一种粪肠球菌间接血凝检测试剂盒及其应用
【专利摘要】本发明提供一种粪肠球菌间接血凝检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括粪肠球菌间接血凝抗原，所述粪肠球菌间接血凝抗原由粪肠球菌CCTCC M 2016027的全菌蛋白和醛化?鞣酸化绵羊红细胞组成。本发明的试剂盒操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，全程在2～3小时内完成，适合在基层推广应用，可广泛应用于粪肠球菌病流行病学的调查研究。检测结果重复性好，稳定，可靠，能够准确的检测粪肠球菌的抗体。CCTCC NO： M 201602720160108
【专利说明】
一种粪肠球菌间接血凝检测试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于用于微生物的检测试剂技术领域，具体涉及一种粪肠球菌间接血凝检 测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 奠肠球菌(jSflterococcus /aeca_/is)是革兰氏阳性，过氧化氢阴性球菌，是人和动 物肠道内主要菌群之一。自20世纪80年代以来，粪肠球菌已逐渐成为人和动物重要的条件 性致病菌，可引起菌血症、尿道感染、心内膜炎等疾病。目前，在动物疾病诊断方面，粪肠球 菌感染主要依靠实验室细菌分离、PCR分子生物学鉴定，在基层则缺乏快速有效的粪肠球菌 血清学诊断方法。血清学诊断方法的缺乏，可能使得基层对粪肠球菌感染造成误诊及漏诊， 从而对畜牧业生产造成不必要的损失。
【发明内容】
[0003] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种粪肠球菌间接血凝检测试剂 盒及其应用。
[0004] 本申请采用超声细胞破碎法提取粪肠球菌菌体抗原作为检测抗原，致敏醛化鞣酸 化的绵羊红细胞，与粪肠球菌高免兔血清，粪肠球菌阳性血清进行间接血凝实验。结果显示 该方法特异性好、灵敏度高，可为粪肠球菌病的血清学快速诊断及流行病学调查提供依据。
[0005] 本申请提供一种粪肠球菌间接血凝检测试剂盒，所述试剂盒包括粪肠球菌间接血 凝抗原，所述粪肠球菌间接血凝抗原由粪肠球菌CCTCC M 2016027的全菌蛋白和醛化-鞣酸 化绵羊红细胞组成。
[0006]作为优选，所述奠肠球菌全菌蛋白的浓度为20μg/ml-40iig/ml。
[0007]作为优选，所述粪肠球菌CCTCC M 2016027的全菌蛋白和醛化-鞣酸化绵羊红细胞 的体积比为1:1。
[0008] 作为优选，所述试剂盒还包括标准阳性血清。
[0009] 作为优选，所述试剂盒还包括标准阴性血清。
[0010] 作为优选，所述试剂盒还包括稀释液。
[0011] 作为优选，所述粪肠球菌间接血凝抗原的制备方法为： (1)粪肠球菌菌体抗原的制备 对粪肠球菌进行扩大培养，离心收获菌体后，洗涤，重悬，再于冰浴中以超声波间歇破 碎lOmin，离心取上清，得到奠肠球菌菌体抗原悬浮液； (2 )红细胞的固定和醛化-鞣酸化 将保存于Alsever's液中的公绵羊血在4°C静置3-7天后，按常规方法对绵羊红细胞进 行洗涤、戊二醛固定和鞣酸处理，所用的溶液均为pH 7.2浓度为0.15M的PBS，制备好的绵 羊红细胞用PH7.2浓度为0.15M的PBS悬浮至5%浓度，得到醛化-鞣酸化后的红细胞悬液； (3 )粪肠球菌间接血凝抗原的制备 以步骤(1)得到的粪肠球菌菌体抗原致敏步骤(2)得到的红细胞，得到粪肠球菌间接血 凝抗原，奠肠球菌间接血凝抗原的终浓度为20μg/ml-40iig/ml。
[0012] 本发明还提供上述试剂盒在检测粪肠球菌中的应用，所述应用是非疾病的诊断和 治疗目的的应用。
[0013] 作为优选，同时检测n(n<9)个待测抗原的具体方法为： (1) 在滴定板1-n列每列第1孔分别加入待检血清，第n+l、n+2、n+3分别加入同样体积的 标准阳性血清、标准阴性血清和空白对照，将l-n+2列从第1孔开始进行4倍倍比稀释至最后 一孔； (2) 每孔加入粪肠球菌间接血凝抗原； (3) 震荡滴定板，充分混匀，置37 °C恒温箱1.5-2h; (4) 根据红细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50%红细胞凝集的最大稀释倍数作 为该份血清的抗体效价。
[0014] 本发明的优越性包括以下方面:（1)本发明中抗原为粪肠球菌菌体抗原，具有很强 的特异性，能真实地检测粪肠球菌抗体；（2)用蛋白致敏醛化-鞣酸化绵羊红细胞，避免了新 鲜绵羊红细胞保存时间短、致敏效价低的缺点，易于长时间保存，血凝效价高。（3)操作简 单、方便快速，无需特殊设备和仪器，全程在2~3小时内完成，适合在基层推广应用，可广泛 应用于粪肠球菌病流行病学的调查研究。（4)结果的重复性好，稳定，可靠，能够准确的检测 粪肠球菌的抗体。（5)本发明是目前国内唯一的检测粪肠球菌抗体的诊断试剂，且价格低 廉，安全稳定，无毒性，无环境污染。
【具体实施方式】
[0015] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市 售。
[0016] 实施例1奠肠球菌间接血凝诊断试剂盒的制备 粪肠球菌间接血凝诊断试剂盒的组分如下： (1) 粪肠球菌间接血凝抗原1瓶，1 〇ml /瓶； (2) 标准阳性血清1瓶，lml/瓶； (3) 标准阴性血清1瓶，lml/瓶； (4) 稀释液2瓶，10ml/瓶。
[0017]该试剂盒的保存期为一年。
[0018] 1粪肠球菌间接血凝抗原的制备 1.1培养基配制 配制THB液体培养基2000ml:将牛肉粉4.0g，胰蛋白胨40g，葡萄糖40g，氯化钠6.0g， Na2HP〇4 5.8g，KH2P〇4 0.6g，Yeast extracts 6.0g加入去离子水，定容至2000mL，充分揽摔 溶解，用无水Na2C03调pH值至7.4。高温高压灭菌，待培养基放凉后，放入4 °C保存备用。
[0019] 1.2粪肠球菌菌体抗原制备 将奠肠球菌及3terococcus /aeca^is 10zy 101 (由本实验室分离自青海民和县羊感染 病料，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址:湖北省武汉市武昌区八一路299号 武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2016027,保藏日期为2016年1月8日。单菌落分别接种于 20ml THB液体培养基中，放置于37°C温箱中，培养10h左右后，根据麦氏比浊管估算菌液浓 度约为4-5 X 108cfu时，然后吸取该20ml的菌液接种到新的0.5LTHB液体培养基，恒温37°C 培养16h后收获菌液，8000 r/min离心30min收获菌体，沉淀物用0.15mol/L pH7.4 PBS悬 浮，如上洗涤3次后，再按菌体体积50倍量加0.15mol/L pH7.4的roS稀释至125 mL，配成浓 缩抗原。冰浴中以超声波间歇破碎lOmin，然后4000 r/min离心20min，吸取上清液，再10000 r/min离心20min，离心后的上清浓缩液为抗原贮备液，加终浓度0.1g/L的硫柳汞，-20°C保 存备用。
[0020] 1.3红细胞的固定和醛化-鞣酸化 将用等量的Alsever's液保存的公绵羊血在4°C下经3-7天稳定后，离心洗涤，以 3000rpm离心10分钟，弃上清液。沉积的红细胞用10倍体积量的pH为7.2浓度为0.15M的PBS 按上述离心条件洗涤三次，在每5毫升红细胞加入pH 7.2浓度为0.15M的PBS 95毫升，使 成体积浓度为5%红细胞悬液。将其置电磁搅拌器上搅拌，每100毫升5%红细胞悬液加入2.5% 戊二醛20毫升，加定后在室温下继续搅拌1小时，以3000rpm离心3分钟，弃上清液。再用pH 为7.2浓度为0.1511的？83，以3000印111离心3分钟的条件离心洗涤三次后，加入新配制的 2.5%縣酸100毫升，充分混合后置37°C水浴箱中10分钟，离心弃上清液，再以pH 7.2浓度 为0.15M的PBS离心洗涤三次后，再用pH为7.2浓度为0.15M的PBS配成5%醛化-鞣酸化红细 胞悬液，置4 °C下保藏备用。
[0021 ] 1.4粪肠球菌间接血凝抗原的制备（即粪肠球菌菌体抗原致敏醛化-鞣酸化绵羊 红细胞的制备） 将粪肠球菌菌体抗原稀释成200iig/ml，取1体积份粪肠球菌菌体抗原与1体积份5%醛 化-鞣酸化绵羊红细胞混合均匀(致敏浓度为l〇μg/ml)，在37°C水浴中作用30 min，其间不 断搅拌;然后用pH为7.2浓度为0.15 M的PBS以3000rpm离心洗涤红细胞三次，每次5分钟。 再用含1 %灭活健康兔血清(NRS)的浓度为0.15mo 1 /L、pH为7.2的roS洗涤三次，沉淀物用加 有0.1%(体积浓度)叠氮钠（NaN3)的2%(体积浓度)NRS配成1 %致敏红细胞悬液，作为间接 血凝诊断抗原。置4°C下保藏备用。
[0022] 2标准阳性血清的制备 弗氏不完全佐剂的配制:将羊毛脂和液体石蜡油按1:4(V/V)混合均匀，103.4kPa(121 °C)高压灭菌30min，置4 °C冰箱备用。使用时抗原与弗氏不完全佐剂等量混合、乳化。
[0023] 弗氏完全佐剂即在弗氏不完全佐剂中加入无毒、灭活的分枝杆菌（终浓度3mg/ mL)。使用时抗原与等量的弗氏完全佐剂混合、乳化。
[0024] 选用体重1.5 kg左右的健康家兔作为免疫时使用。将两种血清型粪肠球菌菌株 (lOzylOl和10zyl02菌株，由兰州兽医研究所分离保存。）分别在THB平板上复苏后连续三代 进行复壮，并均匀涂布做扩大培养，37°C恒温培养16h，接着将体积浓度10%甲醛溶液加入 培养好的菌液中，使菌液终浓度为〇. 2%，随加随摇，使其充分混合，置37 °C灭活20h，培养期 间振摇4~5次，进行灭活充分。首次免疫用上述灭活检验合格的抗原与等体积弗氏完全佐剂 混合充分乳化，于每只兔帼淋巴结处及背部皮下多点接种，接种量为lmL;隔7d后，第二次免 疫以等体积的弗氏不完全佐剂乳化抗原，接种剂量为1.5mL，多点接种于在每只兔肩部肌肉 和背部皮下；l〇d后，取制备好的含等体积不完全佐剂的抗原在每只兔背部皮下注射1.5mL， 进行第三次免疫，隔14d后采血，进行耳缘静脉采取血清。采血后，于每只兔背部皮下直接注 射新鲜培养的粪肠球菌菌液lmL，对其进行攻毒，以提高抗体效价。最后一次免疫后，14d以 后收集的血清作为兔高免血清。
[0025] 3标准阴性血清的制备 选取经血清学证实为粪肠球菌抗体阴性的健康山羊，用常规的方法采血，无菌分离血 清。
[0026] 4稀释液的制备： 称取NaCl 4.25 g、KH2P〇4 2.858 g、Na2HP〇4* 12H20 19.339 g、溶于 1000 mL去离子水 中，充分搅拌溶解，调pH为7.2-7.4，定量分装为10ml/瓶。
[0027] 5试剂盒最佳致敏浓度的确定 将菌体抗原1C备液在1.5ml Eppendorf管中用0.15mol/L pH7.2 PBS倍比稀释为1:2、 1:4、1:8、1:16、1:32、1:64共6个稀释梯度，分别与5%的醛化鞣酸化绵羊红细胞致敏，测定粪 肠球菌兔高免血清，根据效价高低和凝集图像的清晰度确定抗原的最佳致敏浓度。具体结 果参见表1。
[0028]表1抗原最适浓度的测定
将1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64按比例稀释的浓缩抗原分别致敏红细胞，与1:2， 1:22，1:23，1:24，1:25，1:2 6，1:27，1:28倍比稀释的阳性血清做间接血液凝集试验。结果 显示，用10ZY101和10ZY102，浓缩抗原小于或等于1:4稀释度致敏时，血凝价不再明显提高， 所以确定1OZY101和10ZY102浓缩抗原以1:4稀释为标准致敏浓度。用此浓度抗原制备的5% 致敏红细胞血凝效价高，经反复测定，效果稳定而且图像清晰。结果见表1。
[0029]经试验，本发明的试剂盒中奠肠球菌间接血凝抗原的最佳致敏浓度为20μg/ml-40 μg/mlo
[0030] 实施例2 应用本发明的试剂盒对待测抗原进行检测，具体方法如下： 先在96孔"V"型聚苯乙烯滴定板8行12列上每孔滴加稀释液75此;然后在1-9列每列第 1孔分别加入被检血清25此，每份被检血清用1列，第10、11列第1孔分别加入标准阳性血清、 标准阴性血清各25此，第12列为空白对照。用排枪将1-11列第1孔充分混匀后吸取25此加入 第2孔，依次连续稀释至第8孔，混匀后从第8孔弃去25此;最后每孔滴加1%致敏红细胞悬液 (即浓度为40μg/ml的粪肠球菌间接血凝诊断抗原）25此，加样完毕将V型滴定板放在微量 震荡器上震荡l_2min，盖上玻璃板，置37°C恒温箱1.5-2h，判定结果。
[0031] 判定标准:红细胞全部凝集（ + + + + ); 75 %红细胞凝集（ + + + ); 50 %红细胞凝 集（+ + );25%红细胞凝集（ + );无凝集（一）。阳性血清对照1~8孔应呈现"十+ + +~+ +"凝集；阴性血清和空白对照应呈现"一"。在对照孔合格的前提下，观察待检血清各孔，以 呈现"++"凝集的最大稀释倍数作为该份血清的抗体效价。效价多1:8( + + )判为阳性，效 价<1:4( + + )判为阴性。效价介于两者之间判为可疑，需重新测定，仍为可疑判为阳性。
[0032] 实施例3本发明的粪肠球菌间接血凝检测试剂盒的特异性试验 用本发明的粪肠球菌间接血凝检测试剂盒，对健康兔血清、粪肠球菌阳性血清、链球菌 阳性血清、葡萄球菌阳性血清、屎肠球菌阳性血清进行检测，结果除粪肠球菌外，其余均为 阴性(参见表1 )，说明该抗原具有极高的特异性。
[0033] 表2粪肠球菌间接血凝诊断试剂特异性试验结果
实施例4本发明的粪肠球菌间接血凝检测试剂盒的重复性实验 一、批内重复性试验 3位不同的操作者，取某一批次的本发明的试剂盒同时检测5种粪肠球菌阳性、阴性血 清，观察间接血凝效价的变化情况。
[0034] 二、批间重复试验 取3份不同批次的本发明的试剂盒，同时检测5种粪肠球菌的阳性血清和阴性血清，观 察间接血凝效价的变化情况。
[0035] 三、田间样品检测 用本发明的试剂盒对甘肃，青海等地送检的120份田间血清样品进行检测，以了解该病 在我国西北地区的流行程度。
[0036]重复性实验结果 1、批内重复性试验:3位操作者共同用同一批次的本发明的试剂盒对5种粪肠球菌阳性 血清、阴性血清每隔1月检测一次，总检测3次，每次间接血凝的检测结果完全相同，批内变 异系数为:〇。
[0037] 2、批间重复性试验:应用3批本发明的试剂盒(批号201409、201410、201411)对5种 粪肠球菌阳性血清和阴性血清用IHA重复检测3次，每次结果基本相符(P>0.05)。说明本发 明的试剂盒是稳定的。
[0038] 3、田间样品的检测 血清样品共计120份，甘肃的阳性率为24.6%，青海的阳性率为42.4%，平均阳性率为 33.3%。检测结果见表3。
[0039]表3本发明的试剂盒田间样品检测结果
实施例5本发明的粪肠球菌间接血凝检测试剂盒的敏感性实验 将羊源粪肠球菌阳性血清按比例稀释后进行检测，取5份免疫羊源粪肠球菌阳性血清 用本发明的试剂盒与琼脂凝集试验进行同时检测，比较敏感性。对5头实验免疫羊和5头人 工感染羊于免疫接种或感染第〇d，7d，14d，21d，30d，45d采集的血清样品，检测其抗体的消 长变化以及抗体产生时间以确定该IHA实验诊断方法的敏感性和作为早期诊断方法的可行 性。
[0040] 将lOzylOl和10zyl02阳性血清进行按比例稀释，用该间接血凝诊断抗原检测，1: 256(1:2 8)稀释的检测结果仍为阳性。取5份免疫兔的阳性血清，按比例稀释后分别用IHA和 琼脂扩散凝集实验检测，血清的扩散凝集实验效价为1:128; IHA效价为1:256，具体结果参 见表4。
[0041] 表4敏感性试验的检测结果
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对 前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在 本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护 范围之内。
【主权项】
1. 一种粪肠球菌间接血凝检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括粪肠球菌间接血 凝抗原，所述粪肠球菌间接血凝抗原由粪肠球菌CCTCC M 2016027的全菌蛋白和醛化-鞣酸 化绵羊红细胞组成。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述粪肠球菌全菌蛋白的浓度为20yg/ ml_40iig/ml 〇3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述粪肠球菌CCTCC M 2016027的全菌 蛋白和醛化-鞣酸化绵羊红细胞的体积比为1:1。4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括标准阳性血清。5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括标准阴性血清。6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括稀释液。7. 根据权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于:所述粪肠球菌间接血凝抗原的制 备方法为： (1)粪肠球菌菌体抗原的制备 对粪肠球菌进行扩大培养，离心收获菌体后，洗涤，重悬，再于冰浴中以超声波间歇破 碎IOmin，离心取上清，得到奠肠球菌菌体抗原悬浮液； (2 )红细胞的固定和醛化-鞣酸化 将保存于Alsever's液中的公绵羊血在4°C静置3-7天后，按常规方法对绵羊红细胞进 行洗涤、戊二醛固定和鞣酸处理，所用的溶液均为pH 7.2浓度为0.15M的PBS，制备好的绵 羊红细胞用PH7.2浓度为0.15M的PBS悬浮至5%浓度，得到醛化-鞣酸化后的红细胞悬液； (3 )粪肠球菌间接血凝抗原的制备 以步骤(1)得到的粪肠球菌菌体抗原致敏步骤(2)得到的红细胞，得到粪肠球菌间接血 凝抗原，奠肠球菌间接血凝抗原的终浓度为20μg/ml-40μg/ml。8. 权利要求1-6任一所述的试剂盒在检测粪肠球菌中的应用，所述应用是非疾病的诊 断和治疗目的的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：同时检测n(n<9)个待测抗原的具体方法 为： (1) 在滴定板1-n列每列第1孔分别加入待检血清，第n+l、n+2、n+3分别加入同样体积的 标准阳性血清、标准阴性血清和空白对照，将l-n+2列从第1孔开始进行4倍倍比稀释至最后 一孔； (2) 每孔加入粪肠球菌间接血凝抗原； (3) 震荡滴定板，充分混匀，置37°C恒温箱1.5-2h; (4) 根据红细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50%红细胞凝集的最大稀释倍数作 为该份血清的抗体效价。
【文档编号】G01N33/68GK105929179SQ201610381927
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】刘永生, 李学瑞, 周建华, 马丽娜, 刘永安, 王立燕
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所