权利要求8所述的应用，其特征在于，包括:将权利要求1或2所述的聚半乳糖醛 酸酶优化基因可操作性的与表达载体相连接得到重组表达载体;将所述重组表达载体转化 宿主细胞，得到重组菌株;培养重组菌株，诱导重组聚半乳糖醛酸酶的表达，回收并纯化所 表达的聚半乳糖醛酸酶。10. 按照权利要求9所述的应用，其特征在于:所述的重组表达载体为重组真核表达载 体，优选为毕赤酵母表达载体;所述的宿主细胞为酵母细胞，优选为毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)〇
【文档编号】C12N9/26GK105838728SQ201610319841
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】张宇宏, 王姣姣, 张伟, 刘波, 徐欣欣
【申请人】中国农业科学院生物技术研究所