一种干旱诱导的花粉特异性启动子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种干旱诱导的花粉特异性启动子及其应用。
【背景技术】
[0002]启动子是基因的一个组成部分，通常位于5’端起始密码子上游区域。该区域含有转录调控因子、RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子(Promoters)就像“开关”，决定基因的活动。植物基因的启动子按其基因的表达方式分为组成型启动子(constitutive promoter)、诱导型启动子(inducible promoter)和组织特异型启动子(tissue-specific promoter)。
[0003]组成型启动子是指能在植物所有或大部分组织中高效启动外源基因表达的启动子，而组织特异性启动子所驱动的基因只在植物生长的某个或某些过程中的特定的器官或组织中表达。例如，叶片特异性启动子、雄蕊特异性启动子等等。发掘这些启动子，对其活性进行鉴定，不仅有助于阐明基因在植物生长发育中的作用，而且可以借助这些启动子，驱动目的基因在特定组织中的有效表达，从而应用于科学研究和农业生产实践。
[0004]诱导型启动子，是指在某些特定条件例如物理、化学、生物信号存在时，启动子可以驱动下游的基因增强表达，转录水平大大提高。植物由于长期暴露在大自然环境中，时刻受到来自环境胁迫的影响，相应地在进化过程中产生大量基因的表达受环境胁迫因子，比如高温、干旱、病虫害的诱导，调控体内信号通路和分子活动，抵御逆境。随着温室效应加剧、工农业用水剧增，干旱已成为威胁农业生产的主要因素。作物生殖生长阶段特别是雄蕊的发育最容易受环境胁迫的影响，造成的减产也最为严重。因此，发掘雄蕊发育特异的干旱胁迫响应基因，应用其启动子驱动目的基因的表达，对于研究植物生殖抗旱及植物遗传工程都有重要意义。
[0005]本发明中涉及的基因是水稻油体钙蛋白(caleosins，CLOs)基因家族8个成员中的一员，该基因随幼穗发育进程在花粉粒中表达上升，同时受干旱胁迫诱导。本发明提供了基因启动子的驱动活性，该启动子可以驱动基因在水稻花粉粒中特异性表达，在干旱胁迫下活性增强，可以预见，它在科研或者生产实践上均具有较强应用价值。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种组织特异型启动子及其应用，尤其提供一种受干旱胁迫诱导的诱导型启动子及其应用。
[0007]本发明包括启动子序列的克隆、植物转基因载体的构建、该启动子在不同组织中驱动基因表达的活性分析，以及该启动子对干旱胁迫的响应分析。该启动子属于一种组织特异性启动子，且响应干旱胁迫，因此在水稻生殖抗旱研究领域及植物转基因技术领域具有重要价值。
[0008]本发明提供的启动子，是从水稻的基因(0s06g0254600)起始密码子上游克隆到的一段约2224bp大小的DNA序列，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。
[0009]本发明还包括，利用所述启动子(SEQ ID N0.1顺序)构建的基因工程载体； 本发明还包括，利用所述启动子(SEQ ID N0.1顺序)作为花粉粒特异型启动子在基因工程中的应用，该启动子能够驱动目的基因在雄蕊发育9-12期的花粉中特异性表达。
[0010]本发明还包括，利用所述启动子(SEQ ID N0.1顺序)作为雄蕊发育早期花药中干旱诱导型启动子的应用，该启动子能在干旱胁迫下驱动目的基因表达于发育中的花粉粒中。
[0011]本发明中的启动子可被用于构建驱动外源基因在花粉粒中特异性表达的转基因载体，在科研和农业生产上均具有重要的应用价值。
[0012]该启动子的获得，是来源于对基因的表达特征的研究及该基因的抗旱性研究。首先，从水稻幼穗发育过程的干旱胁迫响应芯片数据中获得该基因的表达特征，0sCL07是水稻8个油体钙蛋白中唯一既受发育调控表达又受干旱胁迫诱导表达的基因(参见图1);应用定量PCR检测该基因的表达，分析各组织的表达谱，发现其只在雄蕊中特异性表达(参见图2)。比较各组织干旱后的表达情况，发现其在幼穗发育早期，特别是减数分裂时期受干旱诱导表达，减数分裂以后本底表达已很高，不再受干旱胁迫诱导(参见图3)。
[0013]将该启动子构建在含有报告基因⑶S {β -glucuronidase，编码葡萄糖醛酸酶)的载体中(参见图4)，通过农杆菌介导的水稻转基因技术获得转基因阳性株。取水稻各组织检测GUS活性，发现它所驱动的GUS报告基因只在水稻穗发育后期的花药中高表达，更特异地是在花粉粒中表达(参见图5)。因此，基因启动子可以驱动外源基因在特定的组织中表达，从而达到定向地转基因的目的。
[0014]将转基因植物进行各个时期的干旱处理，检测GUS活性，结果和预期一致，只在花药中有活性，而且干旱后的花药中显示了更强的表达。穗发育早期对照材料中几乎检测不到花药的GUS活性，而在干旱的对应时期材料中花药GUS活性较强，花粉粒成熟期对照和处理的花药都有很强的GUS活性(参见图6)。
【附图说明】
[0015]图1芯片数据分析水稻油体钙蛋白基因在幼穗中干旱胁迫下的表达。水稻油体钙蛋白基因家族共有8个成员，OsCLOl到0sCL07。 2~3mm，3~4mm，4~5mm，5~7mm为颖花的长度。C为对照，D为干旱处理。是CLO家族中唯一的干旱胁迫后在各时期花中表达明显上调的基因。
[0016]图2的组织表达表达谱。
[0017]图3的干旱响应表达谱。
[0018]图4基因启动子的载体构建示意图。
[0019]图5水稻各组织⑶S活性分析。其中，a为一周的水稻苗(bar=lcm) ;b_d分别为成熟期的根莖叶(bar=lmm) ；e, f, g, h, i分别为第6 (bar=0.5mm)、8、10、12、14期的颖花(bar=2mm) ;j, k, I分别为12期的雌蕊、花药和花粉粒(bar=0.lmm) ;m为授粉4天的幼胚(bar=Imm)。⑶S活性主要出现于晚期花粉粒中。
[0020]图6穗发育时期进行干旱处理后花药的⑶S活性比较(bar=0.1mm)。干旱胁迫后 GUS信号在花粉粒发育的早期就会出现，且信号强度有所升高。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例进一步阐明本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法通常按照常规条件，即Sambrook等著的《分子克隆》实验手册中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022]实施例1水稻种植和干旱处理
以水稻日本晴为材料，种植于人工控制的温室和室外自然环境的盆中。干旱处理在温室进行。干旱处理方式:水稻在正常条件下生长至生殖发育期，然后在生殖发育期停止浇水，待土壤相对含水量降至15-20%后，保持一周，取样用于基因的表达分析、⑶S染色。
[0023]实施例2基因芯片分析干旱条件下水稻幼穗发育过程基因的表达
水稻日本晴种子催芽后，移栽到温室塑料盆的土中生长，50天后密切观察并检查水稻的生长状态，在从营养期刚刚转入生殖生长时进行干旱处理:倒去盆中多余水分，停止浇水，待土壤水分降低到30%左右时，每天补充少量水维持该水分含量一个礼拜，取不同大小(2~3mm, 3~4mm, 4~5mm, 5~7mm)的水稻花,分别收集并编号，以正常生长条件下的水稻作为对照，做三次重复。芯片分析由安捷伦公司完成。
[0024]实施例3 qRT- PCR检测
取不同组织及不同穗发育时期的水稻样品，按RNA提取试剂盒提供的试剂及方法(RNAiso plus, TaKaRa)提取 RNA,进行反转录(PrimeScript RT regent Kit With gDNAEraser, TaKaRa)。本实施例采用基于探针的定量PCR方法，是由于OsCLO家族成员同源性较高，针对不同基因设计Taqman特异性探针，可以更好地区分家族的同源基因。探针及引物序列如SEQ ID N0.2-SEQ ID N0.4所示:
探针序列:FAM- ACCTTGCCGCCAGTGT - MGB (SEQ ID N0.2)；
上游引物:GTTGTGACTTCGCATTTGCTAGA (SEQ ID N0.3)；
下游引物:CGATAAGTGAGGTAATGGTGCATC (SEQ ID N0.4)。
[0025]PCR反应体系:
2 X Premix ExTaq 5 μ IPrimer-F 0.2 μ IPrimer-R 0.2 μ IProbe 0.4 μ IRT反应液2 μ IDye I 0.2 μ IddH20 4 μ IPCR反应程序:
(1)95°C 预变性 30s;
(2)95°C变性5s，60°C退火延伸30s，循环40次；
实施例4转基因载体构建
提取水稻基因组DNA，通过PCR技术扩增启动子，所用的引物如SEQ ID N0.1所示序列的下划线部分，即:上游引物:CTTCAGTTGTCTTTGCCTCC (SEQ ID N0.5)，下游引物:AGAGCAATTCTGCGAGACG (SEQ ID N0.6 )。上游引物引入I酶切位点，下游引入Sas I酶切位点。将扩增到的产物连入PCR-Blunt中间载体，测序无误后连入经改造过的转基因终载体pCAMBIA1300中，转化农杆菌EHA105，通过菌落PCR确证阳性克隆中启动子片段的存在。
[0026]实施例5水稻遗传转化 A.诱导愈伤组织
选取成熟饱满的种子，去掉内外颖，用70%乙醇浸泡2 min，然后于含2%有效氯的次氯酸钠溶液中浸泡30 min，用灭菌水洗7-8次，吸水纸上吹干，置于N6D培养基上，28°C，16h光培养约30天，取散落的愈伤继代10天。
[0027]B.农杆菌EHA105的培养
将上一部分实验中得到的含有正确质粒的农杆菌菌液涂布于YEB三抗平板(链霉素、利福平和卡那霉素抗性)上，28°C暗培养约36小时，收集菌落于液体共培养基中，调节其OD为0.2左右。
[0028]C.侵染与共培养
收集继代的愈伤于准备好的共培养菌液中，静置30 min。倒掉菌液，愈伤在吸水纸上吸干，接至共培养培养基上，20°C暗