专利名称：一株粪肠球菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株微生物及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
酪胺的化学名称为对羟基-e苯乙胺，是合成药物的重要中间体，可以作为生化 试剂，目前，我国酪胺及其衍生物的需求量大，但国内尚无企业能生产出合格产品，从国外 进口价格很高。 传统的酪胺生产是采用化学合成方法，对环境污染大，生产效率低，难以提纯。以 酪氨酸为前体，利用微生物产生的酪氨酸脱羧酶，通过微生物代谢生产酪胺，获得高浓度酪 胺液，然后分离酪胺，可降低酪胺的生产成本和能源消耗，也成为研究的主要课题。
发明内容
本发明的目的在于针对目前酪胺生产存在的问题，提供一种微生物并通过该微 生物代谢产生酪胺，获得高浓度酪胺液。 本发明的目的是这样实现的一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)xltyr001， 其特征在于保藏号为CGMCC No. 3164，菌落在MRS琼脂培养基上，37。C培养24h，在MRS 液体培养基中富集，乳白色菌落，菌体卵圆形，顺链方向延长，成对或成短链，革兰氏阳性， 发酵葡萄糖产乳酸，该菌株在普通显微镜下椭圆形，其16S rDNA的Genbank登陆号为 GQ890356。 在本发明中所述的MRS液体培养基为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠 檬酸氢三铵2g，葡萄糖20g，吐温80 lmL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0. 5g，硫酸锰 0. 25g，蒸馏水1000mL， pH值6. 2 6. 4 ;所述的MRS琼脂培养基在MRS液体培养基加入 1.8%琼脂。 —种保藏号为CGMCC No. 3164的菌株的应用，其特征在于从斜面挑取菌落接种 于装有A培养基的试管中，37t:静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml。在相同培 养基反复活化五次后；将最后活化后的菌液接种到B培养基中37t:静止培养4天，接种量 为106cfu/ml ;将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度酪胺液，高浓度 酪胺液的酪胺含量为4025. 92 ii g/ml。 在制备高高浓度酪胺液中，所述的A培养基为加入0. 1%酪氨酸的MRS液体培养
基；所述的B培养基为加入0. 005%磷酸吡哆醛、0. 1%酪氨酸的MRS液体。 本发明的优点在于由于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)xltyr001产酪胺能
力强，在培养液中，酪胺含量可达到4025. 92ii g/ml，用此方法生产酪胺将极大降低生产成
本和节约能源。
图1是粪肠球菌在普通显微镜下的照片；2/4页 图2是检测粪肠球菌酪氨酸脱羧酶基因扩增DNA片断的电泳图； 图3是生物胺标样高效液相色谱图； 图4是高效液相检测粪肠球菌培养液色谱图。 图5为高效液相色谱检测酪胺标准曲线图。
具体实施方式
实施例1 粪肠球菌(Enterococcus faecalis) xltyr001的筛选和保藏
培养基 MRS液体培养基为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖 20g，吐温80 lmL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0. 5g，硫酸锰0. 25g，蒸馏水lOOOmL， pH 值6. 2 6. 4， 115。C灭菌15min。 下层培养基为蛋白胨5g，酵母膏5g，牛肉膏5g，氯化钠2. 5g，葡萄糖0. 5g，吐 温lg，硫酸镁0. 4g，硫酸锰0. 03g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，碳酸钙0. lg，硫酸亚铁 0. 04g，维生素BA Olg，磷酸吡哆醛0. 05g，琼脂18克。酪氨酸5克，1000ml蒸馏水。pH5. 2， 115。C高压灭菌15分钟。 上层培养基为溴甲酚紫0.06g，琼脂20g，1000ml蒸馏水，pH5. 2， 121 。C灭菌 10min。 MRS固体培养基在MRS液体培养基中加入1. 8%琼脂。
分离方法 在无菌条件下取20克传统中式香肠，剪碎后置于装有180ml已灭菌生理盐水的三 角瓶中，室温下230转摇床摇10分钟，取lml接种于MRS液体培养基中，37。C培养24小时， 取lml培养液用9ml生理盐水逐级稀释到10-100cfu/ml浓度，涂布于下层培养基上，37°C 培养72小时。缓慢倾入一薄层上层培养基，10分钟内记录结果，显紫色的菌落为阳性，显黄 色为阴性，其中，阳性为产生酪胺菌株，阴性为不产胺菌株。 挑取阳性菌株，在MRS固体培养基上37C培养24h，至少纯化三次，接种于MRS液 体培养基37t:培养24小时，离心后获得菌株，加入无菌甘油，-S(TC冰箱保存。
该菌乳白色菌落，菌体卵圆形，顺链方向延长，成对或成短链，革兰氏阳性，发酵葡 萄糖产乳酸，该菌株在普通显微镜下呈椭圆形。 该菌株根据Gen bank比对结果，命名为粪肠球菌(Enterococcusf aecal i s) xltyr001，于2009年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌 种保藏号为CGMCC No. 3164，其16S rDNA的Genbank登陆号为GQ890356。
实施例2 粪肠球菌(Enterococcus faecalis) xltyr001的基因检测。 引物及引物的来源TD2 :5 '-ACATAGTCAACCATRTTGAA-3，；TD5 :5 '-CAAATGGAAGAAGAAGTAGG-3，； 检测方法 25 ii l反应体系包括GoTaq Green Master Mix 12. 5ii l，每种引物各l.Oii l，DNA模版2 ，去离子双蒸水8. 5 iU.PCR扩增程序94 °C预变性5min， 35个循环包括94 °C变性45s ， 48 °C退火45s ， 72。C延伸60s，最终72。C延伸7min，冷却至4t:。
实施例3 高浓度酪胺培养液制备方法从斜面挑取菌落接种于装有A培养基的试管中，37t: 静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml。在相同培养基反复活化五次后；将最 后活化后的菌液接种到B培养基中37t:静止培养4天，接种量为106cfU/ml ;将培养后的 菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度酪胺液，高浓度酪胺液的酪胺含量为 4023. 94ii g/ml。
培养基MRS液体培养基(同实施例1);所述的A培养基0. 1 %酪氨酸的MRS液 体培养基；所述的B培养基0. 005%磷酸吡哆醛+0. 1%酪氨酸的MRS液体培养基。
实施例4. 酪胺含量检测方法(高效液相检测)
1 、生物胺标准溶液的配制 准确称取色胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、亚精胺和精胺各50mg，用0. 4mol/L的高 氯酸(HC104)定容至50mL，制成lmg/ml储备液备用。分别取以上标准品储备液，用0. 4mo1/ L HC104配制成终浓度分别为5. 0、10、20、30、40、50ii g/ml的标准溶液，避光、4t:冰箱保存。
2、样品溶液的衍生化 取实施例3的样品lmL于5ml容量瓶中，加入200 ii L的2N NaOH使之呈碱性，然 后加入300iiL的饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，再加入2ml的丹磺酰氯(dansyl chloride) 溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为丙酮)，然后放置于4(TC水浴黑暗中反应处理40min。反应 结束后加入100 ii L的氨水中止反应，去除残留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到5mL。 衍生处理后用0. 22 ii m的有机滤膜过滤后，获得样品溶液的衍生物。
3、标准溶液标样的衍生化 分别取5. 0、10、20、30、40、50iig/ml标准溶液样品lmL于5ml容量瓶中，加入 200 ii L的2N NaOH使之呈碱性，然后加入300 y L的饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，再加入2ml 的丹磺酰氯(dansyl chloride)溶液(浓度为10mg/mL，溶剂为丙酮)，然后放置于4(TC水 浴黑暗中反应处理40min。反应结束后加入100 ii L的氨水中止反应，去除残留的丹磺酰氯 溶液。最后用乙腈定容到5mL。衍生处理后用0. 22ym的有机滤膜过滤后，获得六组样品溶 液的衍生物。
4、检测方法
方法为 Waters Alliance2695液相检领lj 系统，色 i普柱为 AgilentZ0RBAXXDB-C18 (4. 6 X 250mm2， 5 ii m)，流速为lmL min-l，紫外检测波长为254nm， 进样量20 ii L，柱温30°C ，流动相A为水，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，洗脱程序见表1 。
梯度洗脱程序
洗脱时间/min Elution time流动相A/% Mobile phase A流动相B/% Mobile phase B
0.035.065.0
5,030.070.0
20.00.0100.0
24.00.0100.0
25.035.065.0
30. 035.065.0 在图3的生物胺标样的高效液相图中1为色胺，2为苯乙胺，3为腐胺，4为尸胺， 5为组胺，6为酪胺，7为亚精胺，8为精胺。本发明的样品溶液高效液相检测结果如图4所 示。由图4可见，样品溶液中含有酪胺。 利用上述的检测方法检测，响应值为9412881. 128(参见图5)，根据标准曲线计算 得到结果为402. 592ii g/mg，但由于在检测过程中把原样稀释了 10倍，所以最终酪胺含量 为4025.92ug/mg。
权利要求
一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，其特征在于保藏号为CGMCC No.3164，菌落在MRS琼脂培养基上，37℃培养24h，在MRS液体培养基中富集，乳白色菌落，菌体卵圆形，顺链方向延长，成对或成短链，革兰氏阳性，发酵葡萄糖产乳酸，该菌株在普通显微镜下椭圆形，其16S rDNA的Genbank登陆号为GQ890356。
2. 根据权利要求l所述的一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，其特征在于所述 的MRS琼脂培养基为蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢三铵2g，葡萄糖20g，吐 温801mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0. 5g，硫酸锰0. 25g，蒸馏水1000mL，pH值6. 2 6. 4 ;所述的MRS琼脂培养基在MRS液体培养基加入1. 8%琼脂。
3. —种保藏号为CGMCC No.3164的菌株的应用，其特征在于从斜面挑取菌落接种于 装有A培养基的试管中，37t:静置培养24小时，试管中的接种量为105cfu/ml，在相同培养 基反复活化五次后，将最后活化后的菌液接种到B培养基中37t:静止培养4天，接种量为 106cfu/ml ;将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度酪胺液，高浓度酪 胺液的酪胺含量为4025. 92 ii g/ml。
4. 根据权利要求3所述的利用保藏号为CGMCC No.3164的菌株的应用，其特征在于所 述的A培养基为加入0. 1%酪氨酸的MRS液体培养基；所述的B培养基为加入0. 005% 磷酸吡哆醛和0. 1%酪氨酸的MRS液体培养基。
全文摘要
本发明涉及保藏号为CGMCC No.3164的一株粪肠球菌，菌落在MRS琼脂培养基上，37℃培养24h富集，为乳白色菌落，菌体卵圆形，顺链方向延长，成对或成短链，革兰氏阳性，发酵葡萄糖产乳酸，在普通显微镜下椭圆形。应用时，菌落接种于装有A培养基的试管中，37℃静置培养24小时，反复活化五次后，将最后活化后的菌液接种到B培养基中37℃静止培养4天，将培养后的菌液10000转离心10分钟，取上清液，获得高浓度酪胺液。其中，A培养基为0.1％酪氨酸的MRS液体培养基；B培养基为0.005％磷酸吡哆醛和0.1％酪氨酸的MRS液体培养基。
文档编号C12R1/01GK101701201SQ20091023271
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者刘登勇, 卢士玲, 周光宏, 张秋勤, 徐幸莲 申请人:南京农业大学