水产品常见病毒检测试剂盒的制作方法
【专利说明】
所属技术领域
[0001]本发明涉及水产品检测用品领域，具体为水产品常见病毒检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]水产品是营养丰富的食品，尤其是鱼类的蛋白质高、脂肪低、胆固醇少，为人们所喜食。然而，近年来，各类病毒严重威胁着水产品的健康可持续发展，水产品质量也因此受到严重影响。更为重要的是，部分水产品病毒，如甲肝病毒、诺瓦克病毒及类诺瓦克病毒会引起水产品相关疾病。水产品质量安全问题不仅关系到水产业的健康发展，也与人民群众健康息息相关，加强水产品质量安全管理体系研究具有重大而深远的意义。
[0003]核酸检测技术作为分子生物学检测技术的核心，在水产品病毒检测中发挥着巨大作用。目前市面上水产品病毒核酸检测方法主要为常规定性聚合酶链式反应(PCR)，实时荧光PCR及基因芯片技术等。常规定性PCR操作简单，但过程繁琐，需通过琼脂糖凝胶电泳检测结果，检测灵敏度低，且检测过程中使用高致癌染料，对环境及人体危害非常大。实时荧光PCR检测灵敏度高，但其设备昂贵、对操作人员专业素质、引物及模板质量要求高，且不同品牌间产品重复性及重现性不佳。使用常规定性PCR及实时荧光PCR法每次只能筛检一种病毒指标，无法满足同时针对水产品中多种病毒进行筛检的需求。而基因芯片法利用核酸杂交原理，将待测病毒特异性探针固定于固相/液相芯片上，可同时检测多种病毒指标，但其配套设备昂贵，通常用于科研工作中。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了克服现有水产品病毒检测技术费时费力成本高的缺陷，提供一种操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉的水产品常见病毒检测试剂盒。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
本发明的水产品常见病毒检测试剂盒，主要由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为7重聚合酶链式反应(PCR)引物组合，各对引物的碱基序列5’ -3’如下:
外参基因:正向引物:GATTTGGACCTGCGAGC 反向引物:GGTTGGCCAGGCGCGAAG ;
甲肝病毒:正向引物:ACAACTGTAAATGGAACCCC 反向引物:AGCAACATGGATGCCCAA ;
星状病毒:正向引物:GAATTTCCTCTCCGCCTGAC 反向引物:CGGTTGTTCTCATCAGAGTCC ;
诺瓦克病毒:正向引物:ACCTAACCACCAGAACCCCTT 反向引物:CTCAGCATCCATTGTTCCAAAGCG ;
轮状病毒:正向引物:CTTTTCCATCCGAAATTAACAC 反向引物:AATATAAGGCAACCACGGTA ; 脊灰病毒:正向引物:AGGAGAAAATTATCCCACAAGC 反向引物:AAACATACTGGTTCAATACGGTG ;
柯萨奇病毒:正向引物:AAAACGTGGCAGCTAATGGA 反向引物:GCCACTCACCATAAGCAACA ;
其中，反向引物的5’端接上Tag序列，该Tag序列为 5’ -AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTATGGCT-3’ ；
引物组合中还含有一条5’端带生物素标志(b1tin)的Tag引物，其碱基顺序如下所示:
Tag 引物:b1tin-5，-AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTATGGCT-3，；
膜芯片为顺序固定在支持膜表面的7组探针序列、1组阳性对照(Positive)探针序列和1组阴性对照(Negative)探针序列，7组探针序列、阳性对照探针序列和阴性对照探针序列的碱基序列5’ -3’如下:
外参基因探针:CTGACCTGAAGGCTCT ；
甲肝病毒探针:TCCAGGAAGACCTTCGCCTT ;
星状病毒探针:CTGTCCGCTTCATCGTCTTCGT ；
诺瓦克病毒探针:CCCAACTAATGGCCCTGCTCGGT ；
轮状病毒探针:CAAATTTACTTCCACCGTACACA ；
脊灰病毒探针:TTCCTGACTAGGGCATGATTGGT ；
柯萨奇病毒探针:ACGGTCACTGTAACCACATGCTTC ；
Positive 探针:GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGA GAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG ；
Negative 探针:GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCC ATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC。
[0006]上述方案中，所述试剂盒主要由引物组合、膜芯片和辅料组成，辅料为dNTPs、EX-Taq聚合酶(Polymerase)及5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，该单链的碱基序列为:
b1tin-5’-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。
[0007]上述方案中，所述试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为10XPCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺(TMB)显色液。
[0008]上述方案中，所述预杂交液为5XSSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠(SDS)和lOXDenhardt’ s液，其中，SSC为0.75M氯化钠和0.075M柠檬酸钠，Denhardt’ s液为1% Ficoll聚鹿糖，1%聚乙稀P比略烧酮(polyvinylpyrrolidone)，1%牛血清白蛋白(BSA)；杂交液为5XSSC，0.1%重量百分比SDS，5XDenhardt’ s，50%重量百分比去离子甲酰胺和100ug/ml酵母tRNA ;洗液分别为洗液1、洗液2、洗液3和洗液4，其中，洗液1:2XSSC和0.1%重量百分比SDS，洗液2:0.5XSSC和0.1%重量百分比SDS，洗液3:100 mM (毫摩尔/ 升)Tris-HCl，pH7.5，150 mM 他(:1，洗液4:100 mM Tris_HCl，pH9.5，100 mM NaCl 和 100mM MgCl2;封闭液为3%重量百分比牛血清白蛋白(BSA)，100 mM Tris-HCl，ρΗ7.5，150 mMNaCl ;四甲基联苯胺显色液由四甲基联苯胺显色液A液和四甲基联苯胺显色液B液使用前等量混合配成，其中，四甲基联苯胺显色液A液:pH5.4的200mM柠檬酸钠和0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液:3%重量百分比的H202用800体积的双蒸水稀释液。
[0009]上述方案中，所述支持膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜或其他有三维孔径结构的支持物。
[0010]本发明采用多重PCR扩增的方法扩增目标序列。多重PCR扩增技术原理是将多对引物放到同一个反应管中进行PCR扩增，达到同时扩增2种或两种以上目标DNA序列的目的。本发明采用了 7重PCR扩增体系扩增目标序列，包括6种常见、常检的水产品病毒检测指标:甲肝病毒、星状病毒、诺瓦克病毒、轮状病毒、脊灰病毒、柯萨奇病毒和外参基因。
[0011]本发明采用单引物扩增获得大量单链DNA技术用以提高检测灵敏度。单引物扩增技术原理是在PCR扩增过程中采用的反向引物的5’端接上Tag序列，同时引入一条5’端带生物素标志(b1tin)的Tag引物(二者TAG序列相同)，使得PCR扩增后产生大量的单链DNA，该单链DNA可以有效的和固定在支持膜上的探针杂交，从而提高检测灵敏度。
[0012]本发明在多重PCR扩增同时进行单引物扩增获得大量单链DNA，采用的技术方案是在多重PCR反向引物的5’端添加Tag序列，同时在PCR反应体系中引入5’端带生物素标志的Tag引物，带生物素标志的Tag弓丨物的碱基序列与多重PCR反向引物的Tag序列的碱基序列相同，带生物素标志的Tag引物Tm值(解链温度)比多重PCR正向引物Tm值高10~15°C，带生物素标志的Tag引物和反向引物上的Tag接头的互补序列配对后，通过调节退火温度进行单引物扩增制备出单链DNA。在整个PCR扩增过程中，首先采用低退火温度(55~60°C )进行多重PCR反应，其扩增产物主要是双链DNA，之后提高退火温度(65~68°C )，使正向引物不能结合到模板上，只有Tag引物可以结合到模板上并延伸扩增，从而产生大量5’端带生物素标志的单链DNA，该单链DNA用于接下来的膜芯片杂交检测。
[0013]本发明采用基于反向斑点杂交的可视化膜芯片技术进行水产品中常见病毒的分子杂交检测，其工作原理是首先将针对各个病毒特异性序列的单链探针按顺序排列固定于支持膜表面的特定区域，再将待测的多重PCR产物与其杂交，这样PCR产物中的病毒特异性序列单链DNA就会和支持膜上的探针杂交，经洗涤去除未结合的DNA样品，由于待测PCR产物的DNA上带有生物素标志，结合了待测DNA的探针点就偶联上了生物素标志物，再经过相应的显色反应就能读取对应的杂交信号，这样一张膜芯片上就可以同时检测多个水产品病毒检测指标。本发明的检测探针顺序排列于支持膜表面的特殊区域，形成低密度探针阵列。膜芯片同待测样本杂交后经底物显色可形成肉眼可视化的检测结果。
[0014]本发明的有益效果是:
1)操作简单，经过一次样本前处理，单管PCR扩增，单芯片杂交就可以同步筛检水产品样本中多种病毒指标，具有平行分析和多重判断的特点；
2)检验对象完备，包含了当前市面上常见、常检的的水产品病毒指标，并且可以很方