小麦中一个NAC转录因子基因TaNACs及其表达载体和应用
【技术领域】
[OOOU 本发明属于基因工程领域，公开了小麦中一个NAC转录因子基因TaNACs及其表达 载体和应用。
【背景技术】
[0002] 小麦（Triticum aestivum)的整个生育期受到多种病虫的危害，其中小麦白粉病 是由小麦白粉病菌炬lurmeria graminis f. sp. tritici，Bgt)引起的真菌性病害。由于小 麦白粉病菌生理小种多、毒力变异快，一旦产生新的毒性小种或小种种群发生变化，会导致 小麦白粉病的大爆发，给农业生产带来灾难性后果。广谱、持久抗病基因的发掘和利用对白 粉病防治具有重要意义。
[000引来自簇毛麦化aynaldia villosa，化=2x = 14, VV)的广谱抗白粉病基因化21 定位于6V染色体短臂上。南京农业大学细胞遗传研究所利用四倍体圆锥小麦与二倍体簇 毛麦杂交，再与普通小麦回交多代后，选育出了普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系92R137， 将含有化21基因的6VS导入普通小麦。92R137自1994年进入国内育种利用W来，在白粉 病常发区进行了多年种植，对白粉病表现出了广谱、高抗特性，W之为亲本已经选育出一批 高抗白粉病的小麦新品种，化21在育种中得到广泛应用。分析化21介导的广谱抗性机理 和克隆其抗病途径中的基因对于利用基因工程手段培育具有白粉病广谱抗性的小麦品种 具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一个NAC转录因子基因TaNACs的 表达载体和应用。
[0005] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0006] NAC转录因子基因TaNACs来自普通小麦（Triti州m asetivum L.)南农9918,其 核巧酸序列为SEQ ID NO. 1。
[0007] 该NAC转录因子基因的蛋白质为TaNACs,其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
[000引 含有所述的NAC转录因子基因TaNACs的重组表达载体地1220:TaNACs。
[0009] 所述的NAC转录因子基因TaNACs的重组表达载体优选W地1220为出发载体，将 TaNACs基因插入地1220的BamHI和化nl酶切位点间所得。
[0010] 所述的NAC转录因子基因TaNACs的表达载体在构建抗白粉病小麦品种中的应用。
[0011] 有益效果：
[001引本发明从小麦中克隆得到了一个NAC转录因子基因TaNACs及其所编码的蛋白质 TaNACs,将其插入表达载体地1220,得到的该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可 W提高感白粉病小麦品种对白粉病的抗性。TaNACs的超量表达载体用于基因工程育种，将 其导入易感白粉病小麦品种中，能够获得具备白粉病抗性的小麦种质。
【附图说明】
[0013] 图1地I220:TaNACs超量表达载体图谱
[0014] 图2与白粉菌互作的表达GUS基因的表皮细胞
[0015] A图：白粉菌侵入GUS表达的表皮细胞后未形成吸器；B图：白粉菌侵入GUS表达 的表皮细胞后形成吸器；其中，CO:分生抱子；PP:侵入钉；ha:吸器；hy:菌丝
[0016] 图3利用瞬间表达研究TaNACs基因对吸器形成的影响和抗白粉病效应
【具体实施方式】
[0017] 实施例1含有化21基因的南农9918中一个NAC转录因子基因TaNACs的克隆
[0018] 南农9918是南京农业大学细胞遗传所育成的含有广谱抗白粉病基因Pm21的小麦 品种（公知公用），扬麦158是江苏里下河地区农科所育成的高感小麦白粉病的推广品种 (公知公用）。为了筛选南农9918受白粉菌诱导表达的基因，采用高通量测序的方法获得 抗条诱病小麦南农9918与感条诱病小麦扬麦158中的数字基因表达谱，并在此基础上筛选 抗感材料中的差异表达基因。具体流程如下；将抗白粉病小麦南农9918的种子和感条诱 病小麦扬麦158的种子播于培养皿中发芽，露白后移栽到盆鉢，一叶期把从感白粉病小麦 材料上捜集的白粉菌抱子接种到苗上进行诱导，并于接种后前和接种后24小时取样，分别 提取RNA (用Invitrogen公司的Trizol试剂提取），形成测序样本；R24(南农9918诱导 24小时的样品）、R0 (南农9918非诱导样品）、S24(扬麦158诱导24小时的样品）、S0 (扬 麦158非诱导样品）。四个RNA送交北京六合华大基因科技股份有限公司进行数字基因表 达谱的测序。样品间数据的比较，包括R24 VS R0, S24 vsSO, R24 VS S24，W测序条数的 比值大于2为标准，筛选在南农9918中诱导上调表达的基因。其中一个差异表达基因为 Ta#S52545630,该基因是一个NAC转录因子基因，该基因在R24与R0比较时显示为差异表 达基因，即在抗病南农9918中该基因受白粉菌诱导表达；在S24与SO比较时显示为非差异 表达基因，即在感病扬麦158中该基因非白粉菌诱导表达基因；在R24与S24比较时显示为 差异表达基因，即在抗病南农9918与感病扬麦158中该基因的表达存在差异。基于数字基 因表达谱的分析，初步判断化#S52545630与白粉病抗性具有密切相关性。
[0019] W南农9918经白粉菌诱导12小时的叶片提取出的RNA反转录 成cDNA为模板、W根据数字基因表达谱筛选的基因化#S52545630设计的引物 P1 (ACTACAGCGAGGTTTGTTGG, SEQ ID NO. 3)和 P2(GAACGCTTTGAAGCATCTTG,沈Q ID NO. 4)为 引物进行RT-PCR，获得了 h#S52545630基因的cDNA全长片段。对该基因片段进行测序和比 对，发现该基因为NAC转录因子基因，与化#S52545630序列一致，命名为TaNACs。对TaNACs 进行生物信息学分析，发现0RF(开放阅读框）900bp，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，编 码299个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，在NCBI中Blast保守区域分析，发现该 基因的氨基酸序列N端9至134位置包含有一个NAC结构域，在NAC结构域中包含有A、B、 C、D、E共5个功能结构域。
[0020] 实施例2 TaNACs基因瞬间表达载体的构建
[002U W经白粉菌诱导的南农9918中克隆的TaNACs基因cDNA为模板，使用引物对TaNA Cs-BamHI-F(cgcGGATCCATGAGCGGCGGACAGGAGCT，SEQ ID NO. 5)和TaNACs-KpnI-R(cggGGTAC CTTAGAACGGCTTGCCCCAGT，SEQ ID NO. 6)进行 PCR 扩增，回收扩增片段。用 BamHI 和 Kpnl 对 扩增产物进行双酶切，将酶切产物插入到BamHI和化nl双酶切后的载体地1220 (Jefferson RA, Kavanagh TA,Sevan MW. GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in hi曲er plants