专利名称：甘蓝型油菜缺磷特异诱导表达的启动子的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及到一个甘蓝型油菜缺磷诱导特异表达启动子的克隆及应用。
背景技术：
磷是植物生长发育必需的营养元素。植物主要通过根系以磷酸根的形式吸收磷。 由于磷酸根很容易被土壤矿物、金属离子吸附固定以及土壤微生物的转化，所以土壤中磷的生物有效性非常低。缺磷成为限制作物产量和品质提高的主要因素。人们往往通过大量施用磷肥来维持作物产量，这不仅增加了农业生产成本，也加剧了磷矿这种不可再生资源的消耗，而且造成了水体富营养化等环境问题。这就推动了世界范围内植物磷营养高效的研究。科学家期望通过分子生物学方法，借助基因工程培育磷营养高效或耐低磷的作物。 实验表明这是一项经济有效且环境友好的措施。L0pez-BUCio等通过基因工程培育的过量产生柠檬酸的转基因烟草，在低磷条件下，这种烟草可生长更多的叶片，积累更多的生物产量(L0pez-Buci0等，2000)。Wang等将来自拟南芥的紫色酸性磷酸酶基因转入大豆中，在酸性土壤上转基因植株每株结荚数和种子数均大幅提高(Wang等，2009)。Nilsson等将一个 MYB转录因子PHRl在拟南芥中超表达，结果显示转基因植株提高了磷的吸收(Nilsson等， 2007)。在已报道的植物磷营养相关基因转化中，一般是应用组成型、强表达的35S启动子。由于组成型启动子在不同组织和不同环境条件下都能驱动下游基因的表达，结果导致在正常生长条件下，抗逆蛋白也大量产生。这不仅浪费能量，而且影响植物正常的生理代谢，使植物生长异常。因此找到一个在缺磷条件下特异表达的启动子将对植物磷营养基因工程具有重要作用。利用来源于甘蓝型油菜且被缺磷特异诱导表达的启动子构建表达载体而培育磷高效或耐低磷油菜的研究还未见报道。诱导型表达的启动子只在植物遭受磷胁迫时才表达，不会导致抗逆蛋白的过量积累。综合考虑这些因素，本发明试图找到一个被磷胁迫特异诱导表达的启动子，为甘蓝型油菜和其它作物的磷营养基因工程提供新的工具。长期生活在缺磷环境中，植物进化出一系列适应机制来应对缺磷胁迫，包括改变根构型、增加根毛密度、诱导高亲和磷转运子、分泌有机酸和磷酸酶等。生理和表型的变化必然由大量基因的差异表达所介导。Misson等借助生物芯片技术研究拟南芥短期、中期以及长期磷胁_迫下基因表达变化情况，结果显示分别有612个基因被诱导，2M个基因被抑制(Misson等，200 。这就为我们克隆磷胁迫诱导表达启动子提供了可能。目前，有关缺磷诱导特异表达启动子的克隆和应用的报道很少。因此，对缺磷诱导表达启动子的研究和技术发明将不仅有助于研究磷胁迫应答基因的表达调控机制，而且在磷高效或耐低磷作物品种的培育中具有应用价值。本发明就是利用生物技术，从甘蓝型油菜基因组中克隆到一个磷胁迫特异诱导表达的启动子，将该启动子与标记基因GUS融合，转入拟南芥中，验证了该启动子磷诱导表达的特异性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种来自甘蓝型油菜缺磷特异诱导表达启动子。本发明的另一目的是提供上述启动子的应用方法。本发明通过以下技术方案实现申请人:从甘蓝型油菜基因组中克隆得到的不被氮、钾、硫和铁元素缺乏诱导，只被缺磷诱导表达的PBnPRl启动子序列，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。所述的 PBnPRl启动子序列，它是序列表SEQ ID NO. 1中第1-1874位碱基所示的序列或是与序列表SEQ IDN0. 1所示序列同源性在90%以上核苷酸序列，且能被缺磷诱导表达的同源序列。 该启动子在正常以及缺氮、缺钾、缺硫、缺铁条件下，不表达或表达量极弱。在遭受缺磷胁迫后，该启动子能被显著诱导表达。被命名为&1PR1基因是申请人从甘蓝型油菜中克隆得到的一个受缺磷特异诱导表达的基因，其部分核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1中第1875-2014碱基所示，通过生物信息学分析在NCBI数据库中检索到与该基因高度同源的BAC序列，根据该BAC序列设计引物PG2F(5' MGCTTM GAAGTCCGTGAAGGGGTC 3')和 P56oR(5' GGATCCCCACTCCGGCAA CGACTC 3')，同时在该引物对两端加上酶切位点，在甘蓝型油菜基因组中扩增基因&JR1 的启动子序列，将上述扩增出的单一条带测序，得到如序列表SEQID NO 1所示的核苷酸序列。结果显示该序列可与基因BnPRl拼接，且位于基因BnPRl的上游，确定该基因BnPRl为启动子的候选片段，申请人将其命名为pBnPRl。将pBnPRl片段代替植物表达载体pBI121 中的35S启动子，与报告基因GUS融合构建新的植物表达载体。通过农杆菌介导的蘸花法 (floral dip)，将pBnPRl片段及报告基因⑶S转入拟南芥中。经过抗生素筛选、PCR鉴定、 多代纯合，最终获得纯合转化植株。将含有PBnPRl片段及报告基因GUS转化植株在不同条件下进行培养，通过GUS组织化学染色来鉴定该启动子候选片段的表达特性。染色结果表明在正常，缺氮、缺钾、缺硫及缺铁条件下，该转化植株不被染色，说明启动子PBnPRl不被这些条件诱导。在缺磷条件下，转化植株的根部及部分叶脉呈深蓝色，说明启动子PBnPRl 被缺磷诱导高效表达，并且主要在根系中表达(如图3所示)。更详细的技术方案见《具体实施方式
》所述。
序列表SEQ ID NO :1是本发明克隆的甘蓝型油菜中缺磷特异诱导表达启动子的核苷酸序列，其中l_1874bp是本发明的启动子序列，第1875-2010是基因BnPRl的部分核苷酸序列。图1 显示的是从甘蓝型油菜基因组DNA中扩增&1PR1启动子的电泳图谱，图右是 DL2000markero图2 显示的是构建的pBnPRl-pBI表达载体。图3 显示的是不同处理条件下pBnPRl-pBI转化拟南芥的⑶S组织化学染色。
具体实施例方式实施例1油菜缺磷诱导表达启动子pBnPRl的克隆(1)基因&1PR1是申请人从甘蓝型油菜中克隆得到的一个受缺磷特异诱导表达的基因，其部分核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1中第1875-2014碱基所示，在正常条件下培养的甘蓝型油菜中检测不到该基因的表达。为了鉴定该基因启动子的表达特性，首先通过生物信息学分析，在NCBI数据库中检索到与基因BnPRl序列高度同源的BAC克隆AC189399。以AC189399的序列为参照，设计引物PG2F (5 ‘ AAGCTTAA GAAGTCCGTGAAGGGGTC3 ‘)和 P56oR(5 ‘ GGATCCCCACTCCGGCAA CGACTC 3 ‘)，其中带下划线的碱基为添加的限制性内切酶位点，引物PG2F添加了一个Hind III酶切别位点，引物P56oR添加了一个BamH I酶切位点。以甘蓝型油菜华双4号的基因组DNA为模板，利用东洋纺(上海)生物科技有限公司的高保真DNA聚合酶KOD plus扩增基因&1PR1的启动子候选片段。PCR 反应体系为DNA (50ng/μ 1)2. 0 μ 1，ddH20 ΙΙ.Ομ Ι,ΙΟΧ PCR 缓冲液 2·0μ 1，MgSO4 (25mM) 1. 0μ 1，dNTP (2. OmM) 2. 0 μ 1，引物 PG2F (10 μ Μ) 0· 8 μ 1，引物 P56oR(10yM)0. 8μ 1，KOD-plus (IU/μ 1)0. 4 μ 1。其中，PCR 缓冲液，MgSO4, dNTP，KOD-plus DNA聚合酶均来自东洋纺(上海)生物科技有限公司，引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。PCR扩增的条件为94°C预变性3分钟，94°C变性30秒，57°C退火30秒，68°C延伸 2分钟30秒，35个循环，最后68°C保温5分钟。PCR产物在0. 8%的琼脂糖凝胶中电泳，结果呈单一条带(见图1)。(2)测序及序列分析 PCR产物经过纯化，末端加“dA”，与pGEM _T fesy载体 (购自武汉洁洋盛生物科技有限公司)连接。然后转化大肠杆菌DH5 α，经鉴定含有启动子 PBnPRl片段且插入方向正确的阳性克隆送华大基因科技股份有限公司武汉测序部测序， 其序列如序列表SEQ ID NO :1所示，序列长度为2014bp。该序列与基因foiPRl的序列有 140bp重叠，且位于该BnPRl基因的上游，认为是基因BnPRl的候选启动子，申请人将其命名为pBnPRl。该启动子的序列如SEQ ID NO 1中第l_1874bp所示，序列长度为1874个碱基，在该启动子的下游是基因BnPRl的部分核苷酸序列(即，5’端140个碱基)，在SEQ ID NO 1的第1875位碱基“A”为转录起始位点，第1843位碱基为TATA框。实施例2植物表达载体的构建为确定启动子pBnPRl的表达特性，构建含有启动子pBnPRl和标记基因⑶S的植物表达载体。(1)选择实施例1中启动子序列完全正确的克隆，在含有50μ g/ml氨苄的LB培养基中大量摇菌，利用道普公司的小量质粒提取试剂盒提取质粒(方法参见道普公司说明书)。用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切含有启动子pBnPRl的质粒和pB1121 载体(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室代书桃惠赠)。酶切体系如下质粒或 PBI121 载体 33. 0μ 1，10X BamH I 缓冲液 4. 0 μ 1，内切酶 BamH I 1. 0 μ 1，内切酶 Hind III2. 0μ 1(限制性内切酶及缓冲液来自MBI公司)。37°C酶切10小时。酶切产物在0. 8% 的琼脂糖凝胶中电泳，用手术刀片切下目标条带，用道普公司的凝胶回收试剂盒回收(操作方法参见道普公司的试剂盒说明书)。(2)连接回收产物，连接体系如下pBnPRl启动子片段8.0μ1，ρΒΙ121片段 8.0 μ Ι,ΙΟΧ Τ4缓冲液2. 0 μ 1，Τ4连接酶2. 0 μ 1 (连接酶及缓冲液来自MBI公司)。混勻连接体系，4°C连接16小时。(3)将连接产物转化到大肠杆菌DH5 α中。将转化产物涂布在含50 μ g/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37°C培养16小时。挑单克隆在含有50μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基中37°C培养10小时。用引物对PG2F和P56oR来检测菌液。PCR反应体系为菌液 2.0 μ 1，ddH2013. 9μ 1, IOX PCR 缓冲液 2.0 μ 1，dNTP(IOmM)0. 4 μ 1，引物 PG2F(10yM)0. 8μ 1，引物 P56oR(10 μ Μ) 0. 8 μ 1，rTaq (5U/ μ 1)0. 1 μ 1(其中 rTaq 聚合酶， PCR缓冲液购自宝生物工程大连有限公司，dNTP来自Roche公司)。PCR扩增的条件为 94°C预变性3分钟，94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸2分钟30秒，35个循环，最后 72°C保温5分钟。PCR产物在0. 8%的琼脂糖凝胶中电泳，片段大小与pBnPRl启动子相同， 且呈单一条带的克隆认为是阳性克隆。挑选该阳性克隆，摇菌，提质粒，进一步用HindIII 和BamH I双酶切鉴定插入片段大小是否符合。酶切体系及方法同实施例2中的(1)步骤。 将构建好的植物表达载体命名为pBnPRl-pBI。实施例3用表达载体pBnPRl-pBI转化拟南芥将实施例2构建的双元植物表达载体pBnPRl-pBI通过冻融法转化农杆菌 LBA4404。(1)农杆菌感受态的制备接种农杆菌单菌落于50ml YEB培养液中(牛肉浸膏 5. Og/L,胰蛋白胨5. Og/L,酵母提取物1. Og/L,蔗糖5. Og/L,硫酸镁0. 5g/L，用NaOH调pH至 7. 0)。28°C, 200转/分钟振荡培养至OD260为0. 5左右，冰浴30分钟。5000转/分钟离心 5分钟收集菌体，倒掉上清液，然后用IOml 0. 5mol/l NaCl悬浮菌体。再次离心，菌体悬浮于Iml 20mmol/l CaCl2溶液中。取100 μ 1菌液分装到冰冻的1. 5ml离心管中，液氮速冻， 并保存于-80°C冰箱中。(2)冻融法转化农杆菌LBA4404 取1. 0μ g植物表达载体pBnPRl-pBI，加入 IOOy 1冰上解冻的感受态农杆菌中，轻轻混合，冰浴30分钟。然后在液氮中迅速冻1分钟， 37°C水浴融化5分钟，冰浴2分钟，加入ImlYEB培养液。，100转/分钟摇动培养3小时。5000转/分钟离心3分钟，倒去大部分上清液，剩下100 μ 1左右重悬菌体。涂在含有 50 μ g/ml利福平和50 μ g/ml卡那霉素的YEB固体培养基上，培养2天。挑取单菌落于含有50 μ g/ml利福平和50 μ g/ml卡那霉素的YEB培养液中，28 V，200转/分钟摇菌。用实施例2中的特异引物对PG2F和P56oR来确定启动子pBnPRl的存在。PCR反应条件参见实施例2。(3)转化拟南芥。拟南芥的转化采用花序浸润法(floral dip)，参照clough等 (1998)报道的方法并略作修改进行。挑取含有pBnPRl-pBI质粒的农杆菌单菌落接入:3ml YEB液体培养基中(50 μ g/ml利福平和50 μ g/ml卡那霉素)。，200转每分钟摇菌1天， 再将得到的菌液按2% (体积比)接入150ml YEB液体培养基(50 μ g/ml利福平和50 μ g/ ml卡那霉素)中二8°C，200转每分钟振摇使农杆菌的浓度达到0D_约为1.8。在4°C下 5000g离心15分钟，倒掉上清液，菌体重悬于含有0.02% Silwet-77(购自LEHEL SEEDS公司)的5%蔗糖溶液中，溶液最终的0D_约为0.8。将生长良好的拟南芥花序浸泡在菌液中5-10秒，直立并用黑色塑料袋包裹，保湿M小时。除去塑料袋，恢复正常培养植株，约一个月后收获种子。(4)阳性苗的筛选将收获的TO代拟南芥种子用70%酒精消毒1分钟，50% 浓度的84消毒液(市售常用消毒液产品，北京洗得宝消毒制品有限公司http://WWW. beijingxidebao. com. cn/)消毒5分钟，再用灭菌去离子水清洗5次，均勻铺在0. 6%琼脂的1/2MS培育基(附加50mg/L卡那霉素)上进行筛选。约10天可区分出转化苗和野生型苗(即非转化苗)。可见转化苗根生长良好，叶片呈绿色；而野生型苗根几乎不能生长， 叶片呈黄白色。将筛选出的转化苗移栽到营养土(体积比蛭石和泥炭1 1混合而成) 中生长。( 转化苗的PCR鉴定待转化苗长到一定大小，取其叶片，提取基因组DNA(取鲜嫩叶片中提取基因组DNA，具体方法参照李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5) :521-523报道的方法)。用实施例2中的特异引物对PG2F和P56oR来确定启动子pBnPRl的存在(PCR反应条件参见实施例2)。利用引物对 GUlF (5 ‘ GCGTTTCGATGCGGTCAC 3')和 GUlR (5 ‘ GCGAGGTACGGTAGGAGTTGG 3 ‘)来检测 GUS 是否存在。PCR 体系为转化苗的 DNA(50ng/μ 1)2. 0 μ 1，ddH20 13. 9 μ 1, IOX PCR 缓冲液 2· 0μ 1，dNTP(10mM)0. 4μ 1，引物 GUlF (10 μ Μ) 0. 8 μ 1，引物 GU1R(10 μ Μ) 0. 8 μ 1， rTaq(5U/l·! 1)0. 1μ 1(其中rTaq聚合酶，PCR缓冲液购自宝生物工程大连有限公司，dNTP购自Roche公司，引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成)。PCR扩增的条件为94°C预变性3分钟，94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸1分钟，35个循环，最后72°C保温5 分钟。只有启动子PBnPRl和GUS都存在的植株才认为是真正的转化苗，正常培养，收获种子。经过多代培养和抗生素筛选获得纯合转化苗。实施例4转化拟南芥的⑶S组织化学分析将获得的纯合T3代转化拟南芥在1/2强度Hoagland和Arnon营养液(李合生等，200 中培养，待长出6片莲座叶后，将一部分植株进行缺磷，缺氮，缺钾，缺硫和缺铁处理，另一部分材料正常培养，作为对照。处理4天后进行GUS染色。方法是，首先将植株放入5ml含有染色液的离心管中，保证组织全部浸入溶液中。染色液的成分及浓度如下lmg/ ml 的 X-Gluc，100mmol/l 的磷酸盐缓冲液，10mmol/l 的 Na2EDTA, 0. 5mmol/l 的 KjFe(CN)6] 和K4[Fe (CN)6], 20%的甲醇，0. 的Triton X-IOO0然后37°C避光染色12小时。用70% 浓度的乙醇脱色3次，再用100%浓度的乙醇脱色数次，至对照的叶片呈白色。及时照相， 保存实验结果。结果显示缺磷处理拟南芥的整个根及部分叶脉呈蓝色，表明缺磷后启动子 PBnPRl驱动⑶S大量表达；而缺氮、缺钾、缺硫、缺铁以及正常条件下生长的拟南芥各组织器官呈白色，表明这些条件下GUS不被诱导表达(见图3)。主要参考文献1、李合生等.现代植物生理学.北京高等教育出版社，2002 ；2、 Clough S J, Bent A F (1998) Floral dip :a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana. 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权利要求
1.一种不被缺氮、缺钾、缺硫和缺铁胁迫诱导，只被缺磷诱导表达的PBnPRl启动子序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1中第l-1874bp所示。
2.含有权利要求1所述的启动子核苷酸序列的植物表达载体。
3.权利要求1所述的启动子在培育磷高效或耐低磷作物中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域。特征是，从甘蓝型油菜中克隆得到一个不被氮、钾、硫和铁等元素缺乏诱导，只被磷缺乏诱导表达的启动子pBnPR1，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO.1中第1-1874碱基所示。将该启动子与标记基因GUS融合转化拟南芥，结果表明GUS基因只在缺磷条件下表达，在正常及缺氮、缺钾、缺硫以及缺铁条件下都不表达。
文档编号C12N15/82GK102559673SQ20101059575
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者徐芳森, 杨广哲, 石磊 申请人:华中农业大学