（时-6-氯基-5-羟基-3-撰基己酸叔下醋（式III)，3(rC，转速15化/ min条件下反应12h，反应结束后加入等体积己酸己醋萃取两次，合并有机层并用无水硫酸 镇干燥，过滤，旋转蒸发仪除去己酸己醋，浓缩物干燥即为6-氯基-(3R，5R)-二羟基己酸叔 了醋（式IV);所述重组撰基还原酶湿菌体用量为50g/L缓冲液、葡萄糖脱氨酶用量W含葡 萄糖脱氨酶的菌体经发酵培养获得的湿菌体用量计为50g/L缓冲液，葡萄糖用量为50g/L 缓冲液、NADP+用量为2mmol/L缓冲液，底物浓度20mmol/L缓冲液。
[0026] 进一步，所述底物为4, 4, 4- H氣己醜己酸己醋时，其反应式见图8所示，具体地， 上述应用的反应体系为：W含重组撰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催 化剂，W磯酸钟缓冲液（lOOmM，pH 7.0)为反应介质，加入葡萄糖脱氨酶、葡萄糖、NADP+，底 物4, 4, 4- H氣己醜己酸己醋（式V)，3(TC，转速15化/min条件下反应12h，反应结束后加 入等体积己酸己醋萃取两次，合并有机层并用无水硫酸镇干燥，过滤，旋转蒸发仪除去己酸 己醋，浓缩物干燥即为（S)-4, 4, 4-H氣-3-羟基了酸己醋（式VI);所述重组撰基还原酶 湿菌体用量50g/L缓冲液、葡萄糖脱氨酶用量W含葡萄糖脱氨酶的菌体经发酵培养获得的 湿菌体重量计为50g/L缓冲液、葡萄糖用量为50g/L缓冲液、NADP+用量为2mmol/L缓冲液、 底物浓度20mmol/L缓冲液。
[0027] 本发明所述催化剂还包括撰基还原酶BgAD册纯酶、粗酶液或者粗酶粉等其他形 态。采用撰基还原酶重组基因工程菌作催化剂时，需结合一种辅酶循环系统，包括葡萄糖 /葡萄糖脱氨酶（GDH)、甲酸/甲酸脱氨酶（抑H)等双酶双底物辅酶循环系统W及己醇、异 丙醇等单酶双底物辅酶循环系统。通常加入辅助底物代替MD (P) H进行反应，常用的辅助 底物为；葡萄糖10~200g/L、己醇或异丙醇2~30% (v/v，占总转化体系的质量体积百分 数）；较佳的菌体浓度为20~200g/L。
[002引能够提供本发明所述撰基还原酶基因的唐营蒲伯克霍尔德氏菌 炬uridiolderiagladioli)ZJB-12126,保藏编号为CCTCC M 2012379,保藏于中国典型培养 物保藏中也，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2012年9月25日，已在先前的专 利申请（CN103045504A)中披露。
[0029] 本发明的有益效果主要体现在；本发明提供了一种来源于唐营蒲伯克霍尔德氏菌 炬urldiolderia gladioli)ZJB-12126的撰基还原酶基因，该撰基还原酶基因可与表达载体 连接构建得到含该基因的表达重组质粒祀T28a-a化5,再转化至大肠杆菌化21 0E3)中，获 得重组大肠杆菌，该大肠杆菌含有重组撰基还原酶，可W利用重组大肠杆菌作为生物催化 剂进行生物催化反应，为药物手性中间体的生物催化合成提供了可供选择的新酶源。
[0030] 重组撰基还原酶BgAD册作为生物催化剂，W 2-苯甲醜氨甲基-3-丽下酸醋为 底物制备（2S，3时-2-苯甲醜氨甲基-3-羟基下酸醋，产物ee〉99 %，1化底物转化率为 51.4%，与 CN103045504A 中 B. gladioli ZJB-12126 野生菌相比（ee 81%)，对映选择性得 到了提高。W (时-6-氯基-5-羟基-3-撰基己酸叔下醋为底物制备6-氯基-(3R，5R)-二 羟基己酸叔下醋时，产物de为98%，1化底物转化率为87. 4%。与专利US7879585B2中的 Saccharomyces cerevisiae野生型丽还原酶YDL(反应时间2化，转化率85% )相比，转化 率有了一定的提高。W 4, 4, 4-H氣己醜己酸己醋为底物时，也可W进行转化反应制备相应 的（S)-4,4, 4-H氣-3-羟基下酸己醋，ee〉99%，l化底物转化率为88. 4%。虽然生物不对 称还原法合成（时-4, 4,4-H氣-3-羟基下酸己醋的已有报道，但（S)-4, 4,4-H氣-3-轻 基下酸己醋的生物法不对称合成未有报道。 (四）
【附图说明】
[0031] 图1为克隆载体pGEM-T-a化5物理图谱；
[0032] 图2为祀T28a-a化5重组质粒物理图谱；
[0033] 图3为撰基还原酶基因PCR扩增低烙点琼脂糖凝胶（argrose)电泳图；其中，泳道 1为化2000DNA Marker ;泳道2为利用引物1和引物2扩增得到的撰基还原酶基因片段；泳 道3、4为利用引物3和引物4扩增得到的撰基还原酶基因片段。
[0034] 图4阳性重组质粒祀T28a-a化5的酶切结构图；其中，泳道1为化10000DNA Marker片段；泳道2为撰基还原酶基因；泳道3为祀T28a-a化5/化0 I样品；泳道4为 祀T28a-a化5/化〇 I样品；泳道5为祀T28a-a化5/化0 I and化〇 I样品；
[003引 图5为撰基还原酶纯化后的SDS-PAGE图；泳道1为蛋白质分子量Marker,泳道2、 3为纯化后的撰基还原酶BgAD册。
[0036] 图6为（2S，3时-2-苯甲醜氨甲基-3-羟基下酸醋合成方程式。
[0037] 图7为6-氯基-(3R，5R)-二羟基己酸叔下醋合成方程式。
[0038] 图8为（S)-4, 4, 4- H氣-3-羟基下酸己醋合成方程式。 (五）
【具体实施方式】
[0039] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0040] 实施例1 ;撰基还原酶基因a化5的扩增
[0041] 根据唐营蒲伯克霍尔德氏菌炬urldiolderia gladioli)ZJB-12126全基因组测 序信息，挖掘其中大量的撰基还原酶，其中一个具有催化2-苯甲醜氨甲基-3-丽下酸醋、 (时-6-氯基-5-羟基-3-撰基己酸叔下醋和4, 4, 4- H氣己醜己酸己醋生成（2S，3R) -2-苯 甲醜氨甲基-3-羟基下酸醋、6-氯基-(3R，5R)-二羟基己酸叔下醋W及（S)-4, 4, 4- H 氣-3-羟基下酸己醋功能的酶为本发明涉及的撰基还原酶BgAD册。
[0042] 利用MPBio公司的FastDNA⑧Spin试剂盒提取唐营蒲伯克霍尔德氏菌 炬urldiolderia gladioli) ZJB12126菌体的总基因组DNA, W该基因组DNA为模板，在引物 1(5, -ATGGCAGACGTCAACAGCCTGTTC-3,）、引物 2(5, -TCAGACCGTGCTGGTGAGGCC-3,）的作用 下进行 PCR 扩增。PCR 反应体系（总体积 50 uL) : 10 XPfu DNA Polymerase Buffer 5 uL， lOmM dNTP mixture (dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 2. 5mM) 1 y L，浓度为 50 y M 的克隆引物 1、 引物 2 各 luL，基因组 DM lyL，Pfu DM Polymerase luL，无核酸水 40yL。
[0043] 采用Biorad的PCR仪，PCR反应条件；预变性95°C 5min，95°C变性30s，60°C退火 45s，72°C延伸Imin，共30个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0044] PCR反应液用0. 9%琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段，利用化姐NA聚 合酶向片段5'端引入碱基A。在T4DNA连接酶作用下将该片段同pGEM-T载体进行连接，得 到克隆重组质粒pGEM-T-a化5,见图1。将该重组质粒转化至大肠杆菌JM109中，涂布于含 有终浓度为50 y g/ml氨予青霉素轴抗性的LB平板，随机挑取阳性克隆测序，利用软件分析 测序结果，结果表明；经引物1和引物2扩增到的核巧酸序列长度为774bp (其核巧酸序列 如SEQ ID NO ;1所示），该序列编码一个完整的开放阅读框（氨基酸序列为SED ID NO. 2)。
[0045] 实施例2 ;重组大肠杆菌化21 0E3) /祀T28a-a化5的构建
[0046] 根据实施例1分析结果设计引物3 (5' -CCATGGCAGACGTCAACAGCCTGTTC-3')、引物 4巧' -CTCGAGGAC
[0047] CGTGCTGGTGAGGCC-3'），并分别在引物3和引物4中引入了化0 I和化〇1限制性 酶切位点（下划线标记）。在引物3和引物4的引发下，利用高保真P化DNA聚合酶进行扩 增，获得长为774bp的撰基还原酶基因序列（其核巧酸序列如SEQ ID N0;1所示），测序 后利用化0 I和化0 I限制性内切酶（TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连接 酶（TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体祀T28a(Invitrogen