一种羰基还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及其应用
【专利说明】-种嚴基还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及其应用 (-)技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种来源于唐营蒲伯克霍尔德氏菌 炬urldiolderia gladioli)ZJB-12126的撰基还原酶基因、编码酶、含有该基因的重组载体、 该重组载体转化得到的重组基因工程菌W及在催化不对称还原前手性撰基化合物中的应 用。 (二）【背景技术】
[0002] 撰基还原酶（Carbonyl reducatase, E. C. 1. 1. 1. X)是一类能够催化醇和酵/丽 之间双向可逆氧化还原反应的酶类，并且需要辅酶NAD(H)(烟醜胺腺嘿岭二核巧酸）或 NADP (H)(烟醜胺腺嘿岭二核巧酸磯酸）作为氨传递体。NADH和NADPH作为电子供体参与 其还原反应，NAD和NADP则作为电子受体参与其氧化反应。目前根据文献报道的撰基还 原酶大多属于短链脱氨酶超家族（Sho;rt-chaindehy化ogenase/reductase, SDR)、中链醇氨 酶超家族（Medium-chaindehy化ogenase/reductase, MDR)、酵丽还原酶超家族（Aldo-keto re化ctase，AKR)。虽然H者具有相似的催化功能，但在进化和结构上差异较大。撰基还原 酶是一类非常古老的家族，广泛分布于自然界中，在各类动物、微生物和植物中，由于微生 物种类繁多、分布广，是撰基还原酶的主要来源。
[0003] 近年来，随着基因组学、蛋白质组学和生物信息学的迅速发展，基因组和基因序 列数据库中公布的基因数据的迅速增长，从大量的数据资源中寻找新型的撰基还原酶基 因、挖掘其蕴含的生物学信息，为新型高效生物催化剂的开发服务已经成为现实。基因 挖掘技术是一项新型酶筛选技术，目前已得到广泛地应用。利用基因挖掘已从Pichia finlandica PfODH、Clostridium 1jungdahlii BDHl、Candida glabrata CgKRUSerratia quinivorans SQ_SDR、Polygonum minus PmADH、Arabidopsis thaliana AtADH、0enococcus oeni Adh3、Chryseobacterium sp. ChKRED20、Candida magnoliae CmCR W及 Acetobacter sp.AcCR等菌株中挖掘了大量的撰基还原酶。其中部分撰基还原酶的基因已在不同的宿主 (Escherichia coli、Pichia pastoris、Arxula adeninivorans 等）中成功表达，获得产酶 活力和选择性较高的基因工程菌，并成功应用于催化撰基类化合物的不对称还原反应。尽 管如此，许多撰基还原酶具有底物特异性，大大限制了其应用范围。此外，许多酶的催化效 率较低，也限制了其工业化应用。筛选具有较宽底物谱的新型撰基还原酶，研究其可W高效 高选择性催化的撰基化合物，不仅可W拓宽其应用范围，提升其应用潜力，也为实现工业化 生产奠定基础。
[0004] 手性醇广泛应用于手性药物和其他手性精细化学品的合成。目前手性醇的合成方 法包括物理分离法、拆分法W及不对称还原法等。其中，利用前手性撰基化合物的不对称还 原合成手性醇，其理论产率达100%，是目前生产手性醇的一种主要方法。化学不对称还原 法主要是利用手性金属配合物作为催化剂用于撰基的不对称还原，虽然该化学方法已部分 用于工业生产，但是该反应条件比较苛刻、手性金属配合物合成复杂并且价格昂贵，产物中 有重金属的残留导致产物分离困难，环境污染较大，因此其应用受到了一定的限制。生物催 化不对称还原法不仅具有高度的化学、区域和立体选择性，并且反应条件温和，避免了产物 中的重金属残留，对环境友好，弥补了化学方法的不足，因此，近年来生物催化的撰基不对 称还原反应在手性醇合成中的应用越来越受到重视。
[0005] (2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-羟基下酸醋是合成碳青霉帰和青霉帰类药物中间 体4-己醜氧基氮杂环下丽（4-AA)的手性硕块。目前获得（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-轻 基下酸醋中间体的主要途径是W手性催化剂（R)-BINAP-Ru配合物不对称催化2-苯甲醜 氨甲基-3-丽下酸醋生成（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-羟基下酸醋。但由于该反应条 件需要高压加氨、金属钉配合物的价格比较昂贵并且与产物的分离较为困难等，不利于其 工业化应用。目前生物催化法合成（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-羟基下酸醋报道较少。 Saccharomycopsis malanga NBRC 171096 催化生成（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-羟基 下酸醋，并具有较高的对映选择性（对映体过量值ee〉96. 2%)，但是催化效率低（产率仅 4% )。美国专利US20130034895研究了来源于Lactobacillus kefir的撰基还原酶催化合 成（2S，3R)-2-苯甲醜氨甲基-3-羟基下酸醋，具有较高的对映选择性（ee为60~99 % )， 但在该反应过程中，W异丙醇作为第二底物实现辅酶循环利用，由于异丙醇与底物存在竞 争性抑制作用，导致最大转化率受到影响，并且副产物丙丽的生成对酶有一定的损害作用。
[0006] 6-氯基-(3R，5R)-二羟基己酸叔下醋是HMG-CoA酶抑制剂阿巧伐他汀类药物 的手性中间体，可W通过化学合成和生物催化合成的方法获得。在化学法合成中需要使 用易燃易爆的正下基裡、测焼，并且需要在<-65°C低温条件下进行，能耗大，再加6-氯 基-(3R，5R)-二羟基己酸叔下醋非对映诱导不充分，产物的光学纯度难W达到要求。近年 来，利用酶法代替化学法改善反应条件，降低反应成本，提高产物的选择性成为研究的热 点。目前已筛选到的高立体选择性催化（时-6-氯基-5-羟基-3-撰基己酸叔下醋生成6-氯 基-(3R, 5R)-二羟基己酸叔了醋的菌株有；Saccharomyces cerevisiae、Pichia angusta、 Pichia haplophila> Beauveria bassiana> Pichia pastoris> Pichia membranefaciens、 Candida humicola、Kluyveromyces drosophilarum、Rhodotorula glutinis 和 Pichia caribbic 等。Codexis 公司专利 US7879585B2 从 Saccharomyces cerevisiae 中克隆了一种 丽还原酶并进行了改造，催化生产6-氯基-(3R，5R)-二羟基己酸叔下醋转化率为99. 7%， de〉99%。
[0007] 贝氣沙通（Befloxatone)化学名5佩-(甲氧甲基）-3-[4-[4, 4, 4- S氣 基-3 (时-羟基下氧基]苯基]嗯哇焼丽-2,是一种强选择性可逆性单胺氧化酶A (MA0-A) 抑制剂，与M0-A黄素腺嘿岭二核巧酸（FAD)辅因子及活性位点的特异氨基酸相互作用， 临床上用来治疗抑郁症。（时-4, 4, 4- H氣-3-羟基下酸己醋是合成贝氣沙通的手性中间 体。aiang等首先报道了菌株Bacillus pumilus化e-C3中含有NADPH依赖型撰基还原酶 和葡萄糖-6-磯酸脱氨酶佑-6-PDH)，能催化4, 4, 4-H氣己醜己酸己醋生成（时-4, 4, 4-H 氣-3-羟基下酸己醋，底物浓度为60mM时，产率达67%，ee达95%。化等人筛选到一株 Saccharomyces uvarum SW-58,并利用水-有机溶剂两相体系催化4, 4, 4-H氣己醜己酸己 醋生成（时-4,4, 4-H氣-3-羟基下酸己醋，底物浓度为0.2mM时，化后转化率达85%，ee 达85. 2%。Kara等人利用商品酶ADH evo-1. 1.200催化该反应，底物浓度为5mM，2化后转 化率39. 2%，选择性有了明显的提高（ee〉99. 9%)。此外，（S)-4,4, 4-H氣-3-羟基下酸 己醋也是一种重要的手性中间体，其生物催化法不对称合成未见报道。
[0008] 由此可见，研究该些药物手性中间体的生物催化工艺具有重要意义，不仅能为该 些化合物的合成提供新的路线，又能为其提供新的酶源。迄今为止，仍未见Bur化olderia gladioli菌株中的撰基还原酶在该些药物手性中间体不对称还原中的应用。 (H)
【发明内容】
[0009] 本发明目的是提供一种来源于唐营蒲伯克霍尔德氏菌炬ur化olderia gladioli) ZJB-12126撰基还原酶、基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工 程菌，W及在制备（2S，3R) -2-苯甲醜氨甲基-3-羟基下酸醋、（巧-4-氯-3-羟基下酸己醋、 6-氯基-(3R，5R)-二羟基己酸叔下醋W及4, 4, 4- H氣己醜己酸己醋等手性药物中间体中 的应用。