专利名称：一种羊痘病毒检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种羊痘病毒检测试剂盒及其检测方 法。
背景技术：
羊痘(capripox)，包括绵羊痘(she印pox)和山羊痘(goatpox)，是绵羊和山羊 的一种高度接触性传染病。其病原为绵羊痘病毒(She印pox virus, SPV)和山羊痘病毒 (Goatpoxvirus，GPV)，均属于痘病毒科山羊痘病毒属(Capripoxvirus，CPV)，为有囊膜的双 股DNA病毒，基因组大小约为149kb。主要表现为发热、无毛或少毛部位皮肤黏膜发生丘疹 和疱疹，有较高的死亡率。羊痘在非洲中北部、亚洲中部和西南部以及印度大部分地区呈地 方性流行，对养羊业造成严重的危害和巨大经济损失。因而，被世界动物卫生组织(OIE)列 为A类传染病，在我国也被列为一类传染病。目前，我国用于羊痘的实验室诊断手段比较落 后，尤其是缺乏快速、简便的诊断方法。我国对该病的诊断主要依据临床症状进行判断。国 外已有很多利用PCR方法从活体组织、组织培养物中检测羊痘病毒的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，是提供一种羊痘病毒检测引物对。本发明还要解决的技术问题，是提供上述羊痘病毒检测试剂盒，以快速、准确的检 测出羊痘病毒，及时隔离受病羊，避免传染。本发明还要解决的技术问题，是提供利用上述羊痘病毒检测试剂盒的进行羊痘病 毒检测的方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种用于检测羊痘病毒的引物对，如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸 序列。一种羊痘病毒检测试剂盒，它包含上述的引物对。一种羊痘病毒检测试剂盒，包括(1)羊痘病毒阳性对照和阴性对照各600 μ L ；(2)羊痘病毒特异性引物对上游引物Pl 如SEQ ID NO 1所示；下游引物Ρ2 如SEQ ID NO 2所示；(3) DNA提取试剂采用Geneaid公司生产的病毒核酸提取试剂盒(Viral NucleicAcid Extraction Kit II)；(4)PCR 反应试剂由引物 Pl 15 μ L(IOmM)，弓丨物 P2 15 μ L(IOmM), 2XPCR MasterMix 200 μ L 禾口 ddH20 (超纯水)100 μ L 组成；(5)电泳检测试剂由50 X TAE电泳缓冲液20mL, GoldView 100 μ L组成。采用上述的试剂盒的检测方法，包括如下步骤
(1) DNA的提取采用Geneaid公司生产的的病毒核酸提取试剂盒(Viral NucleicAcid Extraction Kit II)，根据说明书提取病毒的 DNA ；(2) PCR 扩增25 μ L 体系2 X PCR Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上游引物 Pl 1 μ L ；下 游引物Ρ2 IyL禾口模板2yL ；PCR 反应条件94°C 3min;然后 94°C 30s，57°C 45s, 72°C lmin，30 个循环；最后 72°C延伸 IOmin ；4°C保存；(3)琼脂糖凝胶电泳将0.4g琼脂糖和20mL 50XTAE置于锥形瓶中，完全溶解后加入核酸染料 GoldVieW6. 0 μ L，并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后将PCR扩增产物取8 μ L点于已凝固 的琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于TAE中电泳Ih ；(4)判断结果如果扩增出一条445bp特异性片段，则表明待检组织羊痘病毒阳性；如果没有扩增出片段，则表明待检组织羊痘病毒阴性。有益效果由于本发明采用的引物来自羊痘病毒不同基因中高度保守的区域，采 用该引物对能准确、快速、方便的判别病料中是否含有羊痘病毒，灵敏度达0. 5pg;本研究 针对羊痘病毒不同基因中高度保守的区域设计引物，建立一种PCR检测羊痘病毒的方法。 通过实验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测羊痘的方法，填 补了国内空白。
图1为PCR检测电泳图。其中，1为标准分子量DL_5000，2 9为羊痘病毒的PCR
扩增产物。图2为PCR方法敏感性试验。其中，1 7为所用摸板的量分别为500ng，50ng, 5ng, 500pg, 50pg, 5pg, 0. 5pg, 8 为标准分子量 DL-5000。图3为PCR方法检测羊痘病毒的特异性鉴定。其中，1为羊口疮疫苗，2为口蹄疫 疫苗，3为水疱性口炎疫苗，4为羊痘病毒，5为标准分子量DL-5000。图4为试剂盒保存不同时间后PCR扩增结果。其中，1为标准分子量DL_5000，2为 保存一个月，3为保存三个月，4为保存六个月，5为保存九个月，6为保存十二个月。图5为试剂盒冻融不同次数后PCR扩增结果。其中，1为冻融1次，2为冻融3次， 3为冻融6次，4为冻融10次，5为冻融20次，6为冻融30次，7为标准分子量DL-5000。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 试剂盒的制备。1、羊痘病料的获取。临床病料于2009年8月采自江苏省镇江市发病羊的痂皮共21份，取0. 5 2. Og 痂皮于无菌研钵，加生理盐水研磨，转入1. 5mL的EP管，反复冻溶2 3次后IOOOOrmp离心5min，取上清于-20°C保存。2、引物的设计。根据GenBank中CaPV的全基因序列，使用引物设计软件Primer5. 0设计一对检测 引物。CaPV引物如下上游引物Pl (CaPVS) 5' -ACCTAATGGTGCTGTAACTATAAACGG-3‘；下游引物P2 (CaPVA) 5' -TGCCGTCAATGAAGAATGGTTAACTT-3‘。预期扩增片段大小为445bp。3、试剂盒中其他成分的制造。3. 1 DNA提取试剂购自Geneaid公司生产的的病毒核酸提取试剂盒(Viral Nucleic AcidExtraction Kit II)。3.2超纯水(ddH20)的制备。购自Takara 公司，ImL/ 管。3.3 2 X PCP master Mix 的制备。购自南京博尔迪生物科技有限公司，ImL/管。3. 4 50XTAE电泳缓冲液的制备。0. 5mol/L乙铵四乙酸二钠((EDTA)溶液(ρΗ8· 0)配制EDTA18. 61g灭菌双蒸水80mL氢氧化钠调pH至8. 0灭菌双蒸水加至100mL。50 X TAE电泳缓冲液配制三羟甲基氨基甲烷(Tris)242g冰乙酸57. ImL0. 5mol/L EDTA 溶液(ρΗ8· 0) IOOmL灭菌双蒸水加至1000mL。使用时灭菌双蒸水稀释50倍。3. 5 Glodview核酸染料的制备。购自上海赛百盛基因技术有限公司，ImL/管。3.6上样缓冲液的制备。购自南京博尔迪生物科技有限公司，ImL/管。3.7引物的制备。引物由上海英俊合成，20D/管。实施例2 检测方法。主要仪器如下PCR 扩增仪(Mastercycler、Eppendorf)冷冻离心机(2-16P，Sigma)紫外凝胶成像仪(BioSpectrumImaging Systems, UVP)
电泳槽(JY-SP-C，北京君一)具体方法如下
UDNA的提取采用Geneaid公司生产的的病毒核酸提取试剂盒(Viral Nucleic AcidExtraction Kit II)，根据说明书提取病毒的DNA，具体为(Ia)取200uL样品到1. 5mL的EP管，如果样品不足200uL,可加PBS Buffer至 200uLo(lb)加入400uL的VB Lysis Buffer到样品中，旋涡混旋，室温放置lOmin。(Ic)加入400uL的AD Buffer到样品中，旋涡混旋。(Id)将VB Column安置于2mL的Collection Tube上。将步骤(Ic)得到的上清 液转移600uL至VB Column中，13000rmp离心lmin，弃滤液。(Ie)将操作Id剩下的上清夜转移至VB Column中，13000rmp离心lmin，弃滤液。(If)加入 400uL 的 Wl Buffer 到 VB Column 中，13000rmp 离心 30s,弃滤液。(Ig)加入 600uL 的 Wash Buffer 到 VB Column 中，13000rmp 离心 30s,弃滤液，再 以 13000rmp 离心 3min。(Ih)将干燥的VB Column安置于新的1. 5mL的EP管，在中央处加50uL的无RNA 酶水，室温放置3min。13000rmp离心lmin洗脱DNA，收集滤液，-20°C保存备用。2、PCR 扩增25 μ L 体系2 X PCR Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上游引物 Pl 1 μ L ；下 游引物Ρ2 IyL禾口模板2yL ；PCR 反应条件94°C 3min ；然后 94°C 30s，57°C 45s, 72°C lmin，30 个循环；最后 72°C 延伸 10min，4°C 保存。3、琼脂糖凝胶电泳准确称取0. 4g琼脂糖，加入20mL TAE置锥形瓶于微波炉中完全溶解后加入核酸 染料GoldView 6. 0μ L并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后将PCR扩增产物取8μ L点于已 凝固的琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于TAE中电泳lh。4、判断结果紫外灯下观察结果。如果扩增出一条445bp特异性片段，则表明待检组织羊痘病 毒阳性；如果没有扩增出片段，则表明待检组织羊痘病毒阴性，结果见图1。实施例3 敏感性试验。以羊痘病料提取的DNA为模板，从50ngDNA开始按10倍递增稀释，用羊痘PCR反 应程序进行扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果表明PCR方法可检测出0. 5pg的模 板DNA，具有较高的敏感性，结果如图2所示。实施例4:特异性试验。用相同的方法提取羊口疮疫苗，口蹄疫疫苗，水疱性口炎疫苗，羊痘病料的DNA，并 以此为摸板，用设计的引物进行PCR扩增，的琼脂糖进行凝胶电泳，只有羊痘病毒扩增 出一条445bp的片段，将羊痘病毒的PCR产物进行基因测序，与Genbank中已发表的序列进 行比较，结果与已发表的羊痘基因序列达98%的同源性，这表明所扩增的片段为羊痘病毒， 而羊口疮疫苗，口蹄疫疫苗，水疱性口炎疫苗都未扩增出条带来，这表明该方法所扩增的片 段为羊痘病毒的特异性片段，结果如图3所示。实施例5 稳定性试验。将试剂保存于_20°C，经过一年的保存和反复冻融后，对羊痘病毒的模板重新进行检测，见图4和图5，结果表明，该试剂盒的稳定性较好，可以长期保存。
权利要求
一种用于检测羊痘病毒的引物对，其特征在于如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
2.一种羊痘病毒检测试剂盒，其特征在于它包含权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的羊痘病毒检测试剂盒，其特征在于包括(1)羊痘病毒阳性对照和阴性对照各600μ L ；(2)羊痘病毒特异性引物对上游引物Pl 如SEQ ID NO 1所示；下游引物Ρ2 如SEQ ID NO 2所示；(3)DNA提取试剂采用Geneaid公司生产的病毒核酸提取试剂盒；(4)PCR反应试剂由引物 Pl 15 μ L, Ρ2 15 μ L，2XPCR Master Mix 200 μ L 禾口 ddH20 100 μ L 组成；(5)电泳检测试剂由50X TAE电泳缓冲液20mL, GoldView 100 μ L组成。
4.采用权利要求2所述的试剂盒的检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)DNA的提取采用Geneaid公司生产的的病毒核酸提取试剂盒，根据说明书提取病 毒的DNA ；(2)PCR 扩增 μ L 体系2 X PCR Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上游引物 Pl IyL;下游弓 | 物P2 1口1^禾口模板2口1^;PCR 反应条件94°C 3min;然后 94°C 30s, 57°C 45s, 72°C lmin，30 个循环；最后 72°C 延伸IOmin ；4°C保存；(3)琼脂糖凝胶电泳将0. 4g琼脂糖和20mL 50XTAE置于锥形瓶中，完全溶解后加入核酸染料 GoldVieW6. 0 μ L，并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后将PCR扩增产物取8 μ L点于已凝固 的琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于TAE中电泳Ih ；(4)判断结果如果扩增出一条445bp特异性片段，则表明待检组织羊痘病毒阳性；如果没有扩增出片段，则表明待检组织羊痘病毒阴性。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测羊痘病毒的引物对，如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序。本发明还公开了包含上述引物对的检测试剂盒及利用该试剂盒检测羊痘病毒的方法。由于本发明采用的引物来自羊痘病毒不同基因中高度保守的区域，采用该引物对能准确、快速、方便的判别病料中是否含有羊痘病毒，灵敏度达0.5pg；本研究针对羊痘病毒不同基因中高度保守的区域设计引物，建立一种PCR检测羊痘病毒的方法。通过实验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测羊痘的方法，填补了国内空白。
文档编号C12N15/11GK101948930SQ20101012468
公开日2011年1月19日 申请日期2010年3月16日 优先权日2010年3月16日
发明者张志成, 戴薇, 戴鼎震, 方光远, 陆静静, 陈丽华, 陈琼, 陈钟鸣 申请人:金陵科技学院