一种人源诺如病毒的检测试剂盒及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种人源诺如病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒至少包括如下试剂：用于检测GI组人源诺如病毒的第一引物对和第一引物对配套TaqMan探针、用于检测GII组人源诺如病毒的第二引物对和第二引物对配套TaqMan探针、一步反转录聚合酶链式反应试剂。本发明还提供了该检测试剂盒的应用。本发明所提供的检测试剂盒特异性好，灵敏度高，使用简便，能高效检测人源诺如病毒。
【专利说明】
一种人源诺如病毒的检测试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于病毒特异性受体捕获的高效定量 检测人源诺如病毒的原位捕获检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 诺如病毒(noroviruses，NoVs)又称诺瓦克病毒(Norwalk Virus)、类诺瓦克病毒 (Norwalk-like Virus)或小圆状病毒（Small Round Structured Virus，SRSV)，隶属于嵌 杯科诺如病毒属成员，为单链RNA病毒。1972年Kapikian等利用免疫电镜的方法在1968年美 国俄亥俄州Norwalk镇暴发的急性冬季呕吐症样品中首次发现了该病毒，并将其命名为 Norwalk virus。此后陆续出现关于该病毒暴发的报道，导致该病毒命名混乱。2002年，国际 病毒分类委员会(the International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)将其归 为嵌杯状病毒科，并正式更名为诺如病毒。
[0003] 根据病毒主要结构蛋白核酸序列的不同，NoVs被分为7个组(GI-GVII)，其中GI、 GII和GIV组NoVs可以感染人类，被称为人源诺如病毒(human noroviruses，HuNoVs)。流行 病学数据表明：HuN〇Vs(GI和GII组为主)是造成急性非细菌性胃肠炎的最主要元凶，具有发 病率高、感染剂量低、对外界抵抗力强等特点。美国疾控中心对该国的疫情监测结果表明， 2009-2010年间共暴发1527件食源性疾病事件，其中790例疫情的病原体是HuNoVs，占总暴 发事件的42 %。2012年底，陆续在英国、荷兰、日本等国暴发了不同等级的HuNoVs流行事件。 HuNoVs呈现出全世界范围频发且各地发病率出现逐年增高的趋势，与人们对其认识的深 入、检测方法日益发展完善、灵敏度显著提高有关。
[0004] 目前，HuNoVs的检测方法建立在病毒粒子外形、特异性核酸区段和主要抗原决定 簇的基础上，主要有电镜法、免疫学方法和分子检测方法等。中国专利CN201510487540.1、 CN201510179138.7、CN201310553678.8、CN201310271924.0 等都是用于 NoVs 的分子检测。但 是，这些发明专利和目前常用的HuNoVs检测方法的缺陷主要在于：1)均需要通过专门抽提 RNA的步骤获得病毒核酸，费时费力;2)无法区别扩增模板RNA来源于感染性的NoVs粒子，还 是样品中游离的病毒RNA;3)环境和食品样本中通常含有一些PCR抑制剂，容易造成假阳性 结果。因此，研发一种灵敏度高，准确率高，操作简单，耗时短，且高通量HuNoVs的检测试剂 盒具有良好的应用价值。
【发明内容】
[0005] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种新的人源诺如病毒的检测试剂 盒，本所提供的检测试剂盒特异性好，灵敏度高，使用简便，能高效检测人源诺如病毒。
[0006] 为解决上述问题，本发明采取的技术方案是:一种人源诺如病毒的检测试剂盒，所 述检测试剂盒至少包括如下试剂:用于检测GI组人源诺如病毒的第一引物对和第一引物对 配套TaqMan探针、用于检测GII组人源诺如病毒的第二引物对和第二引物对配套TaqMan探 针、一步反转录聚合酶链式反应试剂；
[0007] 其中，第一引物对的引物一的序列如SEQ ID NO: 1所示，第一引物对的引物二的序 列如SEQ ID N0:2所示；第一引物对配套TaqMan探针的探针三的序列如SEQ ID N0:3所示， 第一引物对配套TaqMan探针的探针四的序列如SEQ ID NO:4所示;第二引物对的引物五的 序列如SEQ ID N0:5所示，第二引物对的引物六的序列如SEQ ID N0:6所示；第二引物对配 套TaqMan探针的探针七的序列如SEQ ID N0:7所示。
[0008] 优选地，所述TaqMan探针的5 '端标记有荧光报告基团FAM，3 '端标记有荧光淬灭基 团擺RA〇
[0009] 优选地，所述检测试剂盒还包括III型猪肠胃粘膜提取物和牛血清蛋白/脱脂奶 粉。
[0010] 优选地，所述III型猪肠胃粘膜提取物中含有人源诺如病毒的特异性受体。
[0011] 优选地，所述检测试剂盒还包括酶标条、酶标框、聚烯烃膜、吸水滤纸、磷酸盐缓冲 液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液和DEPC水/ddH 20。
[0012] 本发明还提供了本发明所提供的的检测试剂盒的应用，所述应用包括如下步骤：
[0013] 1)将III型猪肠胃粘膜提取物包被到酶标板上；
[0014] 2)封闭酶标板，防止酶标板非特异性吸附病毒粒子；
[0015] 3)将待测样品加入到酶标板；
[0016] 4)高温裂解释放RNA;
[0017] 5)加入第一引物对、第一引物对配套TaqMan探针、第二引物对、第二引物对配套 TaqMan探针以及一步反转录聚合酶链式反应试剂进行反应；
[0018] 6)进行 RT-qPCR 检测。
[0019] 优选地，检测GI组人源诺如病毒和GII组人源诺如病毒的清洗酶标板和稀释病毒 的缓冲液分别为pH=3.0和pH=7.0。
[0020] 优选地，高温裂解释放RNA的温度为95°C。
[0021] 优选地，RT-qPCR检测的反应条件为:第一阶段42°C反转录lOmin，第二阶段95°C预 变性30s;第三阶段95°C变性15s，53°C退火15s，60°C延伸30s，扩增45个循环;4°C保温;并在 第二阶段进行FAM焚光彳目号米集。
[0022]本发明根据病毒的序列保守区域RNA依赖的RNA聚合酶区，使用Primer5.0软件设 计了特异性引物，通过使用原位捕获反转录实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)的方 法，对人源诺如病毒的感染进行辅助诊断，以及该病毒的流行病学研究。
[0023]本发明的要点在于:人源诺如病毒特异性受体附着于酶标板上，样品中病毒可与 其受体特异性结合;在洗涤酶标板的过程中可以清除杂质，保留与特异性受体结合的病毒 粒子，对检测目标物进行第一步的筛选;95°C释放病毒核酸;所设计引物和TaqMan探针具有 高度特异性，对检测目标物进行再次确认。此发明免去了纯化病毒RNA的繁杂步骤，不仅大 大降低了试剂成本和人工成本，而且也提高了检测的灵敏度和特异性，操作简便。
[0024]本发明的有益效果为：1)检测方法操作简便，且可规模化程序性操作;2)检测方法 灵敏度高、特异性强;3)检测结果可靠、直观;4)检测成本低。
[0025]以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以 充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【附图说明】
[0026]图1为本发明实施例2中pH值对检测GI组和GII组病毒的影响；
[0027]图2为本发明实施例3中与传统RT-qPCR方法进行检测限的比较(GI组）；
[0028]图3为本发明实施例3中与传统RT-qPCR方法进行检测限的比较(GII组）；
[0029] 图4为本发明实施例4中检测GI组病毒人工污染的河水的扩增曲线；
[0030] 图5为本发明实施例4中检测GII组病毒人工污染的河水的扩增曲线；
[0031] 图6为本发明实施例5中检测疾病预防控制中心临床样本的扩增曲线；
[0032] 图7为本发明实施例6中检测人工污染牡蛎组织的扩增曲线；
[0033] 图8为本发明实施例7中检测检测市售牡蛎组织的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0034] 本发明实施例中所用试剂均可通过市售获得，所用人源诺如病毒临床样本来自北 京疾病预防控制中心（Center for Disease Control and Prevention,CDC)和湖州疾病预 防控制中心。
[0035] 实施例1引物和TaqMan探针
[0036] 获取本发明中引物和TaqMan探针的方法:使用Mega 5.0软件对在GenBank中现有 人源诺如病毒的基因序列进行序列的生物信息学分析，通过同源性比较，获取保守区域;应 用ABI 引物合成软件（Primer Express version 2.0，Applied Biosystems)设计了扩增保 守区基因片段的引物及TaqMan探针;所设计的引物和探针均具有互补于人源诺如病毒特异 性基因片段的序列，应用从351/?1'；[11161-131^\31'(111^。://?^.11(313；[.111111.11；[11.80￥/131^\31')对所 设计合成的引物及TaqMan探针进行特异性及可用性检测，确保与其它病原体的核酸序列没 有同源性;PGM中含有人源诺如病毒的受体，在孵育过程中病毒与其受体特异性结合，并对 结合物进行洗涤，提高检测结果的可靠性和准确度。
[0037]实施例2检测试剂盒及检测方法
[0038]检测试剂盒的试剂包括:酶标条、酶标框、MicroAmp聚烯烃膜、吸水滤纸、III型猪 肠胃粘膜提取物（porcine gastric mucin,PGM)、牛血清蛋白（bovine serum albumin, BSA)、第一引物对、第一引物对配套TaqMan探针、第二引物对、第二引物对配套TaqMan探针、 一步反转录聚合酶链式反应（RT-qPCR)酶、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline， PBS)、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液和DEPC水。
[0039]其中，第一引物对的引物一的序列如SEQ ID NO: 1所示，第一引物对的引物二的序 列如SEQ ID N0:2所示；第一引物对配套TaqMan探针的探针三的序列如SEQ ID N0:3所示， 第一引物对配套TaqMan探针的探针四的序列如SEQ ID NO:4所示;第二引物对的引物五的 序列如SEQ ID N0:5所示，第二引物对的引物六的序列如SEQ ID N0:6所示；第二引物对配 套TaqMan探针的探针七的序列如SEQ ID N0: 7所示。TaqMan探针的5'端标记有荧光报告基 团FAM，3'端标记有荧光淬灭基团TAMRA。引物一、引物二、TaqMan探针三、TaqMan探针四、弓丨 物五、引物六、TaqMan探针七的浓度都为10 .ΟμΜ。III型猪肠胃粘膜提取物中含有人源诺如 病毒的特异性受体(如血清组织抗原，Histo-blood group antigens)。
[0040] 利用以上引物TaqMan探针可检测两组流行基因型(GI组和GII组)人源诺如病毒毒 株，第一引物对和第一引物对配套TaqMan探针检测GI组人源诺如病毒，第二引物对和第二 引物对配套TaqMan探针检测GII组人源诺如病毒。
[0041 ]使用该检测试剂盒的检测方法具体包括如下步骤：
[0042] 1)PGM包被到酶标板上
[0043] 用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液稀释PGM，至终浓度为1. Omg/mL，以100.0yL-200.0μ L/孔将稀释后的PGM添加到酶标孔内；4°C孵育过夜。
[0044] 2)封闭酶标板
[0045]以roS溶解BSA，至终浓度为1.0% (w/v)。取出包被过夜的酶标板，PBS洗涤3次，以 120.0yL-230.0μ!7孔将终浓度1.0 %的BSA添加到酶标孔内，37 °C孵育30min-60min;作为该 具体实施例的变形，封闭液亦可使用终浓度约为5.0%的脱脂奶粉。
[0046] 3)加入待测样品
[0047] 取出酶标板，PBS洗涤3次，以100.0yL-200.0yL/孔将待测样品加入到酶标板孔中， 37°C孵育30min-60min。其中，检测GI组病毒和GII组病毒清洗酶标板和稀释病毒的PBS分别 为pH = 3.0和pH= 7.0(ρΗ值对检测GI组和GII组病毒的影响如图1所示，在相应的pH条件下 可提高病毒粒子与病毒特异性受体的结合率）。
[0048] 4)高温裂解释放RNA
[0049] 取出酶标板，弃掉酶标板孔中液体，PBS洗涤3次，以8.5μ!7孔加入DEPC水，并以 MicroAmp 聚稀经膜封盖。95°C 孵育 5min-10min，4°C 冷却 5min。
[0050] 5)RT-qPCR反应液配制
[0051 ] 反应液配方如下：10. ΟμΜ上下游引物各0.5yL，10. ΟμΜ TaqMan探针1. OyL，2 X反应 缓冲液12.5yL，一步法RT-qPCR反应酶2. OyL(包括逆转录酶和DNA聚合酶），合计16.5yL。以 16.5μ!7孔将上述反应液加入酶标孔，并混合均匀。将酶标条用新的MicroAmp聚烯烃膜进行 封盖。
[0052] 6)RT_qPCR 检测
[0053]将酶标条放入荧光定量PCR仪中，选用FAM荧光通道。反应条件如下：第一阶段42°C 反转录10min，第二阶段95°C预变性30s;第三阶段95°C变性158,53°(：退火158,60°(：延伸 30s，扩增45个循环;4°C保温;在第三阶段进行FAM荧光信号采集。
[0054] 实施例3与传统RT-qPCR方法比较
[0055]以PBS对60.0 yLGI组人源诺如病毒阳性样本进行梯度稀释，稀释倍数从101到106， 每个稀释度体积为600.0此，平均分为2份；1份用实施例2提供的试剂盒和方法进行检测，每 个样本三个重复;另1份用病毒RNA抽提试剂盒抽提RNA，RNA溶解于30 .OyLDPEC水中，取8.5μ LRNA进行RT-qPCR反应，每个样本3个重复。结果如图2所示，当稀释倍数达到10 5时，实施例2 提供的试剂盒和方法可以检测到GI组病毒，而传统RT-qPCR方法无法检测到，表明使用本发 明可有效地提高GI组病毒的检测限。
[0056]以PBS对60.0 yLGII组人源诺如病毒阳性样本进行梯度稀释，稀释倍数从101到106， 每个稀释度体积为600.0此，平均分为2份，1份用实施例2提供的试剂盒和方法进行检测，每 个样本3个重复；另1份用病毒RNA抽提试剂盒抽提RNA，RNA溶解于30yLDPEC水中，取8.5μ LRNA进行RT-qPCR反应，每个样本3个重复。结果如图3所示，当稀释倍数达到10 5和106时，实 施例2提供的试剂盒和方法均可检测到GII组病毒，而传统RT-qPCR方法无法检测到，表明使 用本发明可有效地提高GII组病毒的检测限。
[0057]实施例4检测人工污染的河水
[0058]河水取样:选取黄浦江某支流的河水进行随机取样。采用50mL的塑料离心管进行 采集，每管30mL左右，共取3个平行水样，从3个平行水样中各取5mL于新管中混合均匀，作为 实验水样，储存于4 °C冰箱待用。
[0059] 人工污染:分别用GI组和GII组人源诺如病毒阳性样本对河水进行污染，即用河水 进行病毒稀释，共100倍和1000倍两个稀释度，并设置PBS稀释病毒作为阳性对照、仅检测河 水作为阴性对照，采用实施例2提供的试剂盒和方法进行检测。结果如图4和图5所示，其中 A-E代表的分别是A:以PBS稀释100倍的病毒阳性样本;B:以PBS稀释1000倍的病毒阳性样 本;C:以河水稀释100倍的病毒阳性样本;D:以河水稀释1000倍的病毒阳性样本;E:河水。由 结果可知，本发明可高效检出人工污染的河水中的HuNoVs，且结果稳定。
[0060] 实施例5检测人源诺如病毒临床样本
[0061]选取来自北京和湖州CDC的共10个人源诺如病毒临床样本进行检测，取用人源诺 如病毒临床样本3.OyL，用PBS稀释100倍，每个样品三个重复，采用实施例2提供的试剂盒和 方法进行检测。检测结果稳定(见图6)，表明相关引物和探针具有良好的特异性。
[0062] 实施例6检测人工污染的牡蛎样品
[0063] 模拟牡蛎生长环境，经过夜预饲养挑后选30只有活力的牡蛎随机分为两组，分别 饲养于15L海水中。将106拷贝的人源诺如病毒阳性临床样本分别投入于两组人工模拟牡蛎 饲养水体。按照上述饲养方式饲养牡蛎24h后，取出牡蛎撬壳。取牡蛎不同组织(鳃、胃、消化 盲囊及其他）以1:4的比例加入生理盐水，均质，与50%甘油1:1混合后分装至2.0mL EP管 中，储存于-80 °C。
[0064] 取0.5mL组织匀浆液加入1. OmL蛋白酶K(0.2mg/mL)充分混匀；37°C摇床孵育 60min; 60 °C 水浴 15min; 12000 X g离心 15min，收集上清 1 · OmL。以 100 · 0yL-200 · OyL/孔上清 液加入酶标孔中，采用实施例2提供的试剂盒和方法进行检测。结果如图7所示，GI组和GII 组病毒在牡蛎的鳃、胃、消化盲囊及其他组织中均呈现阳性检测结果。
[0065]实施例7检测市售的牡蛎样品
[0066] 市场上随机购买新鲜的牡蛎样品，取牡蛎不同组织(鳃、胃、消化盲囊及其他）以1: 4的比例加入生理盐水，均质，与50 %甘油1:1混合后分装至2. OmLEP管中，储存于-80 °C。取 0.5mL组织匀浆液加入1. OmL蛋白酶K(0.2mg/mL)充分混匀；37°C摇床孵育60min; 60°C水浴 15min; 12000 X g离心15min，收集上清1 .OmL。以100.0yL_200 .OyL/孔上清液加入酶标孔中， 采用实施例2提供的试剂盒和方法进行检测。结果如图8所示，对于GI组病毒而言，在牡蛎的 鳃、胃、消化盲囊中均有阳性扩增;对于GII组病毒而言，并无阳性结果。
[0067] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无 需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术 人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的 技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种人源诺如病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒至少包括如下试剂： 用于检测GI组人源诺如病毒的第一引物对和第一引物对配套TaqMan探针、用于检测GII组 人源诺如病毒的第二引物对和第二引物对配套TaqMan探针、一步反转录聚合酶链式反应试 剂； 其中，第一引物对的引物一的序列如SEQ ID NO: 1所示，第一引物对的引物二的序列如 SEQ ID NO: 2所示；第一引物对配套TaqMan探针的探针三的序列如SEQ ID NO: 3所示，第一 引物对配套TaqMan探针的探针四的序列如SEQ ID NO:4所示；第二引物对的引物五的序列 如SEQ ID N0:5所示，第二引物对的引物六的序列如SEQ ID N0:6所示；第二引物对配套 TaqMan探针的探针七的序列如SEQ ID NO:7所示。2. 如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述TaqMan探针的5'端标记有荧光报 告基团FAM，3 '端标记有荧光淬灭基团TAMRA。3. 如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括III型猪肠胃 粘膜提取物和牛血清蛋白/脱脂奶粉。4. 如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述III型猪肠胃粘膜提取物中含有 人源诺如病毒的特异性受体。5. 如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括酶标条、酶标 框、聚烯烃膜、吸水滤纸、磷酸盐缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液和DEPC水/(IdH 2O。6. 如权利要求1所述的检测试剂盒的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤： 1) 将III型猪肠胃粘膜提取物包被到酶标板上； 2) 封闭酶标板，防止酶标板非特异性吸附病毒粒子； 3) 将待测样品加入到酶标板； 4) 高温裂解释放RNA; 5) 加入第一引物对、第一引物对配套TaqMan探针、第二引物对、第二引物对配套TaqMan 探针以及一步反转录聚合酶链式反应试剂进行反应； 6) 进行RT-qPCR检测。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，在所述步骤3)中，检测GI组人源诺如病毒和 GII组人源诺如病毒的清洗酶标板和稀释病毒的缓冲液分别为pH=3.0和pH=7.0。8. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，在所述步骤4)中，高温裂解释放RNA的温度为 95。。。9. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，在所述步骤6)中，RT-qPCR检测的反应条件 为:第一阶段42°C反转录IOmin，第二阶段95°C预变性30s;第三阶段95°C变性15s，53°C退火 15s，60°C延伸30s，扩增45个循环;4°C保温;并在第三阶段进行FAM荧光信号采集。
【文档编号】C12Q1/70GK105907889SQ201610293917
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】王大鹏, 周震寰, 邢逸凡, 崔妍, 史贤明
【申请人】上海交通大学