一种烟草甾醇合成相关转录因子bHLH93基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一个烟草留醇合成相关转录因子 bHLH93基因及应用。
【背景技术】
[0002] 植物留醇是生物膜系统的重要组成成分，其除了调控植物的生长发育，还能响应 多种生物和非生物胁迫。烟草中常见的留醇类物质主要有胆留醇、菜油留醇、豆留醇和 谷留醇等。植物留醇经由异戊二烯代谢途径合成，目前烟草中对于留醇调控的研究主要 集中在异戊二烯代谢途径中编码关键酶的基因上，对于调控留醇合成相关的转录因子研究 的较少。所以探寻烟草中留醇合成相关转录因子，对于进一步研究留醇合成的转录调控有 着重要的意义。
[0003] 目前研究植物功能基因主要方法有通过根癌农杆菌稳定的遗传转化和通过RNA 病毒介导瞬时基因沉默系统（VIGS)。由于稳定表达系统周期较长，并且获得的转基因植株 往往含有一个或多个的外源基因拷贝，所以通过农杆菌介导的稳定遗传的方法获得的转基 因植株外源基因的表达往往不稳定。利用病毒介导VIGS技术是近年来发现的转录后基因 沉默技术，其可以快速高效的对目的基因进行沉默。目前由烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV)介导的VIGS在马铃薯、棉花及烟草等草本植物中都有广泛的应用。烟草作为 重要的模式植物，留醇合成的研究对于其他植物也具有重要的借鉴意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种烟草留醇合成相关转录因子bHLH93基因及其在调控叶 片中甾醇含量的应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] -种烟草留醇合成相关转录因子bHLH93基因，所述bHLH93基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 所示。
[0007] 所述bHLH93基因是通过同源克隆的方法得到的。
[0008] -种烟草留醇合成相关转录因子bHLH93基因在调控烟草留醇含量中的应用，基 于bHLH93基因序列，根据干扰载体引物设计原则设计引物，构建烟草bHLH93基因干扰载 体，并通过VIGS (virus induced gene silencing)实验鉴定该转录因子的功能，发现其可 以调控叶片中甾醇的含量。
[0009] 所述烟草NtbHLH93基因干扰载体是由酶切后的bHLH93基因 PCR片段和TRV2病 毒空载体连接，转化感受态，并测序验证而得。
[0010] 所述PCR所用引物为：
[0011] NtbHLH93-VIGS 上游引物如 SEQ ID NO :2 所示；
[0012] NtbHLH93-VIGS 下游引物如 SEQ ID NO :3 所示。
[0013] 所述酶为两种限制性内切酶Nco I和Sac I。
[0014] 所述VIGS实验是通过农杆菌介导的病毒侵染实现。
[0015] 本发明的有益效果是：本发明所述的基因 NtbHLH93被沉默后，烟草叶片中留醇特 别是豆留醇的含量明显降低，其含量的降低，可作为烟草留醇调控领域的应用。
【附图说明】
[0016] 图1为基因 NtbHLH93沉默表型图，其中Con为注射侵染缓冲液的对照，TRV为注 射携带TRV2空载体菌液的对照；NtbHLH93为携带NtbHLH93基因 TRV2载体菌液的试验组。
[0017] 图2为基因 NtbHLH93在VIGS体系中基因表达量，其中Con为注射侵染缓冲液的 对照；TRV为注射携带空载体菌液的对照；NtbHLH93为注射携带目的基因菌液的试验组。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。
[0019] -、烟草总RNA提取和反转录合成cDNA
[0020] 1.提取移栽后4周的红花大金元叶样品的总RNA用于基因克隆，提取RNA所用的 研钵、药勺等均用95%酒精灼烧后使用。提取RNA所用的离心管和枪头等均是无 RNase产 品（AXYGEN)〇
[0021] 总RNA的提取按照Gene Answer RNA提取试剂盒说明书的提取步骤进行。
[0022] (1)取准备好的烟草幼叶样品（IOOmg)，在预冷的研钵中用液氮研磨彻底，转移到 I. 5ml离心管中；
[0023] (2)待液氮刚挥发完后，加入500 μ I RLT和50 μ I PLANTaid，剧烈涡旋混勾，并在 56°C 温育 3min ;
[0024] (3)将裂解液13000rpm离心5-10min，取上清380 μ L，加入190 μ L无水乙醇，吹打 混合均匀；将混合液全部转移到吸附柱RA上，13000rpm离心2min ;
[0025] (4)加入350 μ L RWl洗脱液，室温放置lmin，13000rpm离心lmin，弃滤液；
[0026] (5)加 DNase I 工作液 80 μ L 于膜中央，22°C，酶解 15min ;
[0027] (6)加入350 μ L RWl洗脱液，13000rpm离心lmin，弃去收集管；
[0028] (7)将离心柱转移到新的21111收集管上，加入50(^1^1^液，13000印111离心308，弃 滤液；
[0029] (8)加入500 μ L RW液到离心柱上，最大转速离心2min，13000rpm离心lmin，弃滤 液，空管13000rpm离心2min ;
[0030] (9)小心移去离心管，把离心柱连接到新的I. 5ml收集管上，加入30 μ L无 RNase 水（70°C )，室温静置2min，1000 Orpm离心lmin，洗脱RNA ;-80°C保存提取的RNA。
[0031] 2.烟草总RNA反转录合成cDNA
[0032] 使用宝生物 Prime ScripiiC 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒反转录合成 cDNA第二链，反应体系如表1所示：
[0033] 表1反转录体系
[0034]
[0035] 模板RNA与01 igo dT充分混合70 °C变性5分钟，后迅速置于冰上冷却5分钟，并 加入一定体积的5XRT buffer、dNTP、双蒸H2O和AMV，反应条件：42°C保温lh，放入75°C温 育15分钟灭活AMV逆转录酶，迅速取出置于冰上骤冷，终止cDNA第一链的合成，用于下一 步的PCR反应，剩余的cDNA保存于-20°C备用。
[0036] 二、bHLH93基因的同源克隆
[0037] 通过 Blast 分析（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)得到两条与拟南芥及番 茄bHLH93相似的烟草EST序列（GenBank登录号：FS420134和AM805227)，并对两条EST序 列进行拼接。根据基因的序列设计3对长度为20bp左右的特异引物（?1、？213)，分别为：
[0038] Pl 上游引物：5' -GATAGAGCCATTGTGGAGGA-3'，
[0039] Pl 下游引物：5,-CTACATCAAACTTTGGAGGG-3' ；
[0040] P2 上游引物：5, -TCTATTCACTTTTTGACGTT-3'，
[0041] P2 下游引物：5' -GATCTTCACGCAACCTGTG-3' ；
[0042] P3 上游引物：5, -ATGGAGCTCACTCAACAGG-3'，
[0043] P3 下游引物：5' -GCTCATGCGGCCGCTACAG-3'。
[0044] PCR反应体系25 μ L，包括一定体积的双蒸H20 9. 7 μ UPremixTaq 12. 5 μ L、上游 引物0. 4 μ L、下游引物0. 4 μ L和cDNA 2 μ L。反应程序：94°C预变性5min ;94°C变性30s， 58°(：退火3〇8,72°(：延伸60~9〇8,30个循环；72°(：延伸1〇1^11，4°(：保温。
[0045] 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA回收试剂盒（TaKaRa公司）回收目的基因。将 回收产物连接到克隆载体PMD19-T (TaKaRa公司）上；转化大肠杆菌（DH5a)感受态细胞 中，37°C培养，菌落PCR鉴定得到阳性克隆。利用小量质粒快速提取试剂盒（