一株饲用屎肠球菌的高密度发酵培养基及其发酵工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于乳酸菌培养技术领域，涉及一株饲用屎肠球菌的高密度发酵培养基及其发酵工艺。
【背景技术】
[0002]屎肠球菌(Enterococcus Faecium)属于人及动物肠道中的正常菌群，进入肠道后可有效定殖。屎肠球菌发酵产生乳酸，有利于降低肠道环境PH，抑制有害菌的生长。屎肠球菌代谢过程中还会产生过氧化氢，细菌素等物质，对致病菌有一定的杀灭作用，而且不发生药残。鉴于屎肠球菌的以上特性，越来越多的厂家选择其进行微生态制剂的发酵生产。
[0003]传统的乳酸菌发酵多选用MRS培养基，价格昂贵，发酵后的活菌数低于I X 19CFU/mL，在益生菌有效使用剂量固定的情况下，低发酵水平等于变相的增加了成本。低成本的培养基，高效的可放大的发酵工艺对于推进益生菌发酵的产业化有重大指导及实践意义。
【发明内容】
[0004](—)发明目的:
[0005]本发明的第一个目的是提供一种屎肠球菌(Enterococcus f ae c i um) WE1-1OCGMCCN0.7746的低成本高密度发酵培养基；第二个目的是提供一种屎肠球菌(Enterococcusfaecium)WE1-10CGMCC N0.7746的高密度液体发酵工艺。
[0006]( 二 )技术方案:
[0007]本发明的目的通过如下方案获得实现:
[0008]1.本发明提供了一种饲用屎肠球菌(Enterococcus f ae c i um) WE1-1OCGMCCN0.7746的高密度发酵的种子培养基及发酵培养基，其主要成分及含量如下:
[0009]鱼蛋白胨15-20g/L、蔗糖15-25g/L，三水合乙酸钠3_7g/L，三水合磷酸氢二钾l_4g/L，柠檬酸铵l_4g/L，七水合硫酸镁0.05-0.4g/L，一水合硫酸锰0.02-0.2g/L、吐温800.5_2g/L。
[0010]2.本发明提供的种子培养基配制方法如下:
[0011]称取培养基各组分，充分溶解后，用40%氢氧化钠溶液调pH至8.0，定容至所需体积，121°C灭菌20分钟。
[0012]3.本发明提供的发酵培养基的配制方法如下:
[0013](I)发酵罐中装入17g/L氢氧化钠溶液，装液量为50-70 %，0.11-0.16Mpa灭菌lh，冷却后放液，用自来水冲洗发酵罐2-4次后放空发酵罐。
[0014](2)先称取鱼蛋白胨，加入适量自来水搅拌至充分溶解。
[0015](3)依次称取加入其它培养基组分，补加自来水至发酵罐总体积的50-70%。
[0016](4) 400C, 10rpm 保温 lh，用 40%氢氧化钠溶液调 pH 至 8.0 后，0.11-0.16Mpa 灭菌20-40分钟。待温度稳定在40 °C时，校正溶氧为100 %。
[0017](5)灭菌后的培养基在37-42°C，50rpm，不通气条件下空培至接种前。
[0018]4.本发明提供的一级摇瓶种子液的培养方法:
[0019]挑取新鲜培养的屎肠球菌(Enterococcusfaecium) WE1-10 CGMCC N0.7746 斜面(斜面为MRS琼脂培养基，成分参照GB 478935-2010，下同)，接种至种子摇瓶培养基中，37-42°C静置培养1h作为一级摇瓶种子液。
[0020]5.本发明提供的50L发酵罐规模条件下的高密度发酵工艺如下:
[0021](I)发酵前对发酵培养基及一级摇瓶种子液进行镜检，确保无杂菌污染。
[0022](2)接种前将50L发酵罐转速调至lOOrpm，并用灭菌的40%氢氧化钠溶液调节发酵培养基的PH至7.5-8.5后，按照0.5-4%的接种量将一级摇瓶种子液接入发酵罐中。
[0023](3)发酵。发酵参数设定为:温度37-42°C ;转速10rpm ;不通气；发酵液pH下限设定为6.4-6.8，当pH降至设定值以下时，自动补氨水使pH维持在设定值；发酵开始
4.5-5.5h，第一次补加500g/L的蔗糖，补加量为发酵液体积的2% ;发酵液的pH不再下降时，第二次补500g/L的蔗糖，补加量为发酵液体积的2% ;发酵结束时间设定为12-18h。
[0024]6.本发明提供的5吨发酵罐规模条件下的高密度发酵工艺如下:
[0025](I)先进行一级摇瓶种子液的培养。
[0026](2)在100L发酵罐中配制二级种子培养基，培养前对二级种子培养基及一级种子液进行镜检，确保无杂菌污染。接种前将100L发酵罐转速调至lOOrpm，并用灭菌的40%氢氧化钠溶液调二级种子培养基pH至7.5-8.5后，按照0.5-2%的接种量将一级摇瓶种子液接入100L发酵罐中，发酵1h结束作为二级种子液。
[0027](3)进行5吨发酵罐发酵前，对发酵培养基及二级种子液进行镜检，确保无杂菌污染。接种前将5吨发酵罐转速调至lOOrpm，并用灭菌的40%氢氧化钠溶液调pH至7.5-8.5后，将二级种子液全部转接至5吨发酵罐中进行发酵。发酵参数设定为:温度37-42°C ?’转速10rpm;不通气；发酵液pH下限设定为6.4-6.8，当pH降至设定值以下时，自动补氨水使pH维持在设定值；发酵开始4.5-5.5h，第一次补加500g/L的蔗糖，补加量为发酵液体积的2% ;发酵液的pH不再下降时，第二次补500g/L的蔗糖，补加量为发酵液体积的2% ;发酵结束时间设定为12-18h。
[0028](三)意义:
[0029]本发明优化了屎肠球菌(Enterococcusf ae c i um) WE1-1OCGMCC N0.7746 的高密度发酵的种子培养基和发酵培养基，通过发酵过程中流加氨水控制发酵液pH和分批补加鹿糖的策略，实现了屎肠球菌(Enterococcus f ae c i um) WE1-1OCGMCC N0.7746的高密度发酵，50L发酵罐规模条件下活菌数达到2.5X1010CFU/mL, 5吨发酵罐规模条件下活菌数达到2.9X1010CFU/mL,分别是相同发酵规模条件下传统MRS培养基分批发酵活菌数的34倍和36倍以上，活菌数在已报道的屎肠球菌高密度发酵中是最高的，培养基成本比MRS培养基降低了 23.17%，实现了作为微生态制剂屎肠球菌的低成本、高效率的生产。
【附图说明】
[0030]图1 为屎肠球菌(Enterococcus f ae c i um) WE1-1OCGMCC N0.7746 分别在高密度发酵培养基和传统MRS培养基中发酵生长曲线的比较。
[0031]图2 为屎肠球菌(Enterococcus f ae c i um) WE1-1OCGMCC N0.7746 在不同喊性 pH中和剂流加条件下的发酵生长曲线。
[0032]图3 为屎肠球菌(Enterococcus f ae c i um) WE1-1OCGMCC N0.7746 在不同恒定 pH条件下的发酵生长曲线。
[0033]图4 为屎肠球菌(Enterococcus f ae c i um) WE1-1OCGMCC N0.7746 在 5 吨发酵耀规模条件下的高密度发酵生长曲线。
【具体实施方式】
[0034]下列具体实施例可以更好地说明本发明，但本发明的应用范围并不仅限于以下实施例。
[0035]本发明所选用的菌株为本单位从健康仔猪肠道中分离得到，经16S rRNA及生化鉴定，确定为屎肠球菌，命名为WE1-10。并于2013年6月19日送中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC N0.7746，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所邮编:100101电话:86-10-64807596。
[0036]实施例一:高密度种子培养基和发酵培养基的配制及发酵活菌数的比较
[0037]1.屎肠球菌(Enterococcus faecium) WE1-10CGMCC N0.7746 的高密度发酵种子培养基和发酵培养基的主要成分及含量如下:
[0038]鱼蛋白胨15-20g/L，蔗糖15_25g/L，三水合乙酸钠3_7g/L，三水合磷酸氢二钾l_4g/L，柠檬酸铵l_4g/L，七水合硫酸镁0.05-0.4g/L，一水合硫酸锰0.02-0.2g/L、吐温800.5_2g/L。
[0039]优选的种子和发酵培养基的成分和组成为:鱼蛋白胨17g/L、蔗糖19g/L，三水合乙酸钠5g/L，三水合磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L, 一水合硫酸锰0.05g/L，吐温 80 lg/Lo
[0040]2.种子摇瓶培养基配制方法如下: