一种枯草芽孢杆菌诱导性强启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体的，本发明涉及一种启动子、一种表达载体、一种 重组菌株、一种制备重组菌株的方法、一种利用枯草芽孢杆菌提高表面活性素产量的方法 和一种制备所述启动子的方法。
【背景技术】
[0002] 任何一段能够独立与转录因子结合并起始转录的DNA序列都可以被称为启动子。 在启动子中，能够被σ因子识别的区域具有非常保守的序列特征。其中，在转录起始位点 (+1)上游大约IOnt以及35nt处的两段序列（称为-10区与-35区）对于σ因子的识别 具有决定性的作用，因此这两段序列也被称作狭义启动子或核心启动子。除这段核心启动 子区域之外，-35区的上游序列也可能对转录的强度产生影响，这些序列被称作UP元件（UP element)〇
[0003] 为了获得所需要的目的基因表达量，通常有两种思路进行启动子的遗传改造。一 种方式是对目的基因本身的启动子进行突变改造，从而提高启动子的活性。另一种方式是 将原有的启动子替换成其他的天然或人工构建的启动子，从而彻底改变下游基因的表达 谱，实现对基因转录水平的人为控制。
[0004] 在启动子替换方面，关键的工作在于目标启动子的选择。从来源分，可供利用的 启动子系统包括内源启动子与外源启动子。内源启动子是指宿主物种自身或近源物种的 启动子。例如对于枯草芽孢杆菌，提高目的基因表达量最常用的就是内源启动子P43。P43 是枯草芽孢杆菌胞嘧啶/脱氧胞嘧啶脱氨酶基因的启动子，属于组成型强启动子。Yang等 (2013)从B. Iicheniformis基因组中筛选到了启动子PluxS，将这一启动子与枯草芽孢杆 菌Papr的-10区结合，得到的杂合启动子PlapS进一步提高了转录活性。此外，淀粉酶启 动子PamyE、碱性蛋白酶启动子PaprE、苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白基因启动子Pcry3Aa 等也都在枯草芽孢杆菌表达外源基因的过程中得到了一定程度的应用。外源启动子主要包 括噬菌体启动子以及人工构建的具有某种特性（例如诱导表达）的杂合启动子。枯草芽孢 杆菌基础研究中最常用的诱导型启动子是来自枯草芽孢杆菌噬菌体SP0-1的Pspac。Pspac 将大肠杆菌阻遏蛋白基因 IacI-IacO操纵子与噬菌体SP0-1启动子结合，能够通过IPTG诱 导下游基因在枯草芽孢杆菌中表达。Chen等（2010)将大肠杆菌T7噬菌体RNA聚合酶与启 动子系统引入枯草芽孢杆菌，成功的表达了异源分泌蛋白。启动子替换方法的优势在于目 的性强，通过在一系列已知特性的启动子中选择最适合目的基因表达水平与表达条件的 启动子，能够大大减少筛选所耗费的精力。
[0005] 脂肽属于次级代谢产物，包括表面活性素、芬芥素、伊枯草菌素等多个家族。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
[0007] 本发明是基于发明人下列问题的发现而完成的：
[0008] 脂肽合成酶基因的表达量较低，因此需要对脂肽合成酶基因的启动子加以改造或 将其替换为活性较强的启动子，以提高脂肽产量。
[0009] 为此，本发明提出了一种枯草芽孢杆菌诱导型强启动子，用于在枯草芽孢杆菌中 高表达表面活性素，具有枯草芽孢杆菌诱导型强启动子的枯草芽孢杆菌的表面活性素摇瓶 产量高达9. 74g/L，是相同培养条件下野生菌株的17. 7倍。
[0010] 在本发明的第一方面，本发明提出了一种启动子。根据本发明的实施例，所述启动 子具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
[0011] AGCACTCTTTCCACTATCCCTACAGTGTTATGGCTTGAACAATCACGAAACAATAATTGGTACGTACGA TCTTTCAGCCGACTCAAACATCAAATCTTACAAATGTAGTCTTTGAAAGTATTACATATGTAAGATTTAAATGCAAC CGTTTTTTCGGAAGGAAATGATGACCTCGTTTCCACCGGAATTAGCTTGGTACCAGCTATTGTAACATAATCGGTAC GGGGGTGAAAAAGCTAACGGAAAAGGGAGCGGAAAAGAATGATGTAAGCGTGAAAAATTTTTTATCTTATCACTTGA CATTGGAAGGGAGATTCTTTATAATAAGAATGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATT(SEQ ID NO ：1)〇
[0012] 在本发明中，所述启动子被称为Pg3。根据本发明的实施例，所述启动子为诱导型 强启动子，诱导剂为异丙基β-D-I-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG)，可在IPTG诱导下强启动 目标蛋白基因的表达。
[0013] 在本发明的第二方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表 达载体包括前面所述的启动子。包含前面所述的诱导型强启动子的表达载体，可以高表达 目标蛋白基因。
[0014] 根据本发明的实施例，上述表达载体还可以进一步包括下列附加技术特征至少之
[0015] 根据本发明的实施例，所述表达载体进一步包括目的基因，所述目的基因与所述 启动子可操作地连接。根据本发明的实施例，所述启动子可在IPTG诱导下强启动目标蛋 白基因的表达，当所述目的基因与所述启动子可操作的地连接，所述目的基因在IPTG诱导 下，表达量显著提高。
[0016] 根据本发明的实施例，所述目的基因具有SEQ ID NO :2或3所示的核苷酸序列。
[0017] ATGGAAATAACTTTTTACCCTTTAACGGATGCACAAAAACGAATTTGGTACACAGAAAAATTTTATCCT CACACGAGCATTTCAAATCTTGCGGGGATTGGTAAGCTGGTTTCAGCTGATGCGATTGATTATGTGCTTGTTGAGCA GGCGATTCAAGAGTTTATTCGCAGAAATGACGCCATGCGCCTTCGGTTGCGGCTAGATGAAAACGGGGAGCCTGTTC AATATATTAGCGAGTATCGGCCTGTTGATATAAAACATACTGACACTACTGAAGATCCGAATGCGATAGAGTTTATT TCACAATGGAGCCGGGAGGAAACGAAGAAACCTTTGCCGCTATACGATTGTGATTTGTTCCGTTTTTCCTTGTTCAC CATAAAGGAAAATGAAGTGTGGTTTTACGCAAATGTTCATCACGTGATTTCTGATGGTATCTCCATGAATATTCTCG GGAATGCGATCATGCACATTTATTTAGAATTAGCCAGCGGCTCAGAGACAAAAGAAGGAATCTCGCATTCATTTATC GATCATGTTTTATCTGAACAGGAATATGCTCAATCGAAGCGGTTTGAAAAGGACAAGGCGTTTTGGAACAAACAATT TGAATCGGTGCCTGAACTTGTTTCCTTGAAACGGAATGCATCCGCAGGGGGAAGTTTAGATGCTGAGAGGTTCTCTA AAGATGTGCCTGAAGCGCTTCATCAGCAGATTCTGTCGTTTTGTGAGGCGAATAAAGTCAGTGTTCTTTCGGTATTT CAATCGCTGCTCGCCGCCTATTTGTACAGGGTCAGCGGCCAGAATGATGTTGTGACGGGAACATTTATGGGCAACCG GACAAATGCGAAAGAGAAGCAGATGCTTGGCATGTTTGTTTCTACGGTTCCGCTTCGGACAAACATTGACGGCGGGC AGGCGTTTTCAGAATTTGTCAAAGACCGGATGAAGGATCTGATGAAGACACTTCGCCACCAAAAGTATCCGTATAAT CTCCTAATCAACGATTTGCGTGAAACAAAGAGCTCTCTGACCAAGCTGTTCACGGTTTCTCTTGAATATCAAGTGAT GCAGTGGCAGAAAGAAGAGGATCTTGCCTTTTTGACTGAGCCGATTTTCAGCGGCAGCGGATTAAATGATGTCTCAA TTCATGTAAAGGATCGATGGGATACTGGGAAACTCACCATAGATTTTGATTACCGCACTGATTTATTTTCACGTGAA GAAATCAACATGATTTGTGAGCGCATGATTACCATGCTGGAGAACGCGTTAACGCATCCAGAACATACAATTGATGA ATTAACACTGATTTCTGATGCGGAGAAAGAGAAGCTGCTTGCGAGGGCCGGCGGTAAATCTGTGAGCTACCGTAAGG ACATGACGATACCAGAGCTGTTCCAAGAAAAGGCTGAACTGCTTTCTGATCATCCAGCGGTTGTATTTGAAGATCGC ACATTGTCCTATCGAACGTTACATGAGCAATCTGCACGCATCGCCAATGTGCTGAAACAGAAAGGGGTTGGCCCGGA CAGTCCTGTCGCGGTTTTGATTGAACGCTCTGAACGGATGATTACAGCTATCATGGGAATTTTAAAAGCCGGCGGAG CCTATGTGCCGATTGATCCGGGTTTTCCTGCTGAGCGCATTCAATATATTTTGGAGGACTGCGGGGCGGATTTCATC CTGACTGAATCGAAGGTTGCGGCGCCTGAAGCCGATGCTGAGCTGATTGACTTAGATCAGGCGATTGAGGAAGGTGC AGAAGAAAGCCTGAATGCAGATGTGAACGCTCGGAACC TTGCCTACATTATTTACACATCGGGAACAACCGGACGC CCGAAAGGCGTTATGATCGAGCATCGCCAGGTTCATCATTTGGTTGAATCTCTGCAGCAGACGATTTATCAAAGCGG CAGCCAAACCCTGCGGATGGCATTGCTTGCGCCGTTCCACTTTGATGCGTCAGTGAAGCAGATCTTCGCGTCGCTTC TTTTGGGCCAAACCCTTTATATCGTACCGAAGAAAACAGTGACGAACGGGGCCGCCCTTACTGCATATTATCGGAAG AACAGCATTGAGGCGACGGACGGAACACCGGCTCATTTGCAAATGCTGGCAGCAGCAGGCGATTTTGAAGGCCTAAA ACTGAAGCACATGCTGATCGGAGGAGAAGGCCTGTCATCTGTTGTTGCGGACAAGCTGCTGAAGCTGTTTAAAGAAG CCGGCACAGCGCCGCGTTTGACTAATGTGTACGGGCCGACTGAAACGTGCGTTGACGCGTCTGTTCATCCGGTTATC CCTGAGAATGCAGTTCAATCAGCGTATGTGCCGATCGGGAAAGCGCTGGGGAATAACCGCTTATATATTTTGGATCA AAAAGGCCGGCTGCAGCCTGAAGGCGTGGCGGGTGAGCTTTATATCGCGGGAGACGGTGTGGGCCGAGGCTATTTAC ATTTGCCTGAATTAACGGAAGAGAAGTTTTTACAAGATCCATTCGTGCCGGGCGATCGCATGTACCGG