专利名称：水稻dna启动子顺序的克隆方法
技术领域：
本发明属于植物分子遗传工程学。
构建新型的遗传工程载体在高等植物的遗传工程中的作用是十分重要的，对于一个载体来说，除了能够自主复制的顺序和选择标记之外，启动子顺序对于高度表达由载体导入的外源或自身的基因也是必不可少的。一个克隆的基因是否能在新的宿主中高度地表达取决于该结构基因之前的那段启动子顺序能否有效地工作。
目前已有人从烟草叶绿体中克隆了一些DNA片段，这些DNA片段在大肠杆菌中起启动子的作用〔见X.Kon.，
.S.Levet and S.D.Kung，Gene 31，23-31(1984)〕。此外，也有从卧龙牙草的叶绿体克隆了启动子顺序(见Hideya FuKuzawa et al，Agric.Biol.Chem.49(9)，2725-2731，1985〕。
本发明对传统的DNA启动子顺序的克隆方法进行了改进，运用DNA重组技术，以水稻总DNA或水稻叶绿体DNA为材料，在大肠杆菌克隆受体系统中克隆了一系列启动子顺序，这些启动子顺序在构建水稻人工染色体中是至关重要的。
本发明以水稻总DNA或水稻叶绿体DNA作为供体，以酵母菌和大肠杆菌的穿梭质粒pCH1为载体，该质粒既能在酵母菌中复制又能在大肠杆菌中复制，除了带有一个leu-2(亮氨酸)基因和一个β-lactamase(β-内酰胺酶)基因外，还带有一个缺乏启动子顺序的lacZ(β-半乳糖苷酶)的结构基因，也就是说该基因没有活性。
上述DNA供体及载体首先进行完全酶切，其中载体pCH1DNA完全酶切之后，为了防止自身环化，提高重组频率，增加供体DNA片段插入载体DNA的机会，另外为防止载体DNA中可能存在的细菌染色体DNA的污染，用牛小肠碱性磷酸酯酶进行处理载体DNA。
将供体DNA与载体DNA以2∶1～5∶1的比例混合和连接。连接反应完毕后，将连接反应混合液转化已制备成感受态细胞的大肠杆菌MC1061，在含50～100μg/ml的氨苄青霉素、40μg～60μg/ml的X-gal的LB(蛋白5～10g、酵母粉2～5g、氯化钠2～3g、pH7.2～7.4)平皿上选择转化子。培养皿在37℃的温度中培养16～20小时，这时平皿上有的菌落开始呈现出兰色。将这些兰色的菌落分别划单菌分离，然后抽提其质粒DNA，用BamHI内切酶分别酶切。琼脂糖凝胶电泳表明，这些从兰色菌落中抽提出来的质粒DNA都带有大小不等的插入片段，杂交试验表明这些不同大小的DNA插入片段来自水稻总DNA或叶绿体DNA。也即得到了能在大肠杆菌中促进外源基因表达的DNA片段，该DNA片段可从水稻总DNA中或者叶绿体DNA中分离得到。
根据上述的方法也可方便地得到从水稻线粒DNA中分离出来的、从水稻染色体DNA中分离出来的能在大肠杆菌中促进外源基因表达的DNA片段，同时也可方便地得到从水稻总DNA(包括叶绿体DNA、线粒体DNA、染色体DNA等)中分离得到的，能促进外源基因表达的任何DNA片段所构成的人工染色体。
上述水稻总DNA供体的制备过程为水稻种子用10%～15%的消毒剂(安替福民)消毒10分钟～20分钟，25℃～30℃，暗室下培养7～10天后剪下黄化苗上部( 1/2 - 1/3 苗高)，迅速加入液氮，捣碎。在冷冻粉未融之前立即加入提取液(40～50mM Tris-HCl pH8.0～8.5，10～12mM EDTA，0.5～0.7NaCl，1%～1.2%疏基乙醇，0.8%～1%CTAB)。每克冷冻粉加2～3ml提取液。35℃～37℃水浴保温1～2小时，不时轻轻摇动。保温结束后加入等体积氯仿-异戊醇(24～251V/V)，轻摇10-15分钟，0℃～4℃下5，000～6，000g离心10-15分钟，吸出水相，再重复两次。水相加入等体积的沉淀缓冲液(40～50mMTris-HCl，pH8.0～8.5，10-12mMEDTA，1%～1.2%CTAB)，室温下静置30-60分钟后用玻棒挑出丝状沉淀，在0.25～0.3MNaAc70～75%乙醇中浸洗2～3次，并在该溶液中浸过夜。再用95～100%乙醇浸洗两次，抽干乙醇。最后将玻棒上的沉淀物溶于适量的TE溶液中(8-10mMTris-HCl，1-1.5mMEDTA，pH7.5-8.0)。
上述水稻叶绿体DNA供体的制备过程为水稻种子用10-15%的消毒剂(安替福民)消毒10～15分钟，25℃～30℃下见光培养。7～10天后剪下绿化苗上部(约三分之二苗高)，用清水洗净，称量，加入匀浆液(15～20mM Hepes-Cl，pH7.2-7.4，1mM-1.5mM EDTA，0.25-0.3M甘露醇，10mM-15mM KCl，0.1-0.2%BSA)，每100克绿化苗用1000～1200毫升匀浆液，匀浆打碎后用纱布过滤，过滤液用9，000-10，000g离心10-15分钟，收集绿色沉淀物，用100～120毫升悬浮液(5-10mMHepes-Cl pH7.2～7.4，1-1.5mM EDTA，0.2～0.25M蔗糖，0.1～0.2%BSA)悬浮沉淀物，9000g-10，000g离心5-10分钟，去沉淀，上清液用5，000-6，000g离心10-15分钟，收集绿色沉淀物，加10-15ml SlP溶液(90～95%Percoll，5～10mM Hepes，1～1.5mM EDTA，0.2-0.25M蔗糖，0.1-0.2%BSA)，最后用悬浮液补至40-45ml，混匀后5，000～6，000g离心30-45分钟，停机后管子顶部有一绿色叶绿体带出现。小心用吸管吸出，加入DNasel浓度为5-10μg/μl)，使其终浓度为10～20μg/ml，并加入1～1.5M MgCl2，使其终浓度为10-15mM。置4℃-10℃中1-2小时。用悬浮液稀释，4，000～5，000g离心10-15分钟，收集沉淀，重复两次。纯化后的叶绿体用裂解液(10-15mM Tris-Cl，pH8.0-8.5，10-15mM EDTA，200-250mMNaCl，1-2%SarKosyl)加蛋白酶K至终浓度50～100μg/ml，35℃～37℃保温1～2小时。用饱和酚抽提数次至界面无蛋白质出现，最后用氯仿-异戊醇抽提一次，加NaCl至0.25～0.3M，再加2～2.5倍体积的冻乙醇，-20℃～-70℃中置1～2小时，10，000～15，000g离心30-45分钟，回收叶绿体DNA，DNA沉淀溶于适量的TE(8-10mMTris-Cl，1～1.5mMEDTA，pH7.5～8.0)溶液中。
上述带有lacZ结构基因的PCH1质粒DNA载体的制备过程为含有质粒pCH1的大肠杆菌HB101在含有氨苄青霉素(50-100微克/毫升)的LB培养液中增殖到对数后期(OD＝0.9～1.0)时，离心收集菌体。离心后的菌体用溶液I〔40～50mM葡萄糖，20-25mMTris-Cl(pH7.5-8.0)，5-10mMEDTA，5-10mg/ml溶菌酶)，每500ml培养液离心后的沉淀菌体用5-10ml溶液Ⅰ悬浮，于室温中置5-10分钟。再加10-20ml新配制的溶液Ⅱ(0.15-0.2NNaOH，1-2%SDS)，混匀后置冰浴中10-15分钟。加7.5-15ml的3M醋酸钾溶液(pH4.6-4.8)，混匀后置冰浴中10-20分钟，12，000-15，000g离心20～30分钟，细菌染色体DNA和其余的细菌碎片形成坚实的沉淀。将上清液小心倾于一个离心管中，加入0.6-1倍体积的异丙醇，混匀后置室温中15-30分钟。12，000-15，000g离心30-60分钟回收pCH1质粒DNA。倾去上清液，用70%～75%的酒精冲洗DNA沉淀。待酒精挥发干后，溶DNA沉淀于4.5～5ml的TE(8-10mMTris-Cl，pH7.5-8.0，1-1.5mMEDTA)中，加4.5～5g的CsCl溶于上述TE溶液中，并加入0.4-0.5ml的溴化乙锭溶液(10-15mg/ml)，混匀后4，200-4，500g离心30-36小时(18-20℃)离心后可见管中形成两条DNA带，小心地用针管吸出下面一条质粒DNA带。用饱和的正丁醇反复抽提吸出的液体，除去其中的溴化乙锭，最后用透析方法除去其中的氯化铯。加4.5-5M的NaCl溶液，使其终浓度为0.25-0.3M，加2-2.5倍体积冷酒精，18，000-20，000g离心沉淀质粒pCH1DNA。最后将DNA沉淀溶于溶量的TE溶液中待用。
上述载体DNA用牛小肠碱性磷酸酯酶处理的过程为5-10μg pCH1质粒DNA用BamHI内切酶完全酶切后，酒精沉淀回收DNA。DNA沉淀用10xCIP缓冲液(0.5-0.6M Tris-HCl，pH9.0-9.5，10-15mM MgCl2，1-2mM ZnCl2，10-15mM Spermidine)2～5μl，双蒸水40～43μl溶解，加CIP酶液(牛小肠碱性磷酸酯酶)1-2μl(5～10单位)，37℃-40℃保温15-30分钟。加40μl-50μl的双蒸水，加10-15μl的10xSTE(0.1～0.15M Tris-Cl，pH8.0-8.5，0.7-1M NaCl，5-10mM EDTA)，2～5μl的10%-20%SDS，在65℃～68℃水浴中保温15分钟。用饱和酚抽提一次，氯仿抽提两次至三次，最后用酒精沉淀法回收去磷后的质粒pCH1DNA，DNA沉淀用适量的TE溶液溶解待用。
本发明运用DNA重组技术从水稻总DNA和叶绿体DNA中克隆了一系列具有启动子功能的DNA顺序，它们都已在大肠杆菌中表达，这些来自水稻总DNA和水稻叶绿体DNA中的启动子顺序的表达，为水稻人工染色体中的外源基因的表达奠定了基础。这一发明将作为水稻人工染色体中必不可少的一部分，使外源的高产、抗病、抗虫害等有利基因在水稻中高度表达，改良现有的水稻品种，从而将产生巨大的经济效益。
权利要求
1.一种由供体DNA及载体DNA经酶切、混合、连接、检测等过程组成的筛选启动子DNA顺序的克隆方法，其特征在于上述的供体DNA采用水稻总DNA，上述的载体DNA为带有lacZ结构基因的PCH1质粒DNA，其中载体DNA用牛小肠碱性磷酸酯酶处理，DNA供体与载体DNA的混合比为2∶1～5∶1，上述的检测采用含有X-gal的平皿筛选法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述的供体DNA采用水稻叶绿体DNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述水稻总DNA的制备过程为水稻种子用10%～15%的消毒剂(安替福民)消毒10分钟～20分钟，25℃～30℃暗室下培养7～10天后剪下黄化苗上部( 1/2 - 1/3 苗高)，迅速加入液氮，捣碎。在冷冻粉未融之前立即加入提取液(40～50mM Tris-HCl pH8.0～8.5，10～12mM EDTA，0.5～0.7NaCl，1%～1.2% 基乙醇，0.8%～1%CTAB)。每克冷冻粉加2～3ml提取液。35℃～37℃水浴保温1～2小时，不时轻轻摇动。保温结束后加入等体积氯仿-异戊醇(24～251v/v)，轻摇10-15分钟，0℃～4℃下5，000～6，000g离心10-15分钟，吸出水相，再重复两次。水相加入等体积的沉淀缓冲液(40-50mM Tris-HCl，pH8.0～8.5，10-12mM EDTA，1%～1.2%CTAB)，室温下静置30～60分钟后用玻棒挑出丝状沉淀，在0.25～0.3M NaAc 70～75%乙醇中浸洗2～3次，并在该溶液中浸过夜。再用95～100%乙醇浸洗两次，抽干乙醇。最后将玻棒上的沉淀物溶于适量的TE溶液中(8～10mM Tris-HCl，1-1.5mM EDTA，pH7.5-8.0)。
4.根据权利要求2所述的方法其特征在于，上述水稻叶绿体DNA的制备过程为水稻种子用10～15%的消毒剂(安替福民)消毒10～15分钟，25℃～30℃下见光培养。7～10天后剪下绿化苗上部(约三分之二苗高)，用清水洗净，称量，加入匀浆液(15～20mM Hepes-Cl pH7.2～7.4，1mM-1.5mM EDTA，0.25-0.3M甘露醇，10mM-15mM KCl，0.1-0.2%BSA)，每100克绿化苗用1000～1200毫升匀浆液，匀浆打碎后用纱布过滤，过滤液用9，000～10，000g离心10-15分钟，收集绿色沉淀物，用100-120毫升悬浮液(5-10mMHepes-Cl pH7.2～7.4，1～1.5mM EDTA，0.2～0.25M蔗糖，0.1～0.2%BSA)悬浮沉淀物，9000g-10，000g离心5～10分钟，去沉淀，上清液用5，000-6，000g离心10-15分钟，收集绿色沉淀物，加10-15mlSIP溶液(90-95%Percoll，5～10mMHepes，1～1.5mMEDTA，0.2-0.25M蔗糖，0.1-0.2%BSA)，最后用悬浮液补至40-45ml，混匀后5，000～6，000g离心30-45分钟，停机后管子顶部有一绿色叶绿体带出现。小心用吸管吸出，加入DNasel(浓度为5～10μg/μl)，使其终浓度为10～20μg/ml，并加入1～1.5M MgCl2，使其终浓度为10-15mM。置4℃-10℃中1-2小时。用悬浮液稀释，4，000～5，000g离心10-15分钟，收集沉淀，重复两次。纯化后的叶绿体用裂解液(10-15mMTris-Cl，pH8.0-8.5 10-15mMEDTA，200-250mMNaCl，1-2%Sarkosyl)加蛋白酶K至终浓度50～100μg/ml，35℃～37℃保温1～2小时。用饱和酚抽提数次至界面无蛋白质出现，最后用氯仿-异戊醇抽提一次，加NaCl至0.25～0.3M，再加2～2.5倍体积的冻乙醇，-20℃～-70℃中置1～2小时，10，000～15，000g离心30-45分钟，回收叶绿体DNA，DNA沉淀溶于适量的TE(8-10mM Tris-Cl，1～1.5mMEDTA，pH7.5～8.0)溶液中。
5.根据权利要求1、2所述的方法其特征在于，上述带有lacZ结构基因的pCH1质粒DNA载体的制备过程为含有质粒pCH1的大肠杆菌HB101在含有氨苄青霉素(50-100微克/毫升)的LB培养液中增殖到对数后期(OD＝0.9～1.0)时，离心收集菌体。离心后的菌体用溶液Ⅰ〔40～50mM葡萄糖，20-25mMTris-Cl(pH7.5-8.0)，5-10mMEDTA，5-10mg/ml溶菌酶〕，每500ml培养液离心后的沉淀菌体用5-10ml溶液Ⅰ悬浮，于室温中置5-10分钟。再加10-20ml新配制的溶液Ⅱ(0.15-0.2NNaOH，1-2%SDS)，混匀后置冰浴中10-15分钟。加7.5-15ml的3M醋酸钾溶液(pH4.6-4.8)，混匀后置冰浴中10-20分钟，12，000～15，000g离心20～30分钟，细菌染色体DNA和其余的细菌碎片都形成坚实的沉淀。将上清液小心倾于一个离心管中，加入0.6-1倍体积的异丙醇，混匀后置室温中15-30分钟。12，000-15，000g离心30-60分钟回收pCH1质粒DNA。倾去上清液，用70%～75%的酒精冲洗DNA沉淀。待酒精挥发干后，溶DNA沉淀于4.5～5ml的TE(8-10mMTris-ClpH7.5-8.0，1-1.5mMEDTA)中，加4.5～5g的CsCl溶于上述TE溶液中，并加入0.4-0.5ml的溴化乙锭溶液(10-15mg/ml)，混匀后4，200-4，500g离心30-36小时(18-20℃)离心后可见管中形成两条DNA带，小心地用针管吸出下面一条质粒DNA带。用饱和的正丁醇反复抽提吸出的液体，除去其中的溴化乙锭，最后用透析方法除去其中的氯化铯加4.5-5M的NaCl溶液，使其终浓度为0.25-0.3M，加2-2.5倍体积冷酒精，18，000-20，000g离心沉淀质粒pCH1DNA，最后将DNA沉淀溶于适量的TE溶液中待用。
6.根据权利要求1，2所述的方法，其特征在于，上述的载体DNA用牛小肠碱性磷酯酶处理的过程为5-10μg pCH1质粒DNA用BamHI内切酶完全酶切后，酒精沉淀回收DNA。DNA沉淀用10xCIP缓冲液(0.5-0.6MTris-HCl，pH9.0-9.5，10-15mM MgCl2，1-2mMZnCl210-15mM Spermidine)2～5μl，双蒸水40～43μl溶解，加CIP酶液(牛小肠碱性磷酸酯酶)1～2μl(5～10单位)，37℃-40℃保温15-30分钟，再加1～2μl CIP酶液(5～10单位)，37℃-40℃保温15-30分钟。加40μl-50μl的双蒸水，加10-15μl的10xSTE(0.1～0.15M Tris-Cl pH8.0-8.5，0.7-1MNaCl，5-10MMEDTA)，2～5μl的10%-20%SDS，在65℃～68℃水浴中保温15分钟。用饱和酚抽提一次，氯仿抽提两次至三次，最后用酒精沉淀法回收去磷后的质粒pCH1DNA，DNA沉淀用适量的TE溶液溶解待用。
7.一种能在大肠杆菌中促进外源基因表达的DNA片段，其特征在于该DNA片段是从水稻总DNA中分离出来的。
8.一种能在大肠杆菌中促进外源基因表达的DNA片段，其特征在于该DNA片段是从水稻叶绿体DNA中分离出来的。
全文摘要
以既能在大肠杆菌又能在酵母菌中复制、同时又带有一个缺乏启动子的Lacz基团的穿梭质粒pCH1作为克隆水稻总DNA、叶绿体DNA的启动子顺序的载体。用牛小肠碱性磷酸酯酶处理酶切后的载体DNA，有效地防止了细菌染色体DNA的污染和载体自身的环化，提高了重组频率。本发明采用X—gal平皿筛选法，具有灵敏、分辨力高等优点。
文档编号C12N15/09GK1042565SQ8810749
公开日1990年5月30日 申请日期1988年11月8日 优先权日1988年11月8日
发明者任大明, 何超刚, 卢勤, 石红, 陈永钢 申请人:复旦大学