专利名称：山羊痘反向间接血凝诊断试剂及其制备方法和检测方法
技术领域：
本发明涉及反向血凝诊断试剂技术领域，特别是涉及一种山羊痘反向间接血凝诊断试剂及其制备方法和检测方法。
背景技术：
山羊痘是由山羊痘病毒属山羊痘病毒(goat poxvirus，GTPV)引起的一种呈地方流行的高度接触性传染病，一年四季均可发生，春秋常见，不分性别、年龄、品种。世界动物卫生组织(OIE)将山羊痘列为A类重大传染病，1999年中华人民共和国农业部第96号公告将山羊痘列为国家一类动物疫病。近年来，我国二十多个省市相继报导山羊痘发生流行，给我国蓬勃兴起的山羊养殖业造成了极大的经济损失，带来了严峻威胁。传统的检测山羊痘的方法可采用琼脂扩散法，但该方法的灵敏度不高、检测速度较慢。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有检测山羊痘疾病的方法的灵敏度不高、检测速度较慢的缺陷，提供一种山羊痘反向间接血凝诊断试剂及其制备方法，该试剂可敏感、 快速、准确、简便的检测山羊痘病毒抗原。为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案
本发明山羊痘反向间接血凝诊断试剂中山羊痘IgG致致敏红细胞的含量为0.8 1% (体积)，纯化山羊痘IgG含量为1. 549mg/ml。上述山羊痘反向间接血凝诊断试剂中的致敏红细胞是用纯化山羊痘IgG致敏的醛化绵羊红细胞。本发明还提供了一种制备前述山羊痘反向间接血凝诊断试剂的方法采集健康绵羊静脉血，制备成红细胞悬液，用戊二醛和鞣酸进行醛化，在醋酸盐缓冲液中用纯化山羊痘 IgG致敏，离心分离，取沉淀红细胞配制成红细胞悬液，经血凝检测合格后即得。进一步的，上述方法为采集健康绵羊静脉血，用PBS离心分离提取红细胞，再用磷酸缓冲液制备成红细胞悬液，用戊二醛醛化后重新用磷酸缓冲液配制成红细胞悬液，然后再用鞣酸醛化，离心分离得醛化红细胞，将醛化红细胞在醋酸盐缓冲液中用纯化山羊痘 IgG致敏，离心分离，取沉淀红细胞用含Na队和新生小牛血清的磷酸缓冲液洗涤，再用此缓冲液配制成红细胞悬液，经血凝检测合格后即得。最佳的，前述制备方法为采集健康绵羊静脉血，用PBS离心分离提取红细胞，再用0. 1M、pH7. 4的磷酸缓冲液制备成体积百分比为2. 5%的红细胞悬液，用戊二醛醛化后重新用0. 1M、pH7. 4的磷酸缓冲液配制成体积百分比为2. 5%的红细胞悬液，然后再用新鲜鞣酸在37°C的水浴锅中醛化1小时，用0. 1Μ、ρΗ7. 4的磷酸缓冲液的洗涤，离心分离得醛化红细胞，将醛化红细胞加入10体积倍量的0.1M、pH 3 4的醋酸盐缓冲液中，再与等体积量纯化山羊痘IgG稀释液混合，置于37°C感作池致敏，离心分离，取沉淀红细胞用含0. 1%(重量)NaN3和1% (体积)新生小牛血清的0. 1M、pH7. 4磷酸缓冲液洗涤，再用此缓冲液配制成红细胞悬液，经血凝检测合格后即得。采用前述诊断试剂检测山羊痘的方法检测时，pH值控制在7. 4 7. 8，反应温度 20 25°C，反应时间50min。与现有常用的琼脂扩散实验相比，本发明以纯化山羊痘IgG致敏醛化绵羊红细胞制备了山羊痘反向间接血凝诊断试剂，可快速、准确、简便的检测山羊痘病毒抗原，具有较好的特异性、敏感性和可重复性，可广泛应用于兽医临床上山羊痘病毒抗原的快速检测，为疾病预防、诊断和防控提供依据。
具体实施例方式山羊痘反向间接血凝诊断试剂按如下配比和方法制备 1、制备醛化红细胞
无菌采集健康绵羊静脉血，加10体积倍PBS，2000转/分离心15分钟，用PBS洗5遍， 以磷酸缓冲液(0. 1M，pH 7. 4)配成2. 5% (体积百分比)的红细胞悬液，然后将此红细胞悬液与1% (体积百分比)戊二醛水溶液以9 1的体积比混合，于室温下缓慢搅拌lh，2000转 /分离心15分钟，用磷酸缓冲液洗5遍，重新制成2. 5%的悬浮液，然后将该悬浮液与等体积量1/200000 (体积比)新鲜鞣酸溶液混合，置37°C的水浴锅中1小时后取出，用磷酸缓冲液洗涤3次，2000转/分离心15分钟得醛化沉淀红细胞。2、致敏将醛化沉淀红细胞加入10体积倍量醋酸盐缓冲液(0. 1M, pH 3 4)中， 再与等体积量纯化山羊痘IgG稀释液(1.549mg / ml)混合，置于37°C感作池，其间每隔 15min吹吸混勻1次，2000转/分离心15分钟，得沉淀致敏红细胞。3、取沉淀致敏红细胞用含0. (重量)NaN3U % (体积)新生小牛血清的磷酸缓冲液(0. ΙΜ,ρΗ 7. 4)洗涤5次，然后配成致敏红细胞浓度1% (体积)、IgG含量1. 549mg/ml 的红细胞悬液。4、按常规反向间接血凝试验方法分析检测合格后即制得反向间接血凝诊断试剂。检测时，pH值控制在7. 4 7. 8，反应温度20 25 °C，反应时间50min为最佳反应条件。
权利要求
1.一种山羊痘反向间接血凝诊断试剂，其特征在于血凝诊断试剂中山羊痘IgG致敏红细胞的含量为0. 8 1%，纯化山羊痘IgG含量为1. 549mg/mL·
2.按照权利要求1所述山羊痘反向间接血凝诊断试剂，其特征在于所述致敏红细胞是用纯化山羊痘IgG致敏的醛化绵羊红细胞。
3.按照权利要求1或2所述山羊痘反向间接血凝诊断试剂的制备方法，其特征在于 采集健康绵羊静脉血，制备成红细胞悬液，用戊二醛和鞣酸进行醛化，在醋酸盐缓冲液中用纯化山羊痘IgG致敏，离心分离，取沉淀红细胞配制成红细胞悬液，经血凝检测合格后即得。
4.按照权利要求3所述山羊痘反向间接血凝诊断试剂的制备方法，其特征在于采集健康绵羊静脉血，用PBS离心分离提取红细胞，再用磷酸缓冲液制备成红细胞悬液，用戊二醛醛化后重新用磷酸缓冲液配制成红细胞悬液，然后再用鞣酸醛化，离心分离得醛化红细胞，将醛化红细胞在醋酸盐缓冲液中用纯化山羊痘IgG致敏，离心分离，取沉淀红细胞用含 NaN3和新生小牛血清的磷酸缓冲液洗涤，再用此缓冲液配制成红细胞悬液，经血凝检测合格后即得。
5.按照权利要求4所述山羊痘反向间接血凝诊断试剂的制备方法，其特征在于采集健康绵羊静脉血，用PBS离心分离提取红细胞，再用0. 1M、pH7. 4的磷酸缓冲液制备成体积百分比为2. 5%的红细胞悬液，用戊二醛醛化后重新用0. 1M、pH7. 4的磷酸缓冲液配制成体积百分比为2. 5%的红细胞悬液，然后再用新鲜鞣酸在37°C的水浴锅中醛化1小时，用 0. 1M、pH7. 4的磷酸缓冲液的洗涤，离心分离得醛化红细胞，将醛化红细胞加入10体积倍量的0. 1M、pH 3 4的醋酸盐缓冲液中，再与等体积量纯化山羊痘IgG稀释液混合，置于 37°C感作池致敏，离心分离，取沉淀红细胞用含0. 1% (重量州3队和1% (体积)新生小牛血清的0. 1M、pH7. 4磷酸缓冲液洗涤，再用此缓冲液配制成红细胞悬液，经血凝检测合格后即得。
6.权利要求1至5任一所述诊断试剂检测山羊痘的方法，其特征在于检测时，pH值控制在7. 4 7. 8，反应温度20 25°C，反应时间50min。
全文摘要
本发明公开了一种山羊痘反向间接血凝诊断试剂及其制备方法，该血凝试剂中致敏红细胞的含量为0.8～1.0%，纯化山羊痘IgG含量为1.549mg/ml，与现有常用的琼脂扩散实验相比，本发明以纯化山羊痘IgG致敏醛化绵羊红细胞制备了山羊痘反向间接血凝诊断试剂，可快速、准确、简便的检测山羊痘病毒抗原，具有较好的特异性、敏感性和可重复性，可广泛应用于兽医临床上山羊痘病毒抗原的快速检测，为疾病预防、诊断和防控提供依据。
文档编号G01N33/531GK102253197SQ20111016698
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月21日 优先权日2011年6月21日
发明者刘忠伟, 周碧君, 岳筠, 嵇辛勤, 文明, 汪德生, 王开功, 程振涛 申请人:贵州大学