甘蓝型油菜sBnFCA-ε基因序列及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域的基因序列，具体涉及一种甘蓝型油菜控制开花相关的 sBnFCA的可变剪接体sBnFCA- ε基因序列及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 外界环境因素(光周期和温度）对植物开花的诱导可以使植物在适宜的环境下开 花，但如果缺少这种诱导，有些植物在其营养生长达到一定阶段后也会自然开花，说明植物 能够感知自身的发育状态，说明自主途径独立于光周期和春化途径之外。由于自主途径突 变体数量和类型有限，自主途径基因的研究相对滞后。
[0003] FCA是拟南芥晚花突变体中首先分离出的自主开花途径重要基因，该基因具有四 个可变剪接体（σ、β、γ和S )，其中只有γ剪接体能编码具有正常功能的蛋白。国内外 研究者采用同源克隆的方法已在小麦、玉米、大豆、水稻、冬性甘蓝型油菜等众多植物中克 隆到了与拟南芥FCA同源的四个剪接体。
[0004] 甘蓝型油菜)是十分重要的油料作物，是国产食用植物油的 第一大来源，在我国食用油市场中具有举足轻重的地位。有关甘蓝型油菜开花相关基因的 研究主要集中于FLC、FRI、CO、FT等少数几个基因上，但春性甘蓝型油菜FCA基因可变剪接 体序列及克隆方法未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜控制开花相关的sBnFCA- ε基因序列。该 基因全长2001bp，编码区全长为1992bp，编码664个氨基酸。本发明以源自甘白种间杂交 后代的新型特早熟春性甘蓝型油菜86为材料，根据GenBank中已报道的拟南芥FCA的序列 保守区，采用同源克隆的方法分离甘蓝型油菜sBnFCA基因，用cDNA-AFLP技术分离花芽分 化不同阶段表达的差异片段，寻找控制开花时间的新基因；用RT-qPCR技术检测已克隆基 因在花芽分化过程中在不同组织(叶和茎尖)的表达水平。为新型特早熟春性甘蓝型油菜的 早熟机理研究奠定基础，为筛选、培育早熟优质油菜新品种提供理论依据和技术支撑。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 一种甘蓝型油菜控制开花相关的可变剪接体sBnFCA-ε序列，所述基因序列如SEQ ID NO. 1第1~2001位所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0007] 优选的该基因序列如SEQ ID NO. 1第1~1948位所示。
[0008] 优选的该基因序列如SEQ ID Ν(λ 1第1807~1980位所示。
[0009] 优选的该基因序列如SEQ ID NO. 1第1928~2001位所示。
[0010] 可变剪接体SBnFCA- ε序列的克隆方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 1.甘蓝型油菜组织总RNA的提取。
[0011] 2.以拟南芥FCA的序列保守区作为种子序列，采用同源克隆的方法分离sBnFCA基 因，用cDNA-AFLP技术分离花芽分化不同阶段表达的差异片段，将检索到的目标EST拼接组 装成甘蓝型油菜的可变剪接体sBnFCA-ε序列；根据该序列，设计能够扩增出全长的基因 特异引物； 如 SEQ ID NO. 3 所示的 sBncFCA-5 ; 如 SEQ ID NO. 4 所示的 sBncFCA-13 ; 如 SEQ ID NO. 5 所示的 sBncFCA-14F。
[0012] 3.以甘蓝型油菜组织RNA反转录得到的甘蓝型油菜cDNA为模板，利用所述基因特 异引物sBnFCA-5, sBnFCA-13和sBnFCA-14F克隆出sBnFCA基因的全长cDNA序列： 如 SEQ ID N0. 6 所示的 sBncFCA-5 cDNA ; 如 SEQ ID NO. 7 所示的 sBncFCA-13 cDNA ; 如 SEQ ID NO. 8 所示的 sBncFCA-14F cDNA。
[0013] 甘蓝型油菜控制开花相关的sBnFCA基因序列在制备甘蓝型油菜品种中的用途 为：采用基因工程手段或者基因干扰方法，调控所述基因序列的表达水平，进而引起甘蓝型 油菜开花调控机制的变化，获得开花时间不同的甘蓝型油菜品种。
[0014] 本发明运用生物信息学手段，通过同源序列比对设计出基因特异引物，用分子克 隆的方法，克隆出甘蓝型油菜控制开花相关的sBnFCA基因；经过序列分析，确定是甘蓝型 油菜sBnFCA基因；组织表达分析表明，sBnFCA在不同组织中均有表达，但表达量具有组织 差异性。
[0015] 本发明具有的有益效果为：在sBnFCA基因的研究上，还可以继续利用相关序列信 息扩增出sBnFCA基因的全长DNA序列，利用转基因、基因干扰以及基因敲除等技术分析其 对油菜开花早晚的影响。也可以研究sBnFCA基因在响应生物节律钟信号上的作用机制，同 时结合育种技术获得适宜的早晚熟材料，为甘蓝型油菜的生产提供理论和实践的指导。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明可变剪接体sBnFCA- ε与已知基因的比对； 图2为本发明sBnFCA- ε推测的蛋白质三级结构示意图； 图3为本发明sBnFCA- ε基因在甘蓝型油菜植株不同组织中表达量示意图。
[0017]
【具体实施方式】： 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明： 实施例1 甘蓝型油菜sBnFCA- ε的gDNA全长序列克隆 1.甘蓝型油菜实验材料取材 以甘白种间杂交后代的新型特早熟春性甘蓝型油菜86为材料。
[0018] 2.提取甘蓝型油菜组织总RNA 3.甘蓝型油菜sBnFCA-ε基因的克隆 (1)用甘蓝型油菜86基因组DNA为模板，以特异性引物sBnFCA-5, sBnFCA-13和 sBnFCA-14F进行克隆，测序，比对，拼接。
[0019] (2)用甘蓝型油菜86的RNA反转录产物第一链为模板，以特异性引物sBnFCA-5， sBnFCA-13和sBnFCA-14F进行克隆，测序，比对，拼接。结果见图1。
[0020] (3)对克隆到的各基因序列进行分析。
[0021] 通过结合电子克隆技术的同源克隆方法得到甘蓝型油菜控制开花相关的 sBnFCA- ε基因序列。该基因 RNA全长1995bp，编码区全长为1989bp，sBnFCA-5编码区序 列 SEQ ID. NO. 1。
[0022] 表1本发明基因克隆所用引物
基因的表达模式分析 1.基因的时空表达 利用 real-time relative quantification PCR(RT-qPCR)技术检测目的基因在不同 发育阶段不同组织中的表达水平。以sBnFCA - γ为内参，用特异性引物sBnFCA-ε-qRT检 测sBnFCA- ε在不同发育阶段的根、茎、叶、花、蕾等组织中的表达水平。
[0023] sBnFCA基因在甘蓝型油菜植株不同组织中表达量见图3。结果显示：sBnFCA- ε 在甘蓝型油菜根、茎、顶端分生组织（茎尖）和叶中均有表达，但在不同组织中表达量不同； sBnFCA-ε在甘蓝型油菜苗期、蕾期和花期均有表达，但在不同生长期表达量不同；该基因 在蕾期表达水平最高，显著高于其它各生长期；茎尖中表达量显著低于其他各组织。
[0024] 2.对克隆到的sBnFCA-ε基因表达产物的氨基酸序列和蛋白质结构进行分析，推 测其功能部位。
[0025] sBnFCA-ε基因编码662个氨基酸，推导蛋白序列见SEQ ID. Ν0. 2,推导蛋白质三 级结构见图2。
【主权项】
1. 一种甘蓝型油菜控制开花相关的可变剪接体sBnFCA-ε序列，其特征在于，该基因 编码的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。2. -种甘蓝型油菜控制开花相关的可变剪接体sBnFCA-ε序列，其特征在于，所述基 因序列如SEQIDNO. 1第1~2001位所示。3. -种甘蓝型油菜控制开花相关的可变剪接体sBnFCA-ε序列，其特征在于，所述基 因序列如SEQIDNO. 1第1~1948位所示。4. 一种甘蓝型油菜控制开花相关的可变剪接体sBnFCA-ε序列，其特征在于，所述基 因序列如SEQIDNO. 1第1807~1980位所示。5. -种甘蓝型油菜控制开花相关的可变剪接体sBnFCA-ε序列，其特征在于，所述基 因序列如SEQIDNO. 1第1928~2001位所示。6. -种如权利要求1所述的可变剪接体sBnFCA-ε序列的克隆方法，其特征在于，所述 方法包括如下步骤： 1) 甘蓝型油菜组织总RNA的提取； 2) 以拟南芥FCA的序列保守区作为种子序列，采用同源克隆的方法分离sBnFCA基因， 用cDNA-AFLP技术分离花芽分化不同阶段表达的差异片段，将检索到的目标EST拼接组装 成甘蓝型油菜的可变剪接体sBnFCA-ε序列；根据该序列，设计能够扩增出全长的基因特 异引物； 如SEQIDNO. 3 所示的sBncFCA-5 ; 如SEQIDNO. 4 所示的sBncFCA-13 ; 如SEQIDNO. 5 所示的sBncFCA-14F; 3) 以甘蓝型油菜组织RNA反转录得到的甘蓝型油菜cDNA为模板，利用所述基因特异引 物sBnFCA-5,sBnFCA-13 和sBnFCA-14F克隆出sBnFCA基因的全长cDNA序列： 如SEQIDNO. 6 所示的sBncFCA-5cDNA; 如SEQIDNO. 7 所示的sBncFCA-13cDNA; 如SEQIDNO. 8 所示的sBncFCA-14FcDNA。7. -种如权利要求1所述的甘蓝型油菜控制开花相关的sBnFCA基因序列在制备甘蓝 型油菜品种中的用途，其特征在于，所述用途为采用基因工程手段或者基因干扰方法，调控 所述基因序列的表达水平，进而引起甘蓝型油菜开花调控机制的变化，获得开花时间不同 的甘蓝型油菜品种。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域的基因序列，具体涉及一种甘蓝型油菜控制开花相关的sBnFCA的可变剪接体sBnFCA-ε基因序列。所述序列编码SEQ？ID？NO.2所述的氨基酸序列。在sBnFCA基因的研究上，可以继续利用相关序列信息扩增出sBnFCA-ε基因的全长DNA序列，利用转基因、基因干扰以及基因敲除等技术分析其对油菜开花早晚的影响。也可以研究sBnFCA-ε基因在响应生物节律钟信号上的作用机制，为新型特早熟春性甘蓝型油菜的早熟机理研究奠定基础，为筛选、培育早熟优质油菜新品种提供理论依据和技术支撑。
【IPC分类】C12N15/29, C12N15/10, C07K14/415, A01H5/00
【公开号】CN105316347
【申请号】CN201510887654
【发明人】罗玉秀, 罗春燕, 杜德志, 赵志刚, 李小安, 姚艳梅, 张生萍
【申请人】青海大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年12月4日