专利名称：含w盒的诱导型启动子及构建和在基因工程上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导型启动子及构建和在基因工程上的应用，更具体地涉及了一 种含W盒的诱导型启动子在水稻单子叶植物水稻抗病虫基因工程中的应用，属于植物基因 工程技术领域。
背景技术：
真菌、细菌、病毒等病原微生物的侵染常造成各种农作物产量和质量的下降。培育和推 广抗病品种是防治作物病害、保证作物稳产高产最安全有效的途径。利用植物自身抗病基 因，通过常规育种和分子标记辅助育种方法已培育了许多抗病新品种。然而，抗性基因在种 属间利用具有一定的局限性。转基因方法可克服上述局限，为作物抗病育种开辟了一条新 途径，也是植物种质创新的重要途径之一。目前，在转基因技术中所使用的启动子大多数为 组成型启动子，如果使用植物组织特异性启动子或病原诱导的植物启动子不仅会获得目的 产物、达到预定目标，而且也不会产生副作用。植物基因启动子是位于结构基因5’端上游区、含有顺式作用元件的DNA序列，决 定着下游基因转录的特异性、方向和效率，是转录调控的中心。高等植物启动子区域存在各 种特征元件，包括转录起始位点、TATA盒、起始因子和不同的顺式作用元件等。其中，TATA 框是依赖于RNA聚合酶II转录所必需的，决定着转录起始，并调控着上游激活蛋白的行为； 起始因子的功能与TATA盒相似，可影响转录的方向和起始点的定位，但一般不能改变启动 子内包含2个核心序列因子的TATA活性。植物的许多性状与启动子的结构及其调控方式 密切相关。因此，研究启动子不仅可以为基因工程提供重要的调控元件，也可促进从遗传分 子基础上发掘具有重要利用价值的植物新资源。根据植物启动子的转录模式可将其分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导 型启动子。组成型启动子调控的基因表达不受时空限制和某种物质的诱导而在植物中表达 出来。双子叶植物中常用的组成型启动子花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子是目前植物基 因工程中使用最多的启动子，它驱使转基因产生组成型表达。它是异源病毒型启动子，在转 基因植物中具有较高的表达活性。组成型启动子可应用于评价一个基因的生物学功能、转 基因表达数量及其活性，但在改良转基因作物的实际应用中的主要问题是(1)组成型启 动子驱动的基因在植物各组织中均有不同程度表达，它驱动外源基因在植物的各种组织和 所有发育阶段都会表达，产生大量异源蛋白或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有 的代谢平衡，增加了植株的代谢负担，有些产物甚至对植物的生长发育有毒，造成了物质和 能量上的巨大浪费，同时还会改变植物的形态，影响植物正常的生长发育，甚至导致死亡； (2)植物所有细胞可能会全部进入防御模式，即使在无病原侵染时仍进行抗病反应；(3)组 成型启动子调控表达的转基因产物可在人和动物食用的植物组织中积累，但是生物安全性 要求不能有转基因产物。如果用组织、器官特异型和病原诱导型启动子取代组成型启动子，使外源基因能 够定时、定点、定量地在植物中表达，可以克服组成型启动子带来的问题。因此，组织特异型启动子和病原诱导型启动子的研究与应用是植物基因工程的重要内容和当今国内外研究 的热点。利用启动子的最好方法可能是利用一个内源抗性基因启动子，这样既可以减少植 物的代谢负担，又可以避免植物防御反应的假性激活。比组成型 表达和组织特异型表达更理想的表达模式是，只在需要的时间和地点表 达而且仅在感染部位启动抗病相关基因表达。病原诱导型启动子能达到上述较为理想的结 果，防止“逃离细胞死亡”现象出现，消除了对植物生长和发育影响的副作用。一种理想的 病原诱导型启动子应迅速被广谱野生型病原侵染所激活，并有广谱抗病性。然而由于植物 对不同病原菌采取了不同的防御机制，许多重要植物抗病分子机制尚不明确，所以，目前分 离的大多数病原诱导型启动子很少能满足上述要求，仍然存在轻微的“逃离细胞死亡”的现 象。因此，迫切需要分离或人工构建理想的病原诱导型启动子。植物抗病机制研究、转录组 学和启动子克隆技术的发展，为人工构建新的病原诱导型启动子奠定了基础。当前可使用的病原诱导型启动子缺乏的主要原因是分离各种天然的病原诱导型 启动子较少。与天然病原诱导型启动子相比，人工构建病原诱导型启动子不仅更具有广谱 性，而且可根据不同目的进行灵活选择，如消除启动子表达元件，可改变启动子的强度和病 原诱导表达基因的数量和质量。研究发现，启动子元件在不同植物品种中防御信号是相对 保守的。因此，通过收集各种植物启动子元件可以人工构建病原启动子。启动子组件有许多不同的类型，包括病原诱导型作用元件、组织特异型作用元件、 细胞特异型作用元件和人工组建启动子所需的最小启动子区段。其中病原诱导型作用元件 在抗病方面是最重要的。已知的植物转录因子家族中有许多在抗病反应中起重要作用的成 员，其中包括 WRKYs、ERFs, bZIPs、Mybs、Dofs、bHLHs、ffhirly, SR 和 DBPl 等。这些转录因 子与I3R基因特异结合的位点即顺式作用元件，对于组建启动子作用元件是非常有用的。在植物防卫反应相关基因的表达过程中，顺式作用元件通过与转录因子的互作发 挥着重要调控作用环境刺激经过一系列信号转导、传递后，激活防卫相关转录因子与特 异顺式作用元件的互作，从而实现相关防卫功能基因的表达。目前，通过转基因技术提高 植物的抗逆性已成为植物基因工程中重要的研究策略。鉴于顺式作用元件的上述重要调 控作用，与早期的组成型表达的抗性基因的转基因应用相比，使用诱导型启动子介导的抗 性基因无疑具有多方面的优势，因此鉴定抗性相关(特别是细菌性病原相关)诱导型启动 子已成为目前植物分子生物学研究的热点。迄今，已经发现了几种受不同病原诱导的GCC box (AGC-CGCC)和受创伤、部分病原诱导的W box ([T] TGAC[C/T]。W box是WRKY转录因 子的结合位点，是一类植物病原诱导相关基因的顺式作用元件。WRKY转录因子的专一识别 序列是(T) (T)TGAC (C/T)片段即W盒，其中TGAC为W盒的核心序列。目前克隆的WRKY 基因编码的蛋白大多数可与W盒序列特异性的结合，而且WRKY转录因子W盒的识别具有很 强的专一性。W盒频繁出现在受病原菌诱导或与植物防卫反应相关基因、发育代谢相关基因 和WRKY基因的启动子区域内。有功能的W盒常成簇存在于启动子发挥协同作用，表明WRKY 转录因子还可能通过与W盒的结合参与防卫反应、发育及代谢等信号途径。目前，使用组成型启动子的基因工程植物中，转入抗病相关基因的持续表达可能会 引起无法控制的防御反应，例如“逃离细胞死亡”。利用转基因的方法来提高作物产量面临的 另一个主要问题是启动子引起的背景表达，带有开关并在病原侵染位点能迅速短暂地诱导抗 病基因表达的启动子是比较理想的启动子。另外，内源启动子的分离与利用可以减少背景表达，但是某些启动子的调控元件通常既调控病原诱导基因的表达又调控背景表达，因而，理想 的病原诱导特异型启动子的分离迄今还比较困难。然而，随着对启动子作用元件和抗病调控 机制研究的深入发展，成功地分离或人工构建更理想启动子的可能性会越来越大。
研究表明，将马铃薯、拟南芥、芫荽菜、长春花等双子叶植物中鉴定的W盒与 CaMV35S核心启动子(-46 +8bp)融合所构建成的诱导型启动子能在烟草、拟南芥等原生 质体中瞬间表达或在转基因植株中被病原菌或诱发子处理后驱动^依基因表达。该结果一 方面表明W盒元件在诱导表达中的重要作用，另一方面也说明该顺式作用元件的结合蛋白 及其上游的信号传导途径在上述多种双子叶植物中具有保守性。但是，迄今仍缺乏在水稻 以及单子叶植物中W盒等元件应答病原菌或激发子的直接证据。进一步在水稻中开展W盒 应答病原菌、ET、JA信号的鉴定和应用研究，具有十分重要的意义(1)可望找出应答病、 虫的顺式作用元件，以这些元件为诱饵，可进一步分离其相应的转录因子基因；(2)由于顺 式作用元件离开其宿主启动子仍可保留其应答病原菌或诱发因子的功能，可利用这些元件 与合适启动子核心序列(如CaMV35S、Actl等基因启动子的核心序列)，构建响应病原菌侵 染或JA (昆虫取食)的诱导型启动子。
发明内容
本发明提供了一种含W盒的诱导型启动子及构建和在基因工程上的应用，该合成启动 子可充当水稻抗稻瘟病、稻纵卷叶螟及盐胁迫的诱导型启动子。本发明的含W盒的诱导型启动子，其至少含有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。构建方法如下
本发明将双子叶植物拟南芥中鉴定的应答逆境胁迫的W盒(其序列为 TTATTCAGCCATCAAAAGTTGACCAATAAT)与 CaMV35S 启动子核心序列(-46 +8bp)融合，构建 成诱导型启动子。所述CaMV35S启动子核心序列为TCGACCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAG TTCATTTCATTTGGAGAGGAC。本发明的含W盒的诱导型启动子本底表达低、应答速度快、持续时间长、表达强度 适中。将上述的诱导型启动子与抗病(虫)等基因结合，构建成转化载体转化水稻，可使获得 的转基因水稻的外源抗性基因诱导表达，既发挥抗性基因在抗病(虫)中的作用，又可避免 由于抗性基因过量表达导致的物质、能量的浪费和抗性基因表达产物对转基因植物细胞本 身的不利影响。本发明的显著优点
本发明的含W盒的诱导型启动子在转基因水稻中可较强地应答水稻稻瘟病菌侵染和 稻纵卷叶螟取食，对已经分离鉴定的具有抗病作用的小分子化合物(如乙烯利、苯丙噻二 唑、茉莉酸甲酯)的处理也有明显的应答活性，而对干旱、低温、高温等非生物逆境处理的应 答活性比较弱。而且本发明所采用的W盒在广谱逆境应答的诱导型合成启动子构建中也具 有十分重要的应用价值。本发明的诱导型启动子在单子叶植物和双子叶植物抗病、虫基因 工程中具有十分重要的应用价值，其转基因植物株系在诱导植物抗病的小分子化合物高通 量筛选中也有重要的应用价值。
图1为瞬间表达载体ρΒΤΙΟ-GUS的质粒图谱；图2为pDN0R-207入门载体；
图3为pMDC-163目的载体；
图4为瞬间表达载体ρΒΤΙΟ-GUS的结构图；
图5为转基因水稻TO代植株的目的片段PCR检测；1-15，TO阳性转基因植株；16，野生 型植株；17，阳性对照；
图6为稻瘟病菌侵染Tl代植株5-8天后⑶S表达；其中1表示5d后，2表示6d后，3 表示7d后，4表示8d后，control表示对照；
图7为稻纵卷叶螟取食Tl代植株叶片不同时间GUS组织化学染色；其中1表示lh，2 表示2h，3表示5h，4表示24h ；
图8为机械损伤Tl代植株叶片不同时间段后GUS组织化学染色的结果；其中1表示 0. 5h后，2表示Ih后，3表示3h后，4表示5h后，5表示24h后。
具体实施例方式
1载体构建过程和转 1. 1材料与方法 材料
1. 1. 1. 1菌株和载体大肠杆菌(fecAericAia co7i)DH5 a和DB3. 1 (福建农林大学生 命科学学院实验室保存)；根癌农杆菌(^rohcteriws tumefaciems) EEAlOb菌株(福建农 林大学生命科学学院实验室保存);pBT10_GUS瞬间表达载体(见图1)由(Weisshaar教授惠 赠，Sprenger-Haussels and ffeisshaar, 2000);pDN0R_207 入门载体(见图 2)和 pMDC-163 目的载体(见图3)均购自Invitrogen公司。1. 1. 1. 2生化试剂DNA快速回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自上海生工生物工 程有限公司，损a/、SacU SpeU PfuTaq酶、rh^酶、T4连接酶和dNTP等购自TaKaRa公司， Gateway载体构建试剂盒购自Irwitrogen公司，庆大霉素、卡那霉素、利福平、羧卞青霉素、 潮霉素、X-gluc等为Sigma公司产品。其它化学试剂均为国产化学纯。1. 1. 1. 3引物引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，如表1所示。表1引物名称和核苷酸序列
1. 1. 1. 4序列合成根据Ohme-Takagi and Shinshi中的W盒序列，(其中划线碱基为 附加上去的，使正反链退火合成的双链两侧分别带有损a/和两个限制性酶切位点)分 别委托上海博亚生物技术公司合成，如表2所示。
表2合成链的名称和核苷酸序列 1. 1. 1. 6生物和非生物胁迫稻瘟病菌(菌株为识分生孢子、稻纵卷叶螟幼 虫、机械损伤。方法
1. 1. 2. 1构建含二倍盒的诱导型启动子瞬间表达载体将1. 1. 1. 4中合成的带有损a/ 和SpeI限制性酶切位点的W盒双链寡核苷酸片段插入ρΒΤΙΟ-GUS的相应酶切位点上(如 图4所示)，获得含有单拷贝W盒的载体ρΒΤΙΟ-Χ-GUS (X-ff盒，下同)，将载体pBT10_X_GUS 分别用损aJ/fec/和分eJ/fec/组合酶切(37°酶切3-5h)，回收含W盒的片段通过使用T4 连接酶进行连接、转化大肠杆菌DH5 a和验证，从而获得带有2个W盒拷贝串联的瞬间表达 载体 pBT 10-XX-GUS。1. 1. 2. 2构建含二倍盒的诱导型启动子植物表达载体根据上述1. 1. 2. 1中构建 好的瞬间表达载体ρΒΤΙΟ-ΧΧ-GUS上的W盒和其下游相邻的CaMV35S核心启动子(-46 +8bp)片段设计Gateway内侧引物，运用Gateway载体构建技术(参考Invitrogen公司 Gateway 技术)构建植物表达载体，以pDN0R-207载体为入门载体，pMDC-163为目的载 体从而获得可用于植物遗传转化的诱导表达载体PMDC-XX-163，表达载体转化农杆菌菌株 EHA105备用(取Iug左右的pMDC-XX-163载体质粒加入到EHA105感受态细胞中，混勻后，冰 浴30min ；液氮速冻3min ；取出后37°C水浴5min ；冰浴2min ；加入400ul不加抗生素的YEP 液体培养基，280C，ISOrpm摇培4h ；取出后涂在含有50mg/L卡那霉素和利福平的YEP固体 培养基，28°C培养到形成单菌落，挑取单克隆菌落进行PCR验证)。1. 1. 2. 3植物表达载体转化农杆菌以及对水稻的遗传转化用接种针挑取含目的 基因pMDC-XX-163的农杆菌EHA105菌液，划线于浓度为50mg/L卡那霉素和利福平的AB固 体培养基，置于28°C黑暗培养3-4d。从上述AB培养基上挑取一个单克隆于AAM液体培养 基中置于28°C摇床，直至OD值为0. 1。取脱壳的日本晴种子用70%乙醇消毒l-2min，无菌 水冲洗5遍，接着用2. 5%次氯酸钠溶液(每50ml2. 5%次氯酸钠溶液含一滴Tween-20)消毒 15min,用无菌水冲洗5遍，后置于灭菌过的滤纸上晾干，再接到N6D+2. 4D诱导培养基，置于 32°C光照培养箱中光照培养5-7d诱导产生愈伤组织。取出经诱导培养的种子，拔芽后浸入 上述OD为0. 1的AAM菌液中(含AS 10-20mg/L) IOmin,期间轻轻晃动，后用滤纸吸干愈伤 表面的菌液。将愈伤转移到2N6-AS培养基上含AAM液体培养基的无菌滤纸上，25°C黑暗共 培养3d。将共培养后的愈伤于无菌水中清洗5-6遍直至无混浊出现，接着用含500mg/L羧苄青霉素的无菌水清洗30min，用滤纸吸干，将愈伤置于N6D筛选培养基上(含400mg/L羧苄 青霉素、2mg/L 2.4-D和50mg/L的潮霉素)32°C光照筛选培养2周。将经筛选培养的愈伤 转移到RE-III培养基上(含0. 02mg/L α -NAA、2mg/L KT、50mg/L潮霉素和400mg/L羧苄青霉 素)32°C光照分化培养2-3周。取分化出来的小苗转移到HF生根培养基上30°C诱导生根 培养1周。1. 1. 2. 4转基因水稻DNA的提取以及分子检测水稻基因组DNA的提取参照文献 (sambrook and russel, 2002)方法。用Gateway内侧特异引物序列对其进行PC R检测(如 图5所示)，图中以表达载体ρΒΤΙΟ-ΧΧ-GUS为阳性对照，以非转基因水稻为阴性对照，从图 中可以看出1 15出现与阳性对照一样的PCR条带，说明均为阳性转基因植物。1. 1. 2. 5转基因植株生物和非生物胁迫处理取Tl代饱满种子经含潮霉素的水 溶液(浓度50mg/L)抗性筛选每天12h光照、25°C、培养7_8d后取能正常萌发的绿色小苗种 到盛有土壤的塑料小花盆中，以尿素和有机肥作为基肥，出苗后追肥两次尿素。3-4叶期时 采用喷雾接种法接种浓度为105个/mL的稻瘟病菌(菌株为识仏77)分生孢子后移至25°C 和80%湿度的温室培养数天。稻纵卷叶螟幼虫取食Tl代转基因植株5-6叶期的幼嫩叶片 不同时间段后将稻纵卷叶螟幼虫从叶片上移走。机械损伤处理用解剖刀对Tl代转基因植 株5-6叶期幼嫩叶片切割数处2-3cm伤口。1. 1. 2. 6组织化学染色生物胁迫和非生物胁迫应答结果检测按照 (Jefferson, 1987)的方法配置⑶S染色液，于-20°C避光储存。经上述生物和非生物胁迫 处理后剪取5-6cm叶片于37°C放置12h再用70%乙醇脱色，期间更换乙醇数次。待脱色完 全后拍取其照片。2 W盒驱动的⑶S基因表达对生物与非生物胁迫的应答 2. 1 W盒驱动的GUS基因表达对稻瘟病病原菌侵染的应答
Tl代转基因植株生长到3-4叶期时被稻瘟病(菌株为识仏77)分生孢子侵染后培养 5-8d分别检测GUS报告基因的表达情况，发现随着接种后培养时间的增加病害逐渐变得严 重，而GUS的表达量也随着增加，尤其是病害严重的区域。在同龄的非转基因植株经稻瘟病 菌接种后侵染五天时染色未检测到任何GUS活性(见图6)。2. 2 W盒驱动的⑶S基因表达对稻纵卷叶螟取食的应答
用稻纵卷叶螟幼虫取食Tl代转基因水稻5-6叶期植株的幼嫩叶片，从开始取食时开始 计时lh、3h、5h、24h后轻轻将稻纵卷叶螟从叶片上移走。剪取叶片5-6cm浸入⑶S液中于 370C 12h后分别检测上述不同时间段取食后GUS基因表达量的变化，在稻纵卷叶螟取食处 能检测到明显的GUS活性，随着取食时间延长受损区域增加GUS表达相应的增加(见图7)。2. 3 W盒驱动的⑶S基因表达对机械损伤的应答
机械损伤处理用解剖刀对Tl代转基因植株5-6叶期幼嫩叶片切割数处2-3cm伤口， 于0. 5h、lh、3h、5h、24h后分别剪取伤口附近5-6cm长的叶片浸入⑶S液中置于37°C黑暗 12h，后分别检测上述不同时间段处理后GUS表达量的变化。在用解剖刀切割伤口处清晰的 GUS活性，在本实验中机械损伤处理后较短时间内即有较强表达，并且在随后数小时内表达 逐渐增加。但是随着时间的递增其表达量逐渐减少，机械损伤处理24h后组织化学染色结 果与5h相比蓝色显著降低，可以推测⑶S基因的表达显著降低(见图8)。3 小结本发明将欧芹PRl基因启动子W盒及其部分侧翼序列克隆到GUS基因上游，可使转基因水稻应答多种不同的逆境，说明W盒介导的防御反应信号途径不仅在双子叶植物之间具 有保守性，在单子叶和双子叶植物之间也具有一定程度的保守性，还发现W介导的信号途 径参与了水稻应答稻纵卷叶螟取食的应答，也参与了水稻对盐胁迫的应答，鉴于同一个W 盒可介导转基因水稻中GUS基因应答病原菌、虫害、盐胁迫等多种生物和非生物逆境，推测 本发明所采用的TTGACC这一较为典型的W盒可与多种不同的WRKY蛋白结合，而且它可以 离开其侧翼的DNA环境单独发生作用。本发明所构建的由W盒和CaMV35S_46 +8bp核心启动子序列组成的合成启动子 可充当水稻抗稻瘟病、稻纵卷叶螟及盐胁迫的诱导型启动子，而且本发明所采用的W盒在 广谱逆境应答的诱导型合成启动子构建中也具有十分重要的应用价值。前已述及，WRKY与上游JA、SA和乙烯信号途径密切相关，广泛地参与了植物应答 病原菌、虫害等生物逆境的防御反应信号传导和防御反应基因表达的调控。本发明发现由W 盒介导的GUS在水稻成株叶片中表现出对稻瘟病、稻纵卷叶螟取食Ih开始的持续应答，表 现出ULRP基因的表达特点。
权利要求
一种含W盒的诱导型启动子，其至少含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2. 一种如权利要求1所述的诱导型启动子的构建方法，其特征在于将双子叶植物拟 南芥中鉴定的应答逆境胁迫的W盒与CaMV35S启动子核心序列融合，构建成诱导型启动子。
3.根据权利要求2所述的诱导型启动子的构建方法，其特征在于所述W盒的核苷酸 序列为 TTATTCAGCCATCAAAAGTTGACCAATAAT。
4.根据权利要求2所述的诱导型启动子的构建方法，其特征在于所述CaMV35S启动 子核心序列为 TCGACCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAC。
5.一种含有权利要求1所述的诱导型启动子或由权利要求2所述的方法构建的诱导型 启动子在单子叶植物水稻抗病、虫基因工程中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种含W盒的诱导型启动子及构建和在基因工程上的应用，所述诱导型启动子至少含有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，构建方法是将双子叶植物拟南芥中鉴定的应答逆境胁迫的W盒与CaMV35S启动子核心序列融合，构建而成。本发明的含W盒的诱导型启动子在转基因水稻中可较强地应答水稻稻瘟病菌侵染和稻纵卷叶螟取食，对已经分离鉴定的具有抗病作用的小分子化合物的处理也有明显的应答活性，而对干旱、低温、高温等非生物逆境处理的应答活性比较弱。本发明的诱导型启动子在单子叶植物和双子叶植物抗病、虫基因工程中具有十分重要的应用价值，其转基因植物株系在诱导植物抗病的小分子化合物高通量筛选中也有重要的应用价值。
文档编号C12N15/10GK101886077SQ20101025438
公开日2010年11月17日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者何水林, 刘志钦, 官德义, 方开星, 牟少亮, 王小燕, 王芳权, 黄定全 申请人:福建农林大学