专利名称：粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的培养基及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物菌种培养基及其检测方法，特别是一种粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的培养基及其检测方法。
背景技术：
微生物球菌特别是粪肠球菌、屎肠球菌和乳酸片球菌作为农业部批准使用的有益微生物菌种之一，已被广泛应用于养殖业中，为减少和避免使用抗生素发挥了很大作用。但长期以来，益生菌特别是粪肠球菌、屎肠球菌和乳酸片球菌的检测使用的是乳酸细菌培养基即MRS培养基和普通营养琼脂粉且琼脂粉在培养基中的含量较高，这样检测时培养基很容易出现凝结成块，菌落与培养基斑点混淆不清，难以准确计数的缺点。
发明内容
本发明的目的就是要提供一种粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的培养基及其检测方法，其提供了一种更为有效的检测培养基和检测方法，能克服上述缺点，为粪肠球菌、屎肠球菌和乳酸片球菌提供检测的培养基不易凝结成块，菌落与培养基斑点清楚，计数准确。本发明粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的检测培养基技术方案是这样来实现， 包括蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、琼脂粉、氯化钠或磷酸二氢钾、葡萄糖，还包括有碳酸钙。本发明所述的粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的检测培养基，其包括如下质量组份混合组成蛋白胨10-15、牛肉膏5-8、葡萄糖15-20、氯化钠5_8、琼脂粉10-12、碳酸钙 10-20、和蒸馏水1000-1500，或蛋白胨10-15、牛肉膏5_8、葡萄糖15-20、酵母膏5_8、磷酸氢二钾3-5、碳酸钙10-20、琼脂粉10-15、和蒸馏水1000-1500 ；亦或是由蛋白胨10-15、牛肉膏5-8、葡萄糖15-20、琼脂粉10-12、碳酸钙10-20、蒸馏水1000-1500、和氯化钠5_8、酵母膏5-8、磷酸氢二钾3-5的一种或任意几种的组合构成。本发明所述的粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的检测培养基，所述培养基由如下质量的组份混合组成蛋白胨10、牛肉膏5、葡萄糖20、氯化钠5、琼脂粉10、碳酸钙10、蒸馏水1000 ；或蛋白胨10、牛肉膏5、葡萄糖20、酵母膏5、磷酸氢二钾3、碳酸钙10、琼脂粉10 蒸馏水1000。本发明所述的粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的检测培养基，所述的培养基中琼脂粉的加入量为培养基总质量的0. 8-1. 4Wt%。本发明所述的粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的检测培养基，所述的培养基中碳酸钙的加入量为培养基总质量的l_2Wt%。一种粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的检测方法，其是采用上面所述的检测培养基，按下述方法步骤进行1)样品稀释a)将检测样品称量后置于盛有无菌生理盐水的容器中，加入玻璃珠，置于摇床震荡30-50分钟，得样品液；b)将样品液移入盛有无菌水的三角瓶中，充分振摇使样品均勻分散，制成10-2的样品稀释液，再以此无菌操作制成相应适当的稀释度；2)平板制作a)、选用2-3个上述相应适当的稀释度，分别置于不同的培养皿内，每个稀释度做2-3个重复；b)、将45-52°C保温的培养基倒于培养皿中，使之均勻混合冷却制成培养皿平板。3)培养和计数将2)步制 成的培养皿平板倒置于30-35°C恒温箱内，培养48_72h，观察长出的菌落，计算含有透明圈的菌落数目，选择含有30-300个菌落的培养皿平板进行结果计算。本发明采用上述方案在粪肠球菌、屎肠球菌和乳酸片球菌的检测培养基中加入碳酸钙，同时控制琼脂粉的加入量，其加入量占培养基总量的左右；与现有的乳酸细菌培养基MRS以下简称MRS相比，由于本发明培养基在检测过程中产生的乳酸溶解菌落周围的碳酸钙形成透明圈，培养基不会凝结成块，菌落与培养基之间斑点清晰，计数准确。
图1为本发明检测培养基及检测方法检测粪肠球菌、屎肠球菌和乳酸片球菌样品时的结果照片图。图2为采用MRS培养基与采用本发明培养基检测粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌样品时的结果照片对照图。图1中结果可以看出图中培养基均一，菌落清晰，菌落透明圈非常明显，容易计数。图2中左边为用MRS培养基所检测的倒培养皿，倒培养皿中有很多半透明凝结物， 且颜色较深，影响准确计数；右边为用本发明检测培养基所检测的倒培养皿，倒培养皿中球菌的透明圈非常明显，菌落清晰可见，且整个倒培养皿色泽较浅，计数很容易。
具体实施例方式实施例1粪肠球菌、屎肠球菌和乳酸片球菌样品检测取l.OOg含粪肠球菌、屎肠球菌和乳酸片球菌的粉末样品，采用培养基葡萄糖 20. Og蛋白胨10. 0g，牛肉膏5. Og,酵母膏5. Og,磷酸氢二钾3. Og,碳酸钙10. Og,琼脂粉 10. Og蒸馏水1000克，pH自然，依次按照所述检测过程稀释至IO7倍倒平皿即倒培养皿，以下简称倒平皿，检测结果如图1。检测仪器和器具10ml, Iml无菌移液管，250毫升无菌三角瓶，50毫升无菌三角瓶或试管，无菌生理盐水，无菌培养皿，旋涡均勻器或震荡培养器，恒温培养箱。检测过程和方法1)样品稀释准确称量粉末状样品l.OOg，放于装有99. Oml无菌生理盐水三角瓶中，预先放 10 20粒无菌玻璃珠，置于摇床震荡30分钟，用无菌移液管吸取样品Iml加入盛有99ml 无菌水的三角瓶中，在旋涡均勻器上充分振摇，务必使样品均勻分散，即为10_2的样品稀释液，然后根据对样品含菌量的估计，将用无菌操作方法样品稀释至适当的稀释度。2)平板制作选用2-3个适合的稀释度，培养皿贴上相应的标签或用记号笔写上编号，分别吸取不同稀释度的稀释液Iml置于培养皿内，每个稀释度作2-3个重复。然后用45°C -52°C 保温的培养基倒于培养皿，迅速转动培养皿使之混合均勻，冷却成平板。培养基要求 45°C-52°C保温，倒培养皿时注意均勻，特别是沉在培养基底部的碳酸钙要求在培养皿中使之分布均勻。3)培养和计数将培养皿倒置于30_35°C恒温箱内培养48_72h，观察长出的菌落，计含有透明圈的菌落数目，选择含有30-300个菌落的培养皿进行结果计算。实施例2本发明检测培养基与常用检测培养基MRS对照，检测方法、检测仪器和器具同实施例1或按现有技术方法进行。
1、本发明检测培养基取1. OOg含粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸片球菌的粉末样品， 采用本发明检测培养基蛋白胨10. Og牛肉膏5. Og,葡萄糖20. Og,氯化钠5. Og碳酸钙 10. Og,琼脂粉10. Og,蒸馏水1000克进行检测；2、采用常用的乳酸细菌培养基MRS 蛋白胨10. Og牛肉膏10. Og酵母膏5. Og柠檬酸氢二铵2. Og葡萄糖20. Og吐温801. OmL乙酸钠5. Og磷酸氢二钾2. Og硫酸镁0. 58g硫酸锰0. 25g琼脂18. Og蒸馏水1000克ρΗ6· 2-6. 6进行检测依次按照所述检测过程稀释至IO7倍倒培养皿，检测结果如图2 左边用MRS培养基所检测的倒培养皿，倒培养皿中有很多半透明凝结物，且颜色较深，影响准确计数；右边为用本发明检测培养基所检测的倒培养皿，倒培养皿中球菌的透明圈非常明显，菌落清晰可见，且整个倒培养皿色泽较浅，计数很容易。
权利要求
1.一种粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的检测培养基，包括蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、 琼脂粉、氯化钠或磷酸二氢钾、葡萄糖，其特征是还包括有碳酸钙。
2.依据权利要求1所述的粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的检测培养基，其特征是包括如下质量组份混合组成蛋白胨10 -15、牛肉膏5 -8、葡萄糖15-20、氯化钠5-8、琼脂粉10-12、碳酸钙10-20、和蒸馏水1000-1500，或蛋白胨10-15、牛肉膏5_8、葡萄糖15-20、 酵母膏5-8、磷酸氢二钾3-5、碳酸钙10-20、琼脂粉10-15、和蒸馏水1000-1500 ；亦或是由蛋白胨10 -15、牛肉膏5 -8、葡萄糖15-20、琼脂粉10-12、碳酸钙10-20、蒸馏水1000-1500、 和氯化钠5-8、酵母膏5-8、磷酸氢二钾3-5的一种或任意几种的组合构成。
3.依据权利要求2所述的粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的检测培养基，其特征是所述培养基由如下质量组份混合组成蛋白胨10、牛肉膏5、葡萄糖20、氯化钠5、琼脂粉 10、碳酸钙10、和蒸馏水1000 ；或蛋白胨10、牛肉膏5、葡萄糖20、酵母膏5、磷酸氢二钾3、 碳酸钙10、琼脂粉10、和蒸馏水 1000。
4.依据权利要求1或2所述的粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的检测培养基，其特征是培养基中琼脂粉的加入量为培养基总质量的0. 8-1. 4fft %。
5.依据权利要求1或2所述的粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的检测培养基，其特征是培养基中碳酸钙的加入量为培养基总质量的l-2Wt %。
6.一种粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的检测方法，其特征是以权利要求1-3之一所述的检测培养基为培养基，按下述方法步骤进行样品稀释将检测样品称量后置于盛有无菌生理盐水的容器中，加入玻璃珠，置于摇床震荡30-50 分钟，得样品液；将样品液移入盛有无菌水的三角瓶中，充分振摇使样品均勻分散，制成10_2的样品稀释液，再制成相应适当的稀释度；平板制作a)、选用2-3个上述相应适当的稀释度，分别置于不同的培养皿内，每个稀释度做2-3 个重复；b)、将45-52°C保温的培养基倒于培养皿中，使之均勻混合冷却制成培养皿平板；3)培养和计数将2)步制成的培养皿平板倒置于30-35°C恒温箱内培养48-7池，观察长出的菌落，计算含有透明圈的菌落数目，选择含有30-300个菌落的培养皿平板进行结果计算。
全文摘要
本发明公开了一种粪肠球菌、屎肠球菌及乳酸片球菌的培养基及其检测方法；包括蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、琼脂粉、氯化钠或磷酸二氢钾、葡萄糖，还包括有碳酸钙；所述的培养基中琼脂粉的加入量为培养基总质量的0.8-1.4Wt％；本发明为粪肠球菌、屎肠球菌和乳酸片球菌提供检测的培养基不易凝结成块，菌落与培养基斑点清楚，计数准确。
文档编号C12Q1/06GK102154439SQ20101061974
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者杨林海, 钟启平 申请人:宜春强微生物科技有限公司