一种枯草芽孢杆菌在处理制革废水总氮中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种枯草芽孢杆菌QBacillus subtil is)在处理制革废水总氮中的应用。
[0002]
【背景技术】
[0003]皮革业是高污染行业，随着皮革工业产量的增加，制革工业排放的污染物也在不断增加，制革废水污染环境问题日益突出。
[0004]由于制革工艺的特点，决定了制革废水成分复杂、颜色深，总氮比较高。总氮(TN)包括废水中的所有含氮化合物，即有机氮(蛋白质、多肽、氨基酸和尿素等)和无机氮(氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮)。众所周知，水体中过多的氮能引起水体富营养化，造成水质恶化，鱼类及其它生物大量死亡；此外，亚硝酸盐可形成致癌物亚硝胺，危害人畜的生命健康；硝酸盐氮可被还原为亚硝酸盐氮；而氨氮会污染大气，用含过量氨氮的废水灌溉土壤时还会导致农作物受到严重危害。
[0005]制革废水中的总氮主要来自两个方面:一是制革脱灰和软化过程中要用到无机铵盐，目前从成本和使用效果来看，还没有可以全部替代无机铵盐的脱灰剂；另一方面制革是以加工胶原纤维一一蛋白质为主要原料的过程，大量的皮蛋白将被水解到废水中，随着废水中蛋白质的氨化，废水中总氮特别是氨氮浓度迅速升高，这使得废水中氨氮浓度很高，达到300-600mg/L，有时候甚至出现废水越处理氨氮浓度越高的现象。在国家环境保护部于2013年12月27日正式发布的《制革及毛皮加工工业水污染物排放标准》(GB 30486—2013)中，明确新设置了总氮控制指标，规定了对污染物总氮的排放限值，对制革现有企业(2014.7.1?2015.12.31)、现有企业(自2016年I月I日起)、新建企业和特别保护地区的总氮直接排放限值分别为70、50、50、20mg/L。由此可见，对制革废水中总氮的治理已不容忽视。
[0006]长期以来，人们较重视对氨氮的处理，对制革废水中总氮的治理在之前并没有引起太多关注。目前控制制革废水中总氮的方法主要有:(1)清洁化生产，即控制源头。近几年学者们致力于开发清洁化脱灰和鞣制工艺，以尽可能减少废水中总氮的含量。(2)生化处理技术。近几年来研究者们探索了去除制革废水中总氮的不同生化方法，包括厌氧-好氧(A/0)工艺、生物膜反应器(MBR)方法等。为了使制革废水中的总氮能达到新的国家排放标准，在采用清洁生产工艺、从源头降低污染物总氮的同时，需要寻找有效的废水处理新技术。
[0007]
【发明内容】
[0008]为了解决以上技术问题，本发明提供一种枯草芽孢杆菌(SaciWiAs1 sub tills)的应用，所述枯草芽孢杆菌保藏号为CCTCC M 2014512，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2014年10月26日，通过从枯草芽孢杆菌菌种中提取出生物絮凝剂，并用该生物絮凝剂处理制革废水中的总氮，绿色环保、不产生二次污染等，消除制革生产中产生的高浓度总氮废水对环境的污染，并构建清洁的制革废水中总氮处理新技术。
[0009]解决以上技术问题的一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于:保藏号为CCTCC M2014512，所述枯草芽孢杆菌应用于降低制革废水中总氮。
[0010]所述枯草芽孢杆菌由制革厂的活性污泥中培育和驯化而得。
[0011]所述培育和驯化步骤如下:
(I)菌种的富集培养:
采集制革厂的活性污泥接种至已灭菌并冷却的LB培养基中，污泥与培养基的培养比例是体积比约1:8-12，于28-32°(:摇床培养46-5011，LB培养基配制如下:蛋白胨8_12g，酵母膏 4-7g，NaCl 8-12g，加蒸馏水到 100mL, ρΗ6.8-7.2，115_125°C灭菌 15_25min ;摇床转速是 100r/min。
[0012](2)菌种的驯化:
将5mL富集培养菌液接种于10mL含有制革废水的LB培养基中28_32°C振荡培养45-50h，并逐渐增加制革废水的量至40 mL、60 mL、80 mL，逐级驯化；逐级驯化，其目的是为了使培养的菌种能够适应制革废水的高浓度总氮。
[0013]通过步骤(I)培养后的活性污泥，即为富集培养菌液。
[0014]驯化过程中菌落是否驯化成功，是通过检测每一级驯化时培养前后含有制革废水的LB培养基的总氮去除率是否始终维持在较高水平而定的，若总氮去除率始终维持在较高水平，则可进行下一级驯化；在好氧反应器中进行驯化；驯化培养基都为LB培养基。
[0015]③菌种的分离:
通过稀释平板法，以固体LB培养基为分离培养基，从已驯化的菌液中分离出各种细菌，并对各菌株进行纯化。
[0016]稀释平板法。即:用无菌移液管吸取20mL已经驯化好的活性污泥，放入带有玻璃珠的三角烧瓶中，振荡，将各种菌的细胞充分分散(用显微镜观察，细胞呈单细胞)。用无菌吸管从中吸取ImL菌体悬浮液加入盛有9mL的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取11^加入另一盛有91^无菌水的试管中，混合均匀，依此类推制成10_1、10_2、10_3、10_ 4UO- 5UO- 6UO- 7不同稀释度的菌体悬浮液。然后用无菌移液管分别吸取不同稀释度的稀释液于无菌培养皿内，再将已灭菌并冷却至45?50°C左右的LB固体培养基倾入到各无菌培养皿内，倾入培养基约为15mL。之后将培养皿在无菌操作台上轻轻前后左右转动，使稀释的菌悬液与融化的琼脂培养基混合均匀，混匀后静置。待平板冷却后，将平板倒置于37°C培养箱中培养I?2天。最后将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到LB培养基的试管斜面上。
[0017]纯化的步骤:将每个斜面中接种的菌株，通过前述稀释平板法分离步骤，反复分离菌种，直至所分离的菌种为纯培养，即菌苔长出后，其菌落特征一致即可。
[0018]优化方案，本发明中还有生物絮凝剂产生菌的筛选，所述培育和驯化还包括生物絮凝剂产生菌的筛选，如以下步骤:
(I)初筛
将分离纯化出的枯草芽孢杆菌菌株接种于絮凝培养基中进行培养，将培养液离心，取上清液进行絮凝活性的初筛，即:取2 mL培养液加入100 mL 4 g/L高岭土悬浮液中，同时以不加培养液的高岭土悬浮液进行对照，观察，以是否出现絮凝来判断是否具有絮凝活性从而进行初筛，若絮凝，则初步判定有产生物絮凝剂的能力，需进一步检测培养液中絮凝剂的絮凝活性大小；絮凝培养基配制如下=NaNO3 1-3 g，KCl 0-11 g, K2HPO4 0.5-1.5 g,MgSO40.3-0.7 g, FeSO4 0.01 g，蔗糖 27-32 g和蒸馏水 1L，除FeSO4 外，其余原料均在 115_125°C灭菌15-25 min，待灭完菌冷却后，将FeSO4溶解于灭菌后的蒸馏水中，过滤，再将过滤后的FeSO4溶液加入该培养基内；
(2)复筛
将初筛出的具有絮凝能力的菌株分别接种于絮凝培养基中培养，45-50h后，以絮凝率的大小作为衡量菌株产絮凝剂能力的大小，从中选出具有生物絮凝剂产生的枯草芽孢杆菌。筛选出的枯草芽孢杆菌既能产絮凝剂，有去除污染物的能力。
[0019]本发明中一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于:利用枯草芽孢杆菌处理制革废水总氮的方法包括以下步骤:
(1)培养基配制:NaNO31.5-2.5g, KCl 0_llg，K2HPO4 0.6-1.2 g，MgSO4 0.3-0.7 g，FeSO4 0.01 g，蔗糖28-32 g和蒸馏水1L，除FeSO4外，其余原料均在115_125°C灭菌15-25min,待灭完菌冷却后，将FeSO4溶解于灭菌后的蒸馏水中，用灭菌过滤器过滤溶解的FeSO 4，用无菌移液管吸取过滤后的FeSO4溶液加入该培养基内；
(2)发酵:将枯草芽孢杆菌菌种接种至装有50mL培养基的250mL摇瓶，放在转速为180r/min的摇床内，于32-38°C条件下振荡培养45-50h ;培养后的菌种再接种至装有10mL培养基的250mL锥形瓶，然后于32-38°C条件下振荡培养24?68h得发酵液，菌种与培养基的接种量比例是体积比1:8-12 ;发酵液是指步骤(2)经过培养24?68h的培养液。
[0020](3)生物絮凝剂的提取:将发酵液放入转速为5000-10000r/min的离心机中，离心lOmin，收集上清液，然后