水稻种胚特异表达的启动子及其应用的制作方法

专利名称：水稻种胚特异表达的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及水稻种胚特异表达的启动子的分离及鉴定。
背景技术：
植物作为真核生物中一大类群，其中有部分植物作为植物界最高等的类群，在生 长发育及繁衍后代的过程中能够产生种子，被称之为种子植物。种子在发育过程中主要包 括胚胎发生和种子成熟两个重要的过程，种子成熟后经脱水进入休眠。植物的生命史中，种 子胚在植物传宗接代以及植物形态发生和发育中都具有非常重要的作用，胚的发生及发育 直接影响着植物体的繁殖和发育。虽然前人对种子形态学和生理学研究已有一定的进展， 但对种胚特异性基因的分离及功能研究，并在分子水平上阐明种胚发育机制的报道仍较 少。基因正常而有规律的表达保证了真核生物生长发育的正常进行，其中转录水平的调控， 是基因表达调控中最有效、最直接的调控，也是近年来分子生物学的研究热点之一。在此过 程中，启动子作为基因中一段能准确有效起始转录的DNA序列，是最重要的顺式元件，它通 常位于基因上游，通过与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子相互作用，从而 能够调控基因在特定的组织、特定的发育阶段以及一定的环境条件下表达。高等植物中启 动子一般可分为三类，即组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。其中组织特异 性启动子除具有一般的启动子结构外，同时还存在几种控制组织特异性表达的元件，通常 还有增强子和沉默子的一般特性，其表达特异性由这些元件的种类、数目及相对位置等共 同决定。同时，由于植物基因工程研究中也需要具有特异性、高表达的启动子，从而根据需 要选择或人工构建带有合适启动子的载体，使外源目的基因在植物体内实现特异的高效表 达，或在植物特定的部位或发育阶段生产有用蛋白质或其他代谢产物，以实现对外源基因 表达的定时、定点、定量三维精确调控。因此具有植物组织表达特异性的启动子的分离及鉴 定，也是植物基因工程研究的一个重要方面。鉴于启动子与功能基因在结构及位置上的相关性，故种胚特异性启动子的分离及 关键顺式调控元件的鉴定，不仅是真核生物基因表达调控、种子发育研究的重要内容，也是 寻找相关种胚特异性基因的一种有效途径。以往的研究中，已经从植物病毒和植物本身分别分离到组成型启动子，组织专一 性启动子及诱导型启动子。其中，从花椰菜花叶病毒分离出来的35S启动子是目前植物遗 传操作中最常用的启动子，该启动子能较强地启动基因在双子叶植物中的表达，但是该启 动子在单子叶植物中表达相对较弱。同时，研究发现在组成型启动子的控制下外源基因的 表达存在一些缺陷。如外源基因一般在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都会表达， 这样不但增加了植株的代谢负担，造成植物能量和养分的浪费，而且往往还会造成转基因 植物的某些性状发生改变，影响植物正常的生长发育。而组织特异性启动子可以控制外源 基因在植物特定组织中高效表达，避免外源基因在植物的其它部位表达，减少对植物的不 利影响。同时，采用分子生物学对农作物进行遗传改良过程中，人们也常常期望插入的外源基因能够被限制在特定的组织中表达，从而使植物获得有用的性状，这也就要求通过有效 的组织特异性启动子对靶基因的表达进行调控。近年来，随着人们对种子特异性启动子结 构、功能的深入研究，发现了一系列的种子特异性启动子，为研究种子发育以及获得外源基 因仅在种子中特异表达的转基因植物奠定了基础。如张世平等研究发现水稻醇溶蛋白4a 基因启动子在转基因水稻胚乳中特异表达；Hwang等将水稻球蛋白基因启动子控制的溶菌 酶基因导入水稻中，结果发现，溶菌酶在水稻种子中表达，并且表达的溶菌酶占水稻种子中 全部可溶性蛋白的13%左右；Datta等分离了一个水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子，并 申请了专利保护；Qu等2004年将水稻26kDa的球蛋白启动子和⑶S报告基因连接后导入水 稻，经检测GUS基因仅在种子胚乳中表达；Minic等研究发现拟南芥a -阿拉伯糖苷酶基因 启动子为胚乳特异性启动子。单子叶植物中的禾本科植物包括许多重要经济作物如水稻、 高梁、玉米等。目前，陆桂华等从水稻中分离到花药专一性表达的启动子，王金发等分离到 一段具有启动子功能的重复序列。但水稻中高效表达组织特异性启动子的分离研究工作并 不多。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，亚洲近3/4的人口以日常食用稻米为主。 而研究种子贮藏蛋白表达调控和克隆种子胚特异性启动子是开展稻米品质分子改良工作 的基础。对水稻中胚特异性表达的启动子的功能研究与鉴定，将有利于实现外源基因在转 基因植物特定组织中高效表达，为开展水稻品质分子改良提供重要手段。

发明内容
本发明提供了一种在水稻种胚中特异表达的启动子，命名为OsESPl，并通过基因 工程技术研究它在水稻不同组织中表达的特异性。本发明的技术方案是一种在水稻种胚中特异表达的启动子OsESPl，它是具有 SEQ IDN0. 1中所示核苷酸序列的基因片段。本发明以水稻基因组DNA为模板，该基因组DNA可使用常规手段获得，以通过启动 子序列设计的带有酶切位点Xba UPstl的序列为引物，经过PCR获得启动子OsESPl。本发明以水稻为材料，克隆得到水稻种胚中特异表达启动子OsESPl，将该启动子 与报告基因GUS构建融合表达载体转化水稻并获得相应的转基因植株，GUS染色显示仅在 水稻胚中观察到显色反应，其他组织中没有，证明该启动子特异的在水稻种胚中表达。本发明还提供了一种含有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的表达载体，尤其是表达 载体 pCambial301M: OsESPl。本发明通过试验证明，启动子特异的在水稻种胚中表达，进而可以应用于水稻或 其它植物育种、改良方面。本发明的有益效果是本发明分离并确定一水稻种胚特异性启动子OsESPl。该启 动子位于水稻一号染色体上，由于OsESPl是从水稻中分离出来的启动子，因此，将该启动 子应用于水稻的遗传转化研究中具有可靠的安全性。同时，从分子水平上解析植物种胚发育的调控机制，不仅有助于阐明植物形态、发 育、代谢途径等基础理论，而且可从根本上改良并提高种子品质，增加产量和经济效益、提 高农业生产效率，具有广泛的应用价值。


图1 :PCR得出的片段OsESPl图，其中M:分子量，泳道1是OsESPl片段，泳道2是 阴性对照。图2 植物表达载体pCambial301M: OsESPl构建过程示意图。图3 通过PCR分子检测法，对OsESPl转基因水稻的鉴定结果图。其中M:分子量； 1 阳性对照；2 阴性对照；3 非转基因植株；4-8 :T1代转基因植株。图4 :GUS组织化学染色法，显示启动子特异性的在水稻种胚中表达图。图中A 阴 性对照，水稻种胚中无GUS染色后的蓝色出现，如箭头所示；B 阳性转基因植株T2代种子， 水稻种胚中出现GUS染色后的蓝色，如箭头所示。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步阐述，以下实验步骤及涉及的培养基均为本领 域常规技术，试剂均为市售产品。实施例1 水稻一号染色体上特异表达的启动子序列OsESPl的克隆。通过水稻数据库结合相关基因信息，检索到水稻一号染色体上基因启动子序列， 命名为OsESPl。以水稻“中花11”为材料，提取基因组DNA，以此为模板，利用特异性引物通 过 PCR 获得 OsESPl。1、水稻基因组DNA的提取(1)参照CTAB法，称取0. 2g新鲜组织或_70°C保存的样品，在液氮中充分研磨至 粉末状，研磨中不断缓慢加入液氮，防止材料解冻。(2)将研好的组织迅速转移至预热(65°C )的含有600 u 1CTAB提取液的EP管中， 在65°C中保温15分钟，中间混勻2-3次。(3)取出离心管，冷至室温，lOOOOrpm离心lOmin。(4)用剪好的枪头吸取上清至一新的EP管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(氯 仿甲醇=24 1 (V/V)，下同)，轻轻颠倒混勻，静置lOmin，重复操作2_3次。(5)上清移入另一 EP管中，加入2/3体积异戊醇，轻轻颠倒混勻，lOOOOrpm离心 lOmin，弃上清。(6)用75%乙醇洗涤沉淀，50ulRTE溶解，37°C保温lh。(7)加入350ul的灭菌dd H20,再加400ul的氯仿/异戊醇混勻，lOOOOrpm离心 lOmin。(8)取上清，加入2倍体积(1ml即可)无水乙醇，-20°C沉淀lh，12000rpm离心 lOmin，弃上清。(9) 75%乙醇洗涤沉淀2-3次，干燥后溶于50_100uldd H20。2、以水稻中提取的基因组DNA为模板，通过启动子的序列设计带有合适酶切位点 (XbaUPstl)的引物，通过PCR获得启动子片段OsESPl。(1)引物序列为0sESPl-F(SEQ ID NO. 2) 5’GCTCTAGATATGGAATTACAAGGACAGC-3’ (下划线Xbal 识别序列)；0sESPl_R(SEQ ID NO. 3) 5’ -AACTGCAGAGAGGGCAGAGAAAGAATGC-3’ (下划线Pstl识别序列)。(2) PCR 反应体系:Taq 酶缓冲液(含有 Mg2+) 5u 1, dNTP (2. 5mM)3u 1, OsESP-F 弓 |物、OsESP-R引物(lOiiM)各liil，水稻DNA4iU，Taq酶(博大泰克公司产)0. 5 yl，加灭 菌双蒸水至50iU。(3)PCR 反应程序98 °C 10min，94 °C lmin，58 °C 30s, 72 °C lmin，35 个循环， 72 °C 10min，4°C保存。取5 yl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果，有一 1500bp左右的条 带，结果如图1所示。3、0sESPl启动子片段的回收。电泳后用博大泰克公司的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收产物片段，步 骤如下(1)将凝胶放在紫外灯下用干净的刀片将条带切下，装入灭菌的离心管中，称取胶 的重量，每个管中胶的重量不能超过300mg。(2)按lOOmg胶加700 u 1溶胶液的比例，室温溶胶(或55°C溶胶)，其间偶尔摇 动；装柱，9000rpm，离心30s ；去掉废液。(3) 500 u 1漂洗液(wash buffer)漂洗，12000rpm离心30s。重复漂洗一次。倒掉 废液以后，再于12000rpm离心2min ；(4)将柱子放入一个新的1. 5ml离心管中，在柱子膜中央加入合适体积的洗脱缓 冲液(Eloution buffer，通常用 30 ii 1-50 u 1)，室温放置 2_5min，12000rpm离心 lmin，离心 管中的液体即为回收的DNA片段。实施例2 :0sESPl表达载体的构建(图2)。1、商业化的表达载体pCambial301质粒经Hind III与Nco I双酶切，将载体报告基 因⑶S之前的组成型启动子CaMV35S切除，改造后的载体命名为pCambia1301M。双酶切体系为pCambial301 质粒 15 illHind III2 u 1Nco I2u 1lxM 缓冲液5 u 1加水至50 ii 1，37°C 酶切 3h。2、Xbal、Pstl酶切改造后获得的pCambial301M质粒，37°C酶切3h。双酶切体系 为pCambial301M 质粒 15ii 1Xba12 illPst12u 1lxM 缓冲液5 u 1加水至50 U 13、Xbal、Pstl酶切启动子OsESPlPCR产物，双酶切体系同实施例2. 2。4、将两个回收片段用T4连接酶连接，构建成OsESPl表达载体 pCambial301M: :0sESPl。连接体系如下a、回收的 OsESPlDNA 片段7 u 1b、pCambial301M 载体片段 1 u 1c、T4DNA 连接酶liil
d、T4DNA连接酶缓冲液1 P 1将上述a、b、c、d反应物混勻，16°C反应过夜，用于转化大肠杆菌DH5a。5、大肠杆菌感受态细胞的制备。(1)挑取E. coil DH5 a单菌落接种到5ml的LB液体培养基，于37°C，250rpm震荡 培养过夜。(2)次日将此菌液以的接种量转移至100ml的液体培养基中，继续培养至吸光 度(OD)600 = 0. 4-0.6。(3)将此菌液冰浴lOmin，在无菌条件下转移至预先冰冷的50ml离心管中，4°C， 5000rpm离心lOmin，收集菌体。(4)重悬于 10ml 预冷的 0. lmol/L 的 CaCl2 中，冰浴 lOmin, 4 °C，5000rpm 离心 lOmin，收集菌体。(5)重悬于2ml (含15%甘油)的预冷的0. lmol/L的CaCl2中，分装成100 yl/ 管，-70°C保存备用。6、转化。(1)从-70°C冰箱取出感受态细胞置于冰上溶解。(2)将OsESPl与载体pCambial301M的连接产物5 u 1加至感受态细胞中，充分混 勻，冰上放置30min。(3) 42°C热激90s，在此过程中不要晃动离心管。(4)热激完毕后立即取出放于冰上2min。(5)加入 800 ill 的 LB 液体培养基，37 °C，200rpm 孵育 lh。(6)将菌液涂布在卡那(Kan)抗性的LB固体平板上，37°C培养12h。(7)将平板放入4°C保存。7、阳性克隆的菌液PCR检测。(1)从转化的平板上挑取白色菌落接种到LB液体培养基中，37°C，250rpm震荡培 养 3-4h。(2) PCR 反应体系:Taq 酶缓冲液(含有 Mg2+) 2. 5u 1, dNTP (2. 5mM) 1 u 1, OsESPl-F 引物、OsESPl-R引物(10iiM)各liU，菌液2iU，Taq酶(博大泰克公司产)0. 3 yl，加灭 菌双蒸水至25iU。(3) PCR 反应程序98 °C 10min，94 °C lmin，58 °C 30s, 72 °C lmin，35 个循环， 72 °C 10min，4°C保存。取5 yl进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果，有一 1500bp左右的条
市o8、质粒的提取。(1)将菌液PCR阳性的菌液于37°C，250rpm震荡培养过夜。(2)将菌液转移到离心管中，室温8000rpm离心2min，收集菌体。(3)倒去上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，使残余的液体流出。(4)加入100 yl预冷的溶液I，在涡旋振荡器上剧烈震荡重悬菌体，其中所述溶 液 I 配方为:50mmol/L 葡萄糖、25mmol/L Tris-Cl (pH8. 0) U0mmol/L EDTA (pH8. 0)。(5)加入200 u 1新鲜配制的溶液II，快速颠倒混勻10次，冰浴5min，其中所述溶 液 II 配方为0. 2mol/LNa0HU% SDS。
(6)加入150 u 1预冷的溶液III，温和地颠倒10次，冰浴5min,4°C 12000rpm离心 lOmin，其中所述溶液III配方为:5mol/L乙酸钾60ml、3mol/L冰乙酸11. 5ml、H2028. 5ml、 pH5. 2。(7)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的酚氯仿异戊醇(体积 比为 25 24 1)，反复混勻，4°C 12000rpm 离心 lOmin。(8)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇(体积比为 24 1)，反复混勻，4°C 12000rpm 离心 lOmin。(9)将上清转移到另一干净的离心管中，加入等体积预冷(-20°C )的异丙醇，混勻 后-20°C沉淀 lh，4°C 12000rpm 离心 lOmin。(10)倒掉上清，加入500 u 170%的乙醇洗涤沉淀两次，空气中干燥。(11)加入适当体积的TE溶液和2 u lRNaseA，37°C消化0. 5h。9、pCambial301M: :0sESPl双元表达载体的酶切检测。(l)XbaUPstl对质粒进行双酶切检测，反应体系如下质粒3 U 1Xba10. 5 u 1Pst10. 5u 1lxM 缓冲液1.5 ill加水至15 ill(2) 37°C酶切2h，取10 yl进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得一条1500bp左右的条
市o10、序列测定。以上步骤中获得的阳性克隆pCambia1301M: :0sESPl由山东省农科院高新技术研 究中心测序，序列如SEQ ID NO. 1所示。实施例3 :pCambial301M: :0sESPl植物表达载体转化农杆菌。1、农杆菌感受态细胞的制备。(1)挑取单菌落(EHA105)接种到约3ml的YEB液体培养基中，于28°C，220rpm震 荡培养至0D6(1(1 = 0.5。(2)吸取1. 5ml菌液于离心管中，冰浴lOmin。(3) 5000rpm离心30S，弃去上清液。(4)沉淀用 1. 5ml0. 5M NaCl 悬浮，冰浴 20min。(5) 5000rpm离心30S，弃去上清液。(6)每管用100ia20mM CaCl2悬浮，用于转化，_70°C保存备用。2、DNA直接转化农杆菌。(1)50 ill农杆菌感受态细胞中加入pCambial301M: :0sESPl表达载体质粒DNA 0. 1-1118(5-10111)，之后冰浴30111土11。(2)放入液氮中5min (或lmin)然后立即放入37°C水浴锅中水浴5min。(3)取出离心管，加入0.5ml的YEB，于28°C，220rpm震荡培养3至5小时。(4)取出菌液涂布于含有相应抗生素的YEB平板上，28 V下倒置培养2天左右菌落 可见。
3、阳性农杆菌鉴定。(1)挑取农杆菌单菌落，接种于含有相应抗生素的YEB液体培养基中，28°C震荡培 养过夜。(2)菌液PCR鉴定步骤同实施例2-6。实施例4 农杆菌介导水稻遗传转化。一、以水稻成熟胚为材料诱导愈伤组织。1.消毒取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消1)将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒1分钟；2)倒去酒精，加入100ml30%次氯酸钠(NaCIO)溶液，浸泡30分钟；3)倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。2.诱导与继代培养(以下步骤需无菌操作)1)种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿12-14颗；2)操作完毕用封口膜(Micropore Surgical Tape)封好培养皿，在30°C光照培 养箱，培养4周；3)在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织(淡黄色， 致密呈球状)，置入继代培养基中，在30°C光照培养箱，继代培养1-2周。(没有脱落的可在 原培养基上继续培养)。二、农杆菌培养。挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌(EHA105)菌液100 ill于4ml YEP (含 50mg/lSpec 和 50mg/l Str)培养液中，28 °C，250rpm 振荡培养 20_36h 至菌液 0D6(1。为 0. 8-1. 0。三、感菌与共培养。1)取培养好的菌液1ml于1. 5ml离心管中，4°C，5000rmp，离心lmin，去上清。用 含200 u mol/LAs的30ml AAM感菌液制成悬浮液。2)将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟，愈伤量 没过50ml离心管锥形部位即可。3)将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上浙干30-40分钟；4)将愈伤组织置于共培养基上(上面垫上一层9cm无菌滤纸)。25°C (组培室) 暗培养2. 5天。四、抗性愈伤组织的筛选。将愈伤组织取出，用无菌水清洗6次，其间需不停的振荡。再用含500mg/l羧苄青 霉素(Car)的无菌水浸泡lh。最后置于无菌滤纸上浙干2小时。第一轮筛选将晾干的愈伤转入含250mg/L羧苄青霉素(Car)和50mg/L潮霉素的 选择培养基上进行第一轮选择，30°C，光照培养箱中培养14天；将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含250mg/l羧苄青霉素(Car)和50mg/ 了潮霉 素的培养基上进行第二轮选择，30°C，光照培养箱中培养10天，然后转移到组培室中培养4 天。
将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含250mg/l羧苄青霉素(Car)和50mg/l潮霉素 的培养基上进行第三轮选择，30°C，光照培养箱中培养21天。五、抗性愈伤组织的诱导分化和生根。挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入装有分化培养基的培养皿或塑料广口瓶中，用封口 膜封好，放入恒温培养室中，等待分化成苗(30天左右)。待苗长至lcm左右，放入生根培养
基中壮苗。六、转基因苗的锻炼和移栽。转基因苗从分化到移栽最短时间为两至两个半月。将苗根部和茎叶分化得较完好 的试管挑出，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水，炼苗3天至一周，然后洗去琼脂，移栽 到温室的土钵中生长，检测。实施例5 阳性转基因水稻植株的鉴定。1、植物基因组DNA的简易提取，步骤同实施例1-1。2、以上述简易法提取的植物基因组DNA为模板，以实施例1-2_(2)中RT-PCR引物 进行PCR，扩增出相应大小特异条带的为T1代转基因株系，如图3所示。3、获得的T1代水稻种子，经抗性筛选及分子鉴定，获得T2代转基因植株，进一步 获得T2代种子，以之为材料进行种子胚GUS染色分析。实施例6 ⑶S染色分析。对经PCR方法鉴定为阳性的转基因株系，进一步进行T1代及T2代筛选，对阳性植 株进行GUS活性检测，将准备好的水稻根、茎、叶、小穗、种子等组织浸泡在GUS染液里，37°C 保温过夜。用75%乙醇脱色至阴性对照为白色，于显微镜下观察染色结果，照相并记录，结 果如图4所示。图4显示启动子特异性的在水稻种胚中表达。
权利要求
一种水稻种胚中特异表达的启动子，它是具有SEQ ID NO.1中所示核苷酸序列的片段。
2.一种含有权利要求1的启动子的表达载体。
3.一种含有权利要求1的启动子的表达载体pCambial301M: :0sESPl。
4.如权利要求1所述的启动子在水稻或其它植物育种、改良方面的应用。
5.权利要求1所述水稻种胚中特异表达的启动子的获取方法，其特征是，水稻基因组 DNA为模板，该基因组DNA可使用常规手段获得，以通过启动子序列设计的带有酶切位点 XbaUPstl的序列为引物，经过PCR获得启动子OsESPl。
全文摘要
本发明公开了水稻种胚特异表达的启动子OsESP1及其应用，属于基因工程技术领域。本发明主要是分离出水稻一号染色体上特异在种胚中表达的启动子序列OsESP1，利用遗传学、分子生物学的方法进一步对该启动子序列进行深入、细致的分析，对其表达模式做进一步的验证，证明启动子OsESP1仅在种胚中特异性表达，为开展水稻品质改良及分子育种提供重要手段。
文档编号C12N15/113GK101875936SQ20101022157
公开日2010年11月3日 申请日期2010年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者任怡怡, 刘炜, 姚方印, 房孝良, 李海青, 李臻, 王庆国, 黄聪 申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心