膜测定方法

膜测定方法
【专利摘要】本发明涉及膜测定方法。本发明提供含有细胞的身体样品的测定方法，所述方法包含在导致细胞裂解的条件下，优选地通过去污剂的方式，处理所述样品；并将产生的裂解样品置于导致核酸分子断裂的条件下。本发明还提供核酸断裂条件在增强膜测定中的用途，完成测定的装置和用于该测定的试剂盒。
【专利说明】
膜测定方法
[0001] 本申请是申请号为200680040755.8,申请日为2006年10月31日，发明名称为1莫测 定方法"的中国专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及提高对身体样品测定的准确性、可靠性和/或速度的方法。具体地，本 发明设及使用具有小孔径(例如小于Iwn)的膜或滤器进行的高速测定，特别是含细胞或细 胞碎片的样品。最特别地，本发明设及提高裂解(例如去污剂裂解)介导的膜浓缩测定的方 法和相应的测定试剂盒和装置。
【背景技术】
[0003] 快速诊断测定对在即时检验（point-of-care) (PoC-例如在同医学专业人员商讨 的时间）或在小型的或快速转变的医学诊断实验室中的用途的重要性日益增加。运样的试 验，特别是对化C用途，典型地使用至少一个含有用于接受样品的容积和允许样品同所述装 置的部分相互作用的液体途径的"装置"，例如一次性的管、条、筒、圆筒等，和/或进一步的 试剂。具有相对小的孔径，典型地0.2-5WI1的膜，例如硝酸纤维素是快速诊断测定(例如免疫 测定法)普遍使用的组分。运样的膜可能用做测定的固体相，也用于收集微小颗粒和沉淀的 生物物质。
[0004] 存在两类能用于快速测定含有细胞的样品中的组分含量的普遍方法，例如血中的 血浆蛋白的测定;人们能从液体(如血浆)分离细胞或裂解所述细胞使其穿过膜。在分离方 法中，在分析前，分离过程中或通过使用试验装置本身中的滤器来去除细胞。在细胞裂解方 法中，片段化，并典型地溶解细胞(例如血细胞）的膜，例如通过使用去污剂，从而允许所述 物质通过膜的孔。
[0005] 特别用于即时检验或改进的实验室情形的快速试验一般应限至于少量的(优选简 单的）步骤和仅几分钟的持续时间。运使单独分离细胞的步骤变得不实际并意味着，液体 (例如血浆)分离必须作为装置内的事件的整合部分，或必须使用裂解试剂或其他条件如去 污剂，来裂解/溶解细胞壁和核膜W使样品通过滤膜的孔。特别是对用于定量测定的膜流通 (flow-t虹OU曲)形式，裂解方法是有益的，因为难W用运种形式设计有效的血细胞分离。
[0006] 在用于即时检验的测定中，速度、灵敏度和准确度都是高度渴望的因素，但在测定 的环境中，为了在某些因素（如速度)上给出可接受的性能，做一个"权衡"，在另一些因素 (如灵敏度)上牺牲可能的提高经常是必需的。提供能共同提高运些性质从而在总体上显示 更高性能水平做平衡的方法将具有巨大的价值。
[0007] 也称之为"免疫浓缩测定法"的膜流通测定法的形式是使用小孔径的，典型地是 0.45WI1的膜，该膜特定结合了如抗体、受体、抗体片段等部分。运个形式需要高度无颗粒的 样品，因为即使是少量的具有同膜的孔径差不多大小或超过膜的孔径的颗粒，例如细胞碎 片，都会降低通过膜的液体流通。在最坏的情况下，运能导致通过膜的液体输送的彻底停 止，但即使是较小的膜流抑制也能导致流动问题和/或测定可靠性的劣化。因此，开发膜流 通测定法时，关键问题是W能使任何含有细胞的样品通过膜，而在整个测定过程中没有改 变膜的有效孔径的大小和流动性质的方式处理所述的样品。
[0008] 除此之外，红细胞压积校正是基于能用裂解(尤其是去污剂裂解)方法处理的全血 的定量测定的另一个问题。特别是通过使细胞裂解，裂解物的简单的血红蛋白测量才可能 进行红细胞压积校正。
[0009] 在全血或其它含有细胞的样品的(尤其是去污剂介导的)裂解中，主要目的是裂解 细胞的膜和细胞核的膜，W允许其通过装置，尤其是通过滤器或膜。
[0010] 例如，去污剂侵入膜并产生胶团和蛋白质-去污剂复合物。胶团的大小通常足够小 而使他们通过典型的0.45皿孔径的膜。类似地，离液序列高裂解剂（chaotropMc lysing agents)裂解在膜中支持的蛋白质结构并从而裂解它的结构。
[0011] 虽然膜类型测定中的（例如去污剂)裂解方法具有很多的优点，但极少有商业测定 使用运个方法，特别是对自动测定系统。运一点的一个原因可能是，当细胞膜彻底溶解成胶 团是所期望的时，在环境中经常发生膜堵塞和流动受限。W往运种人为事情(adefac化曰1) 都不予W考虑或不理解，因为先前已经把在裂解测定中的膜运输的限制因素考虑为样品的 细胞周围或细胞内的膜的裂解。例如，在血样中，先前已经将细胞膜或白细胞核膜的不充分 溶解认为是膜堵塞的主要原因。

【发明内容】

[0012] 现在，同先前理解的裂解细胞样品的情况相反，本发明不可思议地证实，甚至非常 少的量的细胞核酸，特别是DNA，能导致膜的决定速度的堵塞和高背景测定信号。
[0013] 因此，在第一方面，本发明提供了一种含有细胞的身体样品的测定方法，所述方法 包括在导致细胞裂解的条件下处理所述样品;并将由此产生的裂解样品置于导致核酸分子 尤其是DNA分子断裂的条件下。优选地，导致细胞裂解的条件包括加入如去污剂等细胞裂解 剂。优选地，所述方法是膜测定方法，更优选地，如下述的"膜捕获"测定方法。所述方法可选 择地和优选地包含(随后将样品通过膜)测定样品（例如样品通过膜的那部分或优选地样品 保留在膜上或被膜保留的那部分)的至少一种组分，或所述样品中的潜在组分和/或可选择 地和优选地将测定值与含有细胞的身体样品中的测定的组分的定性、半定量或定量内容相 关联，和/或可选择地和优选地将测定的组分同至少一种医学或生物学状况相关联。
[0014] 本发明人证实测定装置中膜堵塞的原因是核酸而不是脂质组分的不充分溶解，当 将运样的膜用于浓缩样品中的组分时，既需要提高通过小孔径膜的流通，也需要降低背景 信号。因此提高流动更迅速的进行测定和/或允许在相同周期内处理更大体积的样品，从而 允许从大体积样品中浓缩分析物，并继而提高灵敏度和准确度。
[0015] 因而，在进一步的方面，本发明提供核酸断裂条件在所述测定方法中的用途，该方 法包括裂解的含有细胞的身体样品通过孔径不超过10皿的膜的流动。运个用途提高了所述 测定的性能，并可采取一种或多种形式，或可能提高性质的总体平衡。优选地，所述用途在 膜浓缩测定中增强液体流通膜和/或降低膜上的背景信号和/或增加测定的速度。
[0016] 仍然是在进一步的方面中，本发明也提供了整合了用于接受含有细胞的体液的室 W及至少一种其孔径不超过10皿的膜的测定装置，其中使用的所述装置提供核酸断裂条 件。优选地，该装置含有至少一种核酸断裂的化学和/或生物装置(means),例如本文下面描 述的那些。然后使用该装置提供核酸断裂的条件。
[0017] 仍是在进一步的方面中，本发明提供含有细胞的生物液体测定的试剂盒，所述试 剂盒包括:包含孔径小于大约10皿的膜的装置;和至少一种核酸断裂的化学和/或生物装 置。可选择地和优选地，试剂盒包含至少一种细胞裂解的装置，例如去污剂和/或至少一种 所述样品的组分或潜在组分的测定的试剂。进一步可选择地和优选地，试剂盒包含使用方 法说明书，该方法包括所述细胞的裂解(例如去污剂介导的裂解），然后断裂释放的核酸分 子，使至少一部分得到的样品通过所述的膜。最优选地，该方法是如本文所述的本发明的方 法。
【具体实施方式】
[0018] 如本文提及的，导致核酸链断裂的条件可W是物理条件(如摇动、揽拌和满旋等）、 放射性条件(例如用电磁福射进行处理，例如uv、x-射线或丫-射线福射）、化学条件(例如控 审虹H和/或氧化还原条件)和/或生物条件(例如用酶处理和/或具有核酸裂解性质的内源酶 如核酸酶的激活）。优选的导致核酸断裂的条件是放射性的、化学的和生物学的条件，特别 是加入至少一种的和/或内源酶进行处理。
[0019] 本发明人已经广泛地检查了包含去污剂裂解的含有细胞的样品（尤其是血液)流 过小孔径膜测定的膜堵塞原因。对于相关技术领域的其它技术人员，他们开始假设，典型地 通过去污剂介导的，将膜转变到胶团来控制膜流动。让发明人极其惊奇的是，样品尤其是血 样中的非常小的相对质量的DNA可能具有任何令人关注的尤其是堵塞膜的物理效果。
[0020] 正常人的血液中，每1000个红细胞大约有一个白细胞。红细胞不含有核或DNA，而 白细胞有核并含有DNA。典型的哺乳动物细胞含有70%的水、3%的憐脂、1.1 %的RNA和 0.25 %的DNAW及其它组分。典型的哺乳动物细胞膜含有大约50 %的憐脂和50 %的膜结合 蛋白。运意味着，细胞膜构成了哺乳动物细胞干重的大约20%，与之相比较，DNA为0.8%。仅 看白细胞，膜:DNA质量比为大约25:1。考虑到红细胞有膜而没有DNA，全部血液细胞的膜： DNA质量比为大约1000:1。
[0021] 最初，手工进行使用高剪切力的测定。运个测定没有显示出膜堵塞或高背景信号 的问题。在手工测定中，从手指(finger stick)采集全血并继而通过在含有去污剂脱氧胆 酸盐的液体中的稀释和剧烈摇动许多秒而裂解全血。在下一步中，将裂解的血液通过用抗 体包被的膜过滤，从而捕获分析物。在加入金标抗体及随后加入洗涂溶液后，测量金颗粒发 出的红色信号。
[0022] 随后，发明人开发了上面简单描述的手工操作的测定的自动版本。在运个仪器化 的测定中，通过包含在仪器中的累轻轻地将血液和稀释液揽拌在一起。当用运个仪器分析 血样时，某些样品显示了通过硝酸纤维素膜的不同寻常的流动性质。在某些情况中，流动缓 慢，在少数情况中，液体通过所述膜的流动彻底停止。注意，稀释的液体含有的去污剂比包 含非常高数目的红细胞(红细胞压积80% )的血样的彻底裂解所需的去污剂多。使用作为参 考的相同样品的血浆结果时，低流速的血样常常给出严重高估的分析物浓度。
[0023] 来源于人基因组的DNA非常长，长达5cm，并且，运些链对剪切力非常敏感。在手工 制备的样品中，猜测摇动裂解了DNA，而在仪器中，W非常轻柔的方式将血样与稀释液混合， 且保留下来DNA结构，从而使得DNA堵塞了膜。发明人制备了仅轻柔揽拌的手工制备的样品 并发现也发生了膜堵塞。相似地，在仪器中加工前剧烈摇动所述样品导致流速变得正常且 没有膜堵塞，并校正了血浆分析物浓度的测定。发现具有高比例白细胞巧含DNA)的样品比 正常样品或具有高比例红细胞的样品（其不含DNA)更易产生膜堵塞。
[0024] 运些观察共同支持了发明人的假设，即包含在白细胞细胞核中的DNA是流动问题 的根源。用化学的实验和具体地核酸消化的生物学方法进一步证实了运一点。运些实验也 表明，除导致膜堵塞外，长链核酸也能在膜流通测定中提供非常高的背景信号，从而导致假 阳性或不准确的结果。
[0025] 在本发明的测定方法中，含有细胞的样品通过在相应条件下的处理进行裂解W裂 解细胞膜和细胞核的膜。在优选的实施方案中，用至少一种去污剂处理样品来提供细胞和 细胞膜的裂解，然后裂解核酸分子。
[0026] 如本文指明的，"去污剂"可W是任何能促进憐脂膜转化成能通过小孔膜(如本文 描述的）的例如胶团和/或微粒的小的结构的双嗜性分子。合适的去污剂包括阳离子、阴离 子、两性离子和非离子表面活性剂，但优选阴离子表面活性剂。具体的例子包括;包括胆酸 钢、脱氧胆酸钢(DOC)的胆酸盐去污剂;例如IYiton、吐溫、Genapol ,Lubrol、Thesit、&rij和 Lubrol的聚氧乙締序列去污剂;和其它去污剂，包括十二烷基横酸钢(SDS)、十二烷基-P-D- 麦芽糖巧和辛基-e-D-葡萄糖巧、N-月桂酷肌氨酸钢盐、月桂酷二甲胺氧化物 (Laury Idimethy lamine-oxide，LDAO)、漠化十六烷基S甲基锭（CTAB)和双（2-乙基己基）横 基下二酸钢盐。尽管提到的是钢盐，但显然地，用其它的例如钟、儀等金属生成的盐将同样 有效。最优选的去污剂是脱氧胆酸钢。
[0027] 尽管去污剂的使用是用于本发明的细胞裂解的优选的方法，但本发明同样适合使 用许多其它细胞裂解方法，包括低渗或高渗裂解、离液序列高裂解khatrophic lysis)等。 合适的用于运样的方法的试剂是本领域技术人员公知的并包括；去离子水（用于低渗裂 解）；张力调节剂，例如包括钢盐、儀盐和钟盐的盐(例如化CUKC1)，用于高渗裂解;和离液 序列高试剂，例如氯仿、苯酪或包括异硫氯酸脈(GuSCN)的离液序列高的盐或尿素。
[0028] 如本文所用，术语"核酸"是指核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)的高分子 链，二者均处于纯的形式，并更普遍地W它们的与其它分子包括例如多肤/蛋白质的大分子 的组合的天然形式。特别地，来源于哺乳动物样品的基因组DNA通常W核小体和接头区与其 它的因子如染色质或伴随蛋白组合的组合物存在。优选的，本文提到的核酸是DNA和特别 地，基因组DNA。
[0029] 在本发明的所有方面，如本文上面表明地，适于导致核酸断裂的条件是典型地物 理的、反射性的、化学的和/或生物的条件。优选的条件是导致核酸链断裂的化学的和/或生 物的条件。能用任何的包括各种著名的DNA损伤剂如环氧化物、亚胺类、活化的环丙烷类、杂 环N氧化物化etrocyclic N-oxides)、奎宁等的合适试剂导致DNA化学断裂。优选地，运些 "化学核酸酶"将是通过氧化途径断裂DNA的氧化还原活性(redoxactive)配合物。优选的例 子包括邻菲咯嘟铜，然后是氧化剂、重氮盐、使用金属络合物的光断裂和铁/邸TA系统。
[0030] 可使用任何合适的核酸酶并通常在溫和条件下进行核酸断裂的"生物学"方法。适 用于本发明的核酸酶是能断裂核酸的核巧酸亚基间的憐酸二醋键的酶。已知许多类型的具 有变化的活性、金属依赖性和特异性的核酸酶，包括遗传操作实验中普遍用于产生DNA片段 的"限制酶"。运些酶包括依赖于例如儀和巧等离子的核酸酶。巧依赖核酸酶是优选的用于 本发明的一组，儀依赖核酸酶也是。运些核酸酶的任何一种均是合适的，因为核酸链断裂成 即使是中等长度的片段也通常足W允许样品非限制的通过膜。
[0031] 核酸酶普通的例子包括微球菌核酸酶(S7核酸酶）、Si核酸酶、绿豆核酸酶、DNA酶I (D化Se I)、核酸酶BAL SlBenzonase?。一个具体的合适的核酸酶是微球菌核酸酶(也称为 细球菌核酸酶，因为它衍生自微球菌(Micrococ州S pyrogenes))，该酶是化依赖的内切核 酸酶，其优先在处于Ilnm直径的核小体间的接头区内断裂DNA JNA降解后，降低未断裂DNA 的非常粘的溶液的粘度。
[0032] 在下面的实施例中，将0.1-0.抓/ml的微球菌核酸酶W及ImM CaCb加入用去污剂 裂解的血样中，并在用于膜流动分析前解育30秒。液体流动速度和测定结果被正常化，即使 是对具有高(35x10^L)白细胞计数的血样。同不加入核酸酶的对照相比，Ca2+的省略给出了 相同的低流速和假的高测定结果。
[0033] 如核酸酶等大多数生物材料在水溶液中本来就不稳定。因此，假如将核酸酶稳定 化W使它们能作为本发明装置和/或试剂盒的一部分而长期存放是一个优点。因此，在本发 明的一个实施方案中，W干燥形式提供核酸酶，因而，在将该酶并入诊断测定装置或试剂盒 前将其干燥。
[0034] 干燥核酸酶的优选方法是使用标准的冷冻干燥方法，然而本领域的技术人员也能 容易地使用其它干燥试剂的方法，例如喷雾干燥或真空干燥。
[0035] 在一个实施方案中，将核酸酶作为单独的测定单位进行干燥，例如在反应池上干 燥，例如干燥到室或容器内表面的至少一部分之上。在优选的实施方案中，W至少一种干燥 的(例如冷冻干燥)试剂颗粒(例如小珠或小球)形式提供核酸酶试剂。从Pr i Ce等(美国专利 U. S. Pat No. 3，655，838)可获知球状冷冻干燥颗粒。其公开的球状小珠含有免疫反应的物 质，并通常称为液圈（Iyospheres)。已知某些物质的液圈，例如来源于美国专利 U.S.化*.齡.3,932,943的，且本领域技术人员能容易地将运些已知的方法应用到用于本发 明的核酸酶中。关于液圈的生产，参见例如Wiseman ,William Howard ,Jan igSSl'hes is (Pb.D)-InstiUite of Paper Chemis化y, 1958和美国专利U.S.化t.No.3,655,838)。运些 W及本文引用的所有参考都W其全文引入本文作为参考。
[0036] 在干燥方法中，例如使用冷冻干燥，可能使用标准的低溫保护剂 (croyprotective)、裂解保护剂（Iyoprotective)和/或再水化增强剂来增强干燥的试剂的 性质。典型的试剂包括盐和糖，特别是海藻糖、乳糖、薦糖、脯氨酸、甘露醇、棉子糖和乳酸 钢。海藻糖特别有效。
[0037] 本发明的方法可能额外地包括测定裂解的和处理的（来断裂核酸链)样品的至少 一种组分或潜在组分。合适的用于测定的组分包括任何的品种多样的生物标记物，包括小 分子(例如氨基酸）、维生素、寡肤和多肤(包括抗体、蛋白质和蛋白质组合物）、肤和非肤激 素和许多其它物质。因为该测定方法通常是去污剂介导的细胞裂解测定方法，也可W是测 定膜结合组分如受体的方法。本发明方法尤其提高了血浆中蛋白质、维生素、氨基酸和/或 辅因子的测定。具体的例子包括C反应蛋白（CRP)、维生素 B12、运钻胺蛋白（尤其是全的运钻 胺蛋白）、高半脫氨酸、叶酸、叶酸受体和它们的组合。例如CRP的accute相标记尤其合适。
[0038] 可W本领域公知的许多形式中的任何形式来实现可选择的，且优选的测定样品组 分的步骤。然而，本发明之特别益处在于通过膜测定，尤其是膜浓缩测定方法完成样品组分 的测定。在运种类型的测定中，将特异结合配体如抗体、受体或抗体片段、组合物或衍生物 (例如单链抗体)固定在膜上并用来捕获和浓缩目标分析物。然后可能直接检测运个捕获的 分析物，或更通常的，用将同信号形成部分依次结合或缀合的进一步的（特异的或非特异 的）结合剂(例如抗体)结合该分析物。运样的信号形成部分可能是(my be)放射性的、有色 的、巧光的、化学发光的或生物发光的或能反应或加工底物来产生任何可检测的信号的。所 述测定然后典型地设及检测可检测信号和可选择地，比较运个信号和预定值或标准来测定 (W定性、半定量或定量方式)原始样品中目标组分的浓度。
[0039] 本发明特别优选的形式包含在存在任何必需的金属或辅助因子(例如Mg2+或化2+) 下将含有细胞的身体样品(优选全血样品）同裂解条件如去污剂(例如D0C)和生物的或化学 的"核酸酶"（例如微球菌核酸酶)接触。然后将产生的样品与具有不超过10皿孔径，优选地 不超过化m(例如大约0.45WI1)并具有固定其上的特异结合样品组分(例如CRP)的配体(例如 抗体)的膜接触。一旦样品流过膜，然后用进一步的针对结合到信号生成部分(例如金配合 物)的样品组分的结合剂(例如进一步的抗体)处理膜或支持物。然后检测信号生成部分(例 如比色法)来给出含有细胞的样品中的组分浓度的值或指示(例如低、正常、轻微提高或高 度提高的任何组合）。运样的测定可选择地包括额外的评价细胞总数计数，或特定细胞类型 的细胞计数的步骤，W及可选择地通过运个细胞计数校正测量的值或将测量的值与运个细 胞计数相关联。例如，假如需要，可能通过使用标准方法的血红蛋白比色测量进行血样的红 细胞计数(红细胞压积)值和校正。
[0040] 在本发明的任何方法中，优选在将样品同分离膜接触前进行核酸断裂，但可能可 选择地在已将样品应用到运样的膜之后发生。在后一种情况中，在膜上断裂核酸，典型地在 将样品应用到膜上后通过加入合适的化学或生物试剂（如本文所讨论的）进行。可选择地， 可将断裂剂加在膜之上、之中、周围和/或靠近所述膜。运可能处于干燥包被或颗粒的形式。
[0041] 明显地，通过提供一种W上的膜和/或一种W上的固定的特异结合剂可测定样品 中一种W上的组分，只要能鉴定来源于不同组分的信号，例如通过空间隔离(存在于不同的 膜或膜区域上)或通过使用不同的和可分离的信号(例如具有不同激发和/或发射波长的两 种巧光基团）。
[0042] 测定样品的至少一种组分后，然后可W可选择地将产生的定性或(半)定量值同特 异的生物条件或疾病相联系，或在疾病或生物条件的诊断中用作加权因子或影响因素。例 如，可将高CRP同急性炎症、炎性风湿病相联系和/或同对运样的情况的治疗的需求或运样 的情况的治疗的有效性相联系。
[0043] 本发明提供了核酸断裂条件在测定方法中降低膜堵塞的用途，所述的测定方法包 括在将含去污剂裂解的含有细胞的样品流过孔径为10皿或少于10皿(优选地2皿或更小）的 膜。通常，促进了两个相关的提高并且其中一个或两个可能在任何特定测定中是重要的。基 本上，核酸断裂降低了膜堵塞，且运种提高具有两个主要的结果;增强了液体通过所述膜的 流动和/或降低了来源于所述样品的组分的非特异性捕获。然后，运些每一种提高均具有额 外的优点，因为更好的流动提供了更快的和/或更可靠的测定，并且降低的非特异性结合使 得测定更低的背景信号、更高的灵敏度和更大的分辨力。明显地，本发明提供的"用途"可用 于本文描述的任何方法中，并可使用本文描述的任何化学或生物试剂，或其它技术，而且产 生核酸断裂条件。特别是核酸酶介导的断裂。
[0044] 如本文所指，基于上下文可W认为，"膜"是具有孔径不大于10皿，优选地不大于扣 m(例如Iwii或更小）和更优选地0.5WI1或更小的多孔的膜。具有大约0.45WI1孔径的膜尤其合 适。尽管膜的最小孔径仅被充分流动的要求和适当组分穿过膜的需要所限制，典型地最小 孔径是至少50nm，优选地至少lOOnm，更优选地至少200nm。膜材料是对合适样品的通过稳定 的任何材料，其通常是含水的(aqueous based)但可能含有加入的适当溶剂。硝酸纤维素膜 尤其合适，那些玻璃、聚乙締类、聚丙締类、氣聚合物(例如PTFE或PTFE渗合物或共聚物）、聚 酷胺和其渗合物及共聚物。最优选硝酸纤维素。
[0045] 基于上下文可W认为，在本发明的所有方面提及的样品是含有细胞的样品或衍生 自它们的样品。含有细胞的样品可能含有任何类型的组织和可能包含任何类型的细胞。然 而，最典型地，运些样品是液体样品，其中血液和精液是优选的含有细胞的样品。具有或不 具有改善储存性质和/或降低结合的添加物的全血是优选的含有细胞的样品并在本文用作 例证。明显地，假如执行测定需要的话(例如去为测定释放结合的组分或抽提竞争的分析 物)可W处理运样的血样，但在可能的时候，应当在装置内进行最大数目的步骤来将需要的 时间和处理最小化。
[0046] 本发明的装置包括接受至少一种含有细胞的身体样品（或可选择地但不太优选地 去污剂裂解的含有细胞的样品）的室，并含有本文公开的至少一种膜。该装置可能可选择地 用至少一种裂解剂如去污剂预装来提供细胞裂解，或者可包括将运样的试剂加入其中的 室。在通过所述膜之前，进行细胞裂解，该装置提供核酸断裂的条件，其可选择地和优选地 在细胞裂解过程中或紧随裂解后发生。
[0047] 如本文所述，该装置优选地包括至少一种导致核酸断裂的生物和/或化学试剂，或 包含接受运样的试剂的加入的室。该装置也优选地包含或接受用于浓缩样品的至少一种组 分的特异性结合剂、用于吸附浓缩的组分的第二(特异的或非特异的）结合剂和至少一种信 号生成部分，借此产生相应于目标组分的存在、不存在或浓度的信号。本文公开了所有运些 实体(entities)并且生物测定领域的技术人员公知运些实体。包含在本发明的装置中的膜 可优选地用于固定针对预期的样品中至少一种组分，或可能的组分的至少一种特异结合的 配体。本文公开了合适的结合剂。可选择地，可在支持物如小珠或不可溶的颗粒上固定特异 结合配体，运些小珠或颗粒然后将被膜的作用所固定。
[0048] -种优选的装置包含用于接受血样的室；用于接受包含去污剂(例如D0C)、核酸酶 (例如微球菌核酸酶)和任何金属或辅因子(例如化2+)的稀释剂的室;具有不超过1〇皿，优选 地化m(例如大约0.45WI1)的孔并具有固定其上的针对至少一种分析物(例如CRP、全TC、SAH) 的特异结合配体(例如和抗体或片段，其构建物或衍生物）的膜;和用于接受包含至少一种 额外的结合剂和可选择地信号生成部分的溶液的室。所述装置可能额外地包含用于评价从 所述信号生成部分生成的并相应于(直接地或间接地）目标组分的存在、不存在或浓度的信 号的区域、比色皿或窗口。
[0049] 在相关的和更优选的装置中，所述装置包括用于接受血样的室、要么含有或者适 于接受去污剂的室和含有按已知方法和/或本文公开的那些方法干燥的核酸酶的室。运些 室是=个分离的室，或优选地是一个或两个室，例如，含有去污剂的一个室和含有干燥的核 酸酶的第二个室。该装置将和可W含有如上所述的其它特征。
[0050] 大量形式适用于本发明的装置，包括管、圆筒、筒、瓶、片、棒等。许多运样的形式是 公知的但运些形式的性质不是关键的，只要能提供装置的基本特点。圆筒和筒形式高度合 适，因为它们能容易地提供用于增强液体通过装置的压力。任何本发明的装置可包含用于 评价在操作装置中产生的信号的区域、比色皿或窗口。
[0051] 本发明的试剂盒通常包括本发明的至少一种装置且，至少，试剂盒将包括膜和用 于核酸断裂的材料(例如化学或生物试剂包括本文公开的那些）。典型地的是，提供用于细 胞裂解和膜脂转变成小的胶团/微粒的去污剂，W及本文公开的任何方法中的试剂盒使用 的试剂和/或指导。
[0052] 本发明的试剂盒和装置最优选地适用于自动分析设备或与自动分析设备共同使 用。最合适的是巧P时检验"自动分析设备。
[0053] -个优选的试剂盒包括用于获得血样的可选方式；用于接受所述血样和包含去污 剂(例如D0C)、核酸酶(例如微球菌核酸酶）、任何金属或辅因子(例如化2+)和可选择地缓冲 液的稀释剂的容器;具有不超过化m(例如大约0.45WI1)的孔并具有固定其上的针对至少一 种分析物(例如CRP、全TC、SAH)的特异结合配体(例如和抗体或片段、其构建物或衍生物）； 和用于接受包含至少一种额外的结合剂和可选择地信号生成部分的溶液的容器或室。试剂 盒可能可选择地和额外地包含使用、评价测定的结果和/或将结果与生物状况相联系的指 导。
[0054] 特别优选的试剂盒包括用于获得血样的可选的方式；用于接受所述血样和包含去 污剂(例如D0C)的稀释剂的容器。试剂盒中的容器或第二容器也含有干燥形式的核酸酶(例 如微球菌核酸酶)和任何必需的金属或辅因子(例如Ca2+)。试剂盒也含有;具有不超过2皿 (例如大约0.45WI1)的孔并具有固定其上的针对至少一种分析物(例如CRP、全TC、SAH)的特 异结合配体(例如和抗体或片段、其构建物或衍生物）；和用于接受包含至少一种额外的结 合剂和可选择地信号生成部分的溶液的容器或室。试剂盒可可选择地和额外地包括使用、 评价测定的结果和/或将所述结果与生物状况相联系的指导并也可能可选择地含有干燥或 溶液形式的缓冲液。
[0055] 详细实施方式
[0056] W下将参考非限制性实施例解释本发明。
[0化7]实施例1
[005引按生产商描述的方法在密度梯度介质Polymo;rphprep?(Axis-aiield PoC AS, Oslo ,Norway)上离屯、来源于健康供体的全血。在两个分离的部分中收集总的白细胞和红细 胞。将白细胞计数。将白细胞加入全血中来增加白细胞的数目，使从7x109/L增加到30xl09/ L。将12.5iil富集的血液加入到Iml含有ImM化CI2的稀释液体中（缓冲的脱氧胆酸钢）。将运 个溶液分成50化1的两等份，随后在其中一份中加入2.扣1(0.25U)微球菌核酸酶。将50山等 份的对照溶液和含核酸酶的溶液加到含有0.45WI1孔径的硝酸纤维素膜的膜流通装置 (Nyco化rd试验装置）中。在加入核酸酶后的0秒、60秒和120秒加入等份。当血细胞裂解物已 经W流通方式浸湿了膜后，加入SOiil金标抗体，然后加入SOiil洗涂溶液。应注意，膜结合抗 体和标记抗体被定向到抗不同蛋白，运意味着没有形成=明治结构及实验只显示了金标抗 体和所述膜的非特异性结合。使用反射计(NycoCard阅读器)测量保留在膜上的抗体的红 色。运个仪器WK/S表示颜色的密度，K/S同捕获在膜上的金标记抗体的量成比例。白膜给出 大约0.05的K/S，而非常密的、深红色给出大约5的K/S。
[0059] X 秒后的 K/S
[0060]
'[0061]该表显示了对照的随着解育周期而增加的高的非特异背景^当背景下降到正常的' 低水平(同基于血浆的分析一样低），甚至用第一等份用少于30秒的解育。
[0062] 实施例2
[0063] 在本实验中，没有使用实施例1中使用的密度梯度介质离屯、来将白细胞富集到全 血中。在2500xg将来源于健康供体的全血离屯、15分钟。吸出血浆，随后吸出栋黄层和红细胞 部分的一部分。栋黄层部分含有富集了白细胞的红细胞。最后，从试管的底部获得纯的红细 胞。将富集了白细胞的部分和红细胞部分加入到血浆中来给出同全血一样的红细胞压积， 计数所有=部分的白细胞。在575nm使用岛津分光光度计用分光光度法测量200倍稀释在蒸 馈水中的血红蛋白。 「OOM1
[0065] ~此后，将运=部分命名为C(全血）、W(白细胞富集的血)和R(红细胞部分）O
[0066] 分别将扣1的C、W和R轻柔地同400iil稀释液体混合，将50iil的每一种溶液加到 NycoCard试验装置中，然后加入50iU的金标抗体和50iU的洗涂溶液。如实施例1中所公开 的，定向标记抗体和膜结合抗体使抗不同的蛋白。换言之，运个实验仅显示非特异背景。然 后剧烈摇动裂解的C、W和R稀释物10秒钟，并在上面公开的膜试验装置中处理SOiil的每一种 稀释物。使用Nyco化rd阅读器测量两个系列的标记背景。 「00671
12 ~该表显示，与用纯红细胞部分(R)获得的背景相比较，在W的情况下，非特异背景高 度升高，用C获得的背景轻度升高。摇动将C和W的背景降低到同R的背景相同的水平。 2 在下一个实验中，将化1的C、W和R轻柔地同40化1含有ImM CaCb和0.4U微球菌核 酸酶的稀释液体混合并在上面公开的试验装置中处理。 「nnvnl
[0071] 该表显示，样品的核酸酶消化降低背景到"摇动"水平。用剪切力或DNA的酶消化降 解DNA获得了相同的有利的低背景。核酸酶消化的样品的摇动没有进一步降低背景(没有显 示)。
[0072] 实施例1和別正明了去污剂增溶的全血的核酸酶消化如何将在膜流通试验装置中 的非特异背景降低到同我们用基于血浆的分析获得的背景相同的低水平。下面的两个实施 例显示了在我们的基于同实施例1和2中公开的手动操作的试验装置相同的膜流通系统的 自动分析仪中分析稀释的和裂解的血样的CRP(C反应蛋白）时核酸酶处理的效果。应注意， 运个分析仪W非常轻柔的方式将同样体积的取自手指的全血（l.Siil)同稀释液体(200iU) 混合。换言之，没有剪切力来降解从裂解的白细胞核释放的DNA或该剪切力太小W至于不能 有效作用。
[0073] 实施例3
[0074] 使用自动分析仪分析实施例2中公开的血样C、W和R。血液要么在正常的稀释液体 中裂解要么在含有5mM化Cl2和0.2U微球菌核酸酶的稀释液体中裂解。
[
[0077]该表显示，血样中的CRP-浓度是大约Img/L(基于血浆的测定）。运是健康人的典型 的值。使用血液时，由于血红蛋白的红颜色，必须预期到所述背景的轻度升高。运意味着，样 品R(红细胞和没有白细胞）的CRP-值是基线或CRP的目标值。看用对照稀释液体获得的结 果，它显示，正常全血的CRP结果升高了45%，用白细胞富集的制备物的CRP结果升高了 512%。使用含核酸酶的稀释液体时，没有观察到全血的CRP增加，发现白细胞富集的制备物 的CRP增加了 40%。结论是，当使用正常稀释液体稀释样品W(高白细胞计数)时，显著高估了 CRP。当使用核酸酶时，也似乎轻微高估了运个样品。运表明，在运个实验中本应使用更高浓 度的核酸酶。HCT(红细胞压积)测定显示，运些对所有S个样品是相似的。
[007引实施例4
[0079]在该仪器上分析具有低、中和高血浆浓度的CRP的S个血样。所有S个样品均具有 高白细胞计数。正常的细胞计数是大约7x 109。 「00??0!
[0081 ]使用正常的稀释液体或含有5mM CaCb和0.5U微球菌核酸酶的稀释液体分析样 品。基于实施例3中的结论，在运个实验中将核酸酶的浓度从0.2(实施例3)提高到0.抓。也 基于4-6个平行测定变异系数(CV)。由于样品1的CRP值非常低，没有计算其CV。
[00821
[
[0084] 该表显示，当使用正常稀释液体时，所有S个血样的CRP-浓度均被高估。CRP-浓度 越低，使用血液比血浆的测定间的差别越差。认为使用血浆的测定是正确的值。尤其严重的 是含有低CRP-浓度的样品的差别。样品1高估了 1800%，样品2高估了 185%和样品3高估了 117%。假如我们假定所有=个样品具有相同的固定的非特异背景贡献，运能被预期。
[0085] 使用含有核酸酶的稀释液体时，情况极其不同。所有=个样品的全血测定同血浆 的值相似。此外，当稀释液体中包括核酸酶时，所述测定的CV显著更低。
[0086] 结论是，核酸酶介导的裂解的血样的DNA降解给出了自动CRP-测定的惊人的质量 提升。
[0087] 实施例5
[0088] 按实施例2中公开的方法处理来源于健康供体的全血。全血(C)、白细胞富集的血 液(W)和红细胞（R)显示了相同的红细胞压积。白细胞计数分别是5.9xl09、16.9xl09和 OxIOVL。将25ixr'血液"样品加入到含有2mM MgCh、具有或不具有IU核酸酶的40化1缓冲的 去污剂中。为了将剪切力降低到最低，非常轻柔地将血液同裂解溶液混合。将SOiil运种溶液 加入到膜流通装置(膜面积9.4mm2)和选取流动时间。用抗-CRP抗体包被所述膜。然后加入 50山金标抗-CRP抗体，然后加入50iil洗涂溶液。最终，使用反射计(Nyco化rd阅读器)测量膜 的颜色。在运个实施例中，在膜上的红颜色代表了真正的CRP-信号加上更多或更少量的非 特异性背景信号。

[0090] *用15山血浆来提供同用血样得到的装载相同的血浆装载。
[0091] ^由于堵塞，结合物没有通过膜。颜色是暗红。
[0092] 该表显示，同核酸酶处理的样品相比，全血(C)给出了流动时间的显著增加。对于 样品W，流动时间戏剧性地增加(8倍)并且在应用金标物时液体流动完全停止。当加入核酸 酶时，所有样品均显示了大约23秒的相同的良好的流动。运是同血浆和同没有核酸酶的红 细胞部分相同的流动时间。关于信号，没有核酸酶的全血应该已经导致CRP的非常显著的高 估，关于W，由于DNA介导的膜堵塞，流动完全停止。
[0093] 在核酸酶处理时，所有S个样品给出了大约0.31的非常相似的CRP-信号，该信号 接近于应视为目标值的用血浆获得的信号(0.322)。运个低信号充分地高于用不相关抗体 包被的膜获得的颜色(0.093)，其代表了本应用含有零CRP的样品获得的背景值。因此，运是 低的但显著的0.31的信号，并且与健康血液供体的低CRP水平相一致。
[0094] 实施例6
[0095] 当分析低浓度血液分析物时，为了部分补偿所述低浓度并获得可读的信号，处理 尽可能多的血液是有利的。设计运个实验来测定去污剂介导的血液裂解物能通过0.45皿硝 酸纤维素膜(流动面积9.4mm2)处理的最高可能的血液的量。
[0096] 由于在运个实验的部分使用了巨大量的血液，必须使用高浓度的去污剂来确保去 污剂的效率不会成为弱流动的原因。
[0097] 用具有或不具有IU核酸酶的缓冲的去污剂稀释来源于健康供体的血液（白细胞计 数6.5xlO^L)并在室溫下解育30秒(解育体积为20化1)。将10化1含有从1.5到全血的 运种溶液加入到流通装置中，然后加入50iU的金标抗-CRP抗体和50iU洗涂溶液。测量总的 测定时间(起始于样品应用止于洗涂溶液）。 「00981
[0099] *在样品应用时膜堵塞
[0100] 该表格显示，DNA的核酸酶消化在血液装载的全部水平上导致升高的流动。看一下 测定时间，似乎是具有核酸酶消化的12.5iil的血液给出了同I.化I没有核酸酶的血液大约 相同的测定时间，大约8的因素。从其他角度看一下结果，假如我们需要低于4分钟的快速试 验的总测定时间，运个系统容忍1.扣1的没有核酸酶的血液和25iU的有核酸酶消化的血液， 16.7的因素。广泛而言，在运个免疫-浓缩试验装置中，核酸酶介导的DNA消化允许至少10倍 多的待处理血液。
[0101] 实施例7-核酸酶冷冻干燥程序：
[0102] 在含有 12%海藻糖、0.1%BSA、lmM MgCi2、25mM Tris pH 7.4的缓冲液中在4011/1111 的浓度制备Benzonase?。冷冻运个Benzonase?溶液的等份，然后W本质上已知的方式在- 30摄氏度冷冻干燥。
[0103] 实施例8-冷冻干燥的核酸酶的用途：
[0104] 将冷冻和冷冻干燥的Benzonase?小珠（如实施例7中制备的）置于Af inion?分析 仪CRP圆筒中，并使用Afinion?分析仪处理含有升高的白细胞的血样。通过使用正常化的 CRP值计算并W百分比表达Benzonase?的相对活性。
[01化]在Afinion? CRP测定中的相对核酸酶活性：
[0106] A.-在分析含有升高的白细胞的血样前在Afinion? CRP裂解缓冲液中W40U/ml重 悬Benzonase?高达18小时的各种时间周期，溫度为22摄氏度。
LU'iu8」 K化明，Benzonase'"'似于仕氷息徽甲稳足化1-一大的町间。巧息，巧巧仕IW分W 后降低。
[0109] B-在分析含有升高的白细胞的血样前，在4、22或37摄氏度解育按实施例7中方法 制备的并置于上面公开的Afinion? CRP圆筒中的冷冻和冷冻干燥的Benzonase?小珠高达 2个月的各种时间周期。 「01101
L0111J W冷冻和冷冻干礫的小珠存在时，Benzonase""似乎稳定几个月的时同。
【主权项】
1. 一种含有细胞的身体样品的测定方法，所述方法包含在导致细胞裂解的条件下处理 所述样品，并将产生的裂解样品置于导致核酸分子断裂的条件下。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述测定是膜测定。3. -种提高膜测定方法性能的方法，包含以下步骤； i) 裂解含有细胞的样品以提供裂解样品，其中细胞含有核酸； ii) 断裂该核酸借此提供断裂的样品； iii) 将断裂的样品与膜接触从而使部分断裂的样品通过该膜，而该膜保留部分断裂样 品； 其中可连续地或同时进行步骤ii)和iii)。4. 根据权利要求1到3任一项所述的方法，其中所述测定是膜浓缩测定。5. 根据权利要求1到4任一项所述的方法，其中通过物理条件、放射性条件、化学条件 和/或生物条件提供核酸分子的断裂。6. 根据权利要求5所述的方法，其中通过选自微球菌核酸酶、Sl核酸酶、绿豆核酸酶、 DNA酶I、核酸酶BAL 31或Benzonase?的生物试剂提供所述生物条件。7. 根据权利要求6所述的方法，其中以干燥形式提供所述核酸酶。8. 根据权利要求1到7任一项所述的方法，其中细胞裂解是去污剂裂解、低渗裂解、高渗 裂解或离液序列高裂解。9. 根据权利要求8所述的方法，其中通过选自阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、 两性离子表面活性剂或非离子表面活性剂的去污剂提供所述裂解。10. 核酸断裂条件在提高测定方法性能中的用途，该测定方法包括裂解的含有细胞的 身体样品流通过孔径不超过IOym的膜。11. 根据权利要求1到9任一项所述的方法在权利要求10所述用途中的应用。12. 根据权利要求10或权利要求11所述的用途，以获得至少一种下述改进； a) 降低膜堵塞； b) 降低测定时间； c) 增加可处理的样品体积。13. -种测定装置，其包含用于接受含有细胞的体液的室和至少一种孔径不超过ΙΟμπι 的膜，其中使用的装置提供核酸断裂条件。14. 根据权利要求13所述的测定装置，其中所述装置含有核酸酶。15. 根据权利要求14所述的测定装置，其中所述核酸酶处于干燥形式。16. 根据权利要求13到15任一项所述的测定装置，其中所述装置含有去污剂。17. -种用于测定含有细胞的生物液体的试剂盒，所述试剂盒包括孔径不超过约ΙΟμπι 的膜;和至少一种用于核酸断裂的化学和/或生物材料。18. 根据权利要求17所述的试剂盒，其含有至少一种试剂，其选自： i) 用于引起细胞裂解的试剂， ii) 用于测定样品的组分或潜在组分含量的试剂； iii) 方法使用说明书，该方法包括在包含试剂介导的所述细胞的裂解、然后是因而释 放的核酸分子的断裂、然后是至少一部分产生的样品通过所述的膜。19. 根据权利要求17或权利要求18所述的试剂盒，包括如权利要求13到16任一项所述 的测定装置。
【文档编号】C12Q1/68GK105925670SQ201610239601
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2006年10月31日
【发明人】J·霍尔特伦德, A·坎贝尔, M·博克
【申请人】阿克西斯-希尔德公司