一种水稻种胚pod测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水稻领域，确切地说是一种水稻种胚P0D测定方法。
【背景技术】
[0002] 过氧化物酶（P0D)广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用，光 合作用及生长素的氧化等都有关系。一般老化组织中，P0D活性较高，幼嫩组织中P0D活性 较弱。胚是种子最重要的发芽、生长发育器官，其P0D可以作为种子老化的一种重要的生理 指标。然而，通常情况下，干种子胚因P0D含量较少、活性较低，而脂肪、蛋白质含量较高易 造成干扰，因而难以测定。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种能较准确地检测干种子P0D活性的水稻种胚P0D测定 方法。
[0004] 上述目的通过以下方案实现：
[0005] -种水稻种胚P0D测定方法，其特征在于：包括以下步骤；
[0006] (1)胚P0D提取液的配制：
[0007] 先配制0. 1MpH 8.5Tris-HCl缓冲液：A液，取3. 0285gTris，溶解，定容至 250ml ;B液，取lml浓盐酸，稀释120倍；取250ml A液和73. 5ml B液，混匀，定容至500ml。 用pH试纸校准。
[0008]再在每 100 毫升 0? 1M pH 8. 5 Tris-HCl 缓冲液中加入 10%甘油，2. 5% Tween20。 [0009](2)种子胚POD检测液的配制：
[0010]先配制〇? 2M pH 6. 0磷酸缓冲液：A液，取15. 605g磷酸二氢钠（含2水），溶解， 定容至500ml ;B液，取7. 164g磷酸氢二钠（含12水），溶解，定容至100ml。取438ml A液 和62ml B液，混合，定容至500ml。
[0011] 再取配好0. 2M pH 6. 0磷酸缓冲液50ml，过氧化氢0. 028ml，愈创木酚0. 019ml混 合。
[0012] ⑶取样
[0013] 水稻每个材料种子100粒左右，去壳，用刀片切或镊子挖取水稻胚，约70mg左右 胚，置于-8(TC冰箱，待用。
[0014] (4)胚P0D酶液的提取
[0015] 定量称取20mg胚，置于于研钵中，加上述2ml胚P0D提取液，研磨成勾衆，再加2ml 分两次洗绦，至研磨总体系4ml，4000rpm离心10min。取上清液1. 5ml即为粗酶提取液。
[0016](5)胚P0D酶活性的测定
[0017] 向比色皿加入1. 5ml粗酶提取液，再加入反应液2. 5ml，每隔lmin读数一次，以 0. 2M pH 6. 0磷酸缓冲液为对照调零。470nm处测定5min的0D变化值。做3个重复，计算 平均值。
[0018] (6)结果计算后，即可。
[0019] 结果计算按照以下方法：
[0020] 以每分钟0D变化值表示酶活性大小，以每分钟变化0? 01为1个活力单位：
【主权项】
1. 一种水稻种胚POD测定方法，其特征在于：包括以下步骤； (1) 胚POD提取液的配制： 先配制 0.1 M pH 8. 5Tris-HCl 缓冲液：A 液，取 3. 0285g Tris，溶解，定容至 250ml ;B 液，取Iml浓盐酸，稀释120倍；取250mlA液和73. 5mlB液，混匀，定容至500ml。用pH试 纸校准。 再在每100毫升0· IM pH 8. 5Tris-HCl缓冲液中加入10%甘油，2. 5% Tween20。 (2) 种子胚POD检测液的配制： 先配制0.2M pH 6.0磷酸缓冲液：A液，取15. 605g磷酸二氢钠（含2水），溶解，定容至 500ml ;B液，取7. 164g磷酸氢二钠（含12水），溶解，定容至100mL。取438mlA液和62mlB 液，混合，定容至500ml。 再取配好0. 2M pH 6. 0磷酸缓冲液50ml，过氧化氢0. 028ml，愈创木酚0. 019ml混合。 (3) 取样 水稻每个材料种子100粒左右，去壳，用刀片切或镊子挖取水稻胚，约70mg左右胚，置 于-80 °C冰箱，待用。 (4) 胚POD酶液的提取 定量称取20mg胚，置于于研钵中，加上述2ml胚POD提取液，研磨成勾衆，再加2ml分 两次洗绦，至研磨总体系4ml，4000rpm离心10min。取上清液I. 5ml即为粗酶提取液。 (5) 胚POD酶活性的测定 向比色皿加入I. 5ml粗酶提取液，再加入反应液2. 5ml，每隔Imin读数一次，以0. 2M pH 6. 0磷酸缓冲液为对照调零。470nm处测定5min的OD变化值。做3个重复，计算平均值。 (6) 结果计算后，即可。
2. 根据权利要求1所述的一种水稻种胚POD测定方法，其特征在于：结果计算按照以 下方法： 以每分钟OD变化值表示酶活性大小，以每分钟变化0. 01为1个活力单位：
【专利摘要】本发明公开了一种水稻种胚POD测定方法，包括以下步骤：提取液和检测液的配制、取样、胚POD酶液的提取、胚POD酶活性的测定、本发明研制了一种特殊的提取液，利用Tween20的解脂作用和甘油对POD活性的保护作用，使POD与脂肪充分分离和酶活得到甘油的充分保护，从而能较准确地检测干种子POD活性。
【IPC分类】C12Q1-28
【公开号】CN104762366
【申请号】CN201510169715
【发明人】张瑛, 吴敬德, 滕斌, 宣红, 周俊峰
【申请人】安徽省农业科学院水稻研究所
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月10日