子宫内膜癌生物标志物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了SPARCL1作为子宫内膜癌的诊治标志物的用途。据此可将SPARCL1用于开发诊断子宫内膜癌的产品、开发治疗子宫内膜癌的药物。本发明的研究成果为临床医师制定个性化治疗方案提供理论基础、并且能够为子宫内膜癌药物的开发提供新的药物靶点。
【专利说明】
子宫内膜癌生物标志物
技术领域
[0001] 本发明涉及癌症诊断、治疗、预测预后领域，更具体地，本发明涉及以检测SPARCL1 异常为手段的癌症诊断、预测预后方法;及激活SPARCL1基因或蛋白质的癌症治疗剂。
【背景技术】
[0002] 子宫内膜癌（endometrial carcinoma或carcinoma of endometrium,EC)是发生 于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，以来源于子宫内膜腺体的腺癌最常见，为女性生殖道 三大恶性肿瘤之一，占女性全身恶性肿瘤7%，在全世界范围不同地区其发病率有差异，是 西方工业化国家最常见的妇科恶性肿瘤，北美、北欧地区发病率最高，亚洲日本、印度及中 南美等地区发病率较低。我国尚缺乏子宫内膜癌比较详尽的流行病学调查资料，估计与日 本发病情况相仿。北美及欧洲发达国家高于发展中国家，前者是后者的10倍，其发病率位于 乳腺癌、大肠癌、肺癌之后，是女性全身第四位常见恶性肿瘤，位居女性生殖道恶性肿瘤第 一位。
[0003] 虽然子宫内膜癌症状出现较早、诊断相对较容易。但是在实际临床工作中关于子 宫内膜癌的诊断及治疗仍存在一些争议。肿瘤的恶性程度及病变范围，包括手术分期、组织 学类型、肿瘤分级、肌层浸润深度、淋巴转移及子宫外转移等与子宫内膜癌的预后有关。因 此，早期诊断子宫内膜癌非常重要。目前，子宫内膜癌的诊断主要依据病史及临床表现，B 超、CT及MRI等影像学检查，诊断性刮宫，宫腔镜，肿瘤标志物CA-125等辅助检查。其中CA-125还可以作为疗效观察的指标。但CA-125的缺乏组织敏感性和特异性，在卵巢上皮性肿 瘤、子宫内膜癌、子宫内膜异位症、消化系统肿瘤等疾病中均可检测到CA-125水平升高。因 此，寻找对子宫内膜癌特异性高的肿瘤标志物成为了研究热点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一在于提供一种通过检测SPARCL1基因或蛋白表达差异来诊断子 宫内膜癌的方法。
[0005] 本发明的目的之二在于提供一种通过检测SPARCL1基因或蛋白表达差异来预测子 宫内膜癌预后的方法。
[0006] 本发明的目的之三在于提供一种通过激活SPARCL1基因或SPARCL1蛋白来治疗子 宫内膜癌的方法。
[0007] 本发明的目的之四在于提供一种用于筛选治疗子宫内膜癌的药物的方法。
[0008] 本发明的目的之五在于提供一种用于治疗子宫内膜癌的药物。
[0009] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0010]本发明提供了检测SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的产品在制备子宫内膜癌诊断工 具中的用途。
[0011]本发明还提供了检测SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的产品在制备预测子宫内膜癌 预后工具中的用途。
[0012] 进一步，所述检测SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的产品包括检测SPARCL1基因或 SPARCL1蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合SPARCL1基因的核酸或者能够结合 SPARCL1蛋白的物质（例如抗体）。所述核酸能够检测SPARCL1基因的表达水平;所述物质能 够检测SPARCL1蛋白的表达水平。
[0013]本发明的检测SPARCL1基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功 能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、AS0 法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
[0014] 包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有 期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
[0015] 进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS (Ampl if i cat ion Refractory Mutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增 的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法）、PCR-RFLP法、原位RT-PCR 法、PCR-SS0 (序列特异性寡核苷酸）法、PCR-SSP法、AMPFLP (可扩增片段长度多态性）法、 MVR-PCR法、和PCR-SSCP (单链构象多态性)法来检测。
[0016] 上面所述的核酸包括扩增SPARCL1基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过 化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通 过化学合成来制备。
[0017] 在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物 的序列如SEQ ID N0.1 (正向序列）和SEQ ID N0.2(反向序列）所示。
[0018] 上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本 领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通 过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩 增它来制备。
[0019] 本发明的检测SPARCL1蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例 如，可以包括ELI SA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Wes tern印迹等。
[0020] 本发明的检测SPARCL1蛋白的产品包括特异性结合SPARCL1蛋白的抗体或其片段。 可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质 即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指 保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可 以包括F(at/ )2、Fat/、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V 区（双抗体）、或含有CDR的肽。本发明的检测SPARCL1蛋白的产品可以包括编码抗体或编码 抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
[0021 ]抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶 蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免 疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交 瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的SPARCL1蛋白或其部分对获得的抗体 实施抗原特异性纯化来获得针对SPARCL1蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体:用 与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后 使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得 的抗体的序列信息来获得抗体片段。
[0022] 标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可 以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMS0、缓冲剂、等准 备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸 如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH (DojindoLaboratories);碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷 酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories);过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标 记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories);藻胆蛋白标记试剂 盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2， B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH (DojindoLaboratories);焚光标记试剂盒诸如焚光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM) 555标记试剂盒_NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒_NH2(Dojindo Laboratories);及 DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体 标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒（Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标 记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记 的抗体或其片段。
[0023] 作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品 或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定;例如，它可以包括组织、血液、血浆、 血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材 料。
[0024] 在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
[0025] 在本发明中，"预后"是指癌症患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过 程或结果。在本说明书中，预后可以是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检查生物标志物即3?六1?(^1蛋白或 编码SPARCL1蛋白的基因来预测。预后预测可以这样进行:根据生物标志物的有或无，或者 升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。
[0026] 在本发明中，"预后良好"是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之 后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。或者，预后好可以意 指在这样长时间内存活、无转移、无复发、或无再发。例如，预后良好可以意指至少3年或尤 其是至少5年存活，优选没有转移或复发。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。如 本文中所使用的，"预后良好"还可以包括任何这样的状态，其中可以发现疾病如转移，但是 恶性低且不严重地影响生存能力。
[0027] 在本发明中，"预后不良"是指患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的短 时期（例如1、2、3、4、5年或更短）内发生致命状况。或者，预后差是指在这样的短时期里死 亡、转移、复发、或再发。例如，预后差可以意指至少3年或尤其至少5年内复发、转移、或死 亡。
[0028] 预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100%的准确度预测 患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意 味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本 发明而言，本发明中SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的水平降低的患者中，与不显示该特征的 患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。
[0029] 进一步，所述检测SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的产品可以是检测SPARCL1基因或 SPARCL1蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试 剂的高通量测序平台。
[0030]本发明还提供了一种诊断子宫内膜癌的工具，所述工具能够检测SPARCL1基因或 SPARCL 1蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合SPARCL 1基因的核酸或者能够结合 SPARCL1蛋白的物质（例如抗体）。所述核酸能够检测SPARCL1基因的表达水平;所述物质能 够检测SPARCL1蛋白的表达水平。
[0031]进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
[0032] 进一步，所述诊断子宫内膜癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量 测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断子宫内膜癌的工具，随着高通量测序技术的 发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人 群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知 SPARCL1基因的异常与子宫内膜癌相关也属于SPARCL1基因的用途，同样在本发明的保护范 围之内。
[0033] 本发明还提供了一种预测子宫内膜癌预后的工具，所述预测子宫内膜癌预后工具 包括能够结合SPARCL1基因的核酸或者能够结合SPARCL1蛋白的物质(例如抗体）。所述核酸 能够检测SPARCL1基因的mRNA水平;所述物质能够检测SPARCL1蛋白的表达水平。
[0034]进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
[0035] 进一步，所述预测子宫内膜癌预后的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高 通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断子宫内膜癌的工具，随着高通量测序技 术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正 常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知 SPARCL1基因的异常与子宫内膜癌相关也属于SPARCL1基因的用途，同样在本发明的保护范 围之内。
[0036] 本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗SPARCL1抗体或其片段所识别的氨基酸 的数目没有特别限制，只要抗体能够结合SPARCL1即可。
[0037] 本发明还提供了一种诊断子宫内膜癌或预测子宫内膜癌预后的方法，所述方法包 括如下步骤：
[0038] (1)获取受试者的样品；
[0039 ] (2)检测受试者样品中SPARCL1基因或蛋白的表达水平；
[0040] (3)将测得的SPARCL1基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
[0041] (4)与对照相比，SPARCL1基因或蛋白的表达水平降低，则该受试者被诊断为子宫 内膜癌，或该受试者被确定为预后不良。
[0042]本发明还提供了一种子宫内膜癌的治疗方法，所述方法包括激活SPARCL1基因或 SPARCL1蛋白。
[0043]进一步，所述方法包括促进SPARCL1基因的表达，或促进SPARCL1蛋白的表达或增 强SPARCL1蛋白的活性。
[0044] 本发明还提供了一种癌症药物的筛选方法，可以通过在对癌细胞添加测试药物后 或在对癌症模型动物施用测试药物后的某个时期测量SPARCL1基因或者SPARCL1蛋白的表 达水平来测定癌症药物改善癌症预后的效果。更具体地说，当SPARCL1基因或者SPARCL1蛋 白的表达水平在添加或施用测试药物后升高时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改 善癌症预后的治疗药物。
[0045] 本发明还提供了一种含有SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的激活剂的药物。
[0046] 本发明还提供了上述激活剂在制备治疗子宫内膜癌的药物中的应用。
[0047]本发明的SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的激活剂不受限制，只要是可以促进或者增 强SPARCL1或涉及SPARCL1上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗癌症有效的药 物即可。
[0048] 进一步，所述激活剂包括SPARCL1基因、SPARCL1蛋白、促进型miRNA、促进型转录调 控因子、或促进型靶向小分子化合物。
[0049] 所述激活剂还包括包含携带SPARCL1基因的载体或者宿主细胞。
[0050] 本发明的激活剂一方面可以用于补充内源性的SPARCL1蛋白的缺失或不足，通过 提尚SPARCL1蛋白的表达，从而治疗因 SPARCL1蛋白缺之导致的子宫内U旲癌。另一方面可以 用于增强SPARCL1蛋白的活性，从而治疗子宫内膜癌。
[0051] 本发明的药物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药 物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物的效果即 可，优选的是，用于治疗或预防癌症的药物可以包括例如烷化剂，诸如异环磷酰胺、环磷酰 胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法仑、和雷莫司汀;抗代谢物，诸如 依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐 (cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿啼啶、替加氟吉美啼啶奥替拉西钾、去氧氟尿 苷、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、和甲氨蝶呤;植物生物碱，诸 如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他赛、nogitecan、帕利他赛、长春瑞滨、长春地辛、和 长春碱;抗癌抗生素，诸如放线菌素 D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁 stimalamer、柔红霉素、多柔比星、啦柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素 C、和米托蒽醌； 基于铂的药物，诸如奥沙利铂、卡铂、顺铂、和奈达铂;激素药物，诸如阿那曲唑、依西美坦、 雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氟他胺、 泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和来曲唑；生物反应修饰 剂，诸如干扰素 α、干扰素 β、干扰素 γ、白介素、乌苯美司、干BCG、和香菇多糖;和分子靶向药 物，诸如伊马替尼（imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗、奥佐米星、他米巴罗汀、曲 妥单抗、维A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔单抗等。
[0052]本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、 舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
[0053]本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即 可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下 的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道， 颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。 [0054]本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可 以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例 如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
[0055] 在本发明的上下文中，"诊断子宫内膜癌"既包括判断受试者是否已经患有子宫内 膜癌、也包括判断受试者是否存在患有子宫内膜癌的风险。
[0056] 本文所用的"治疗"涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的 疾病或疾病状态，并且包括：
[0057] (1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾 病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；
[0058] (2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生;或者
[0059] (3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
[0060] 术语"治疗"通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用），其中可达到某些预 期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止）、改善病症和治愈 病症。还包括作为预防措施(例如预防）的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危 险的患者的用途，也包括在术语"治疗"中。
[0061] 本发明的优点和有益效果：
[0062] 本发明的发现了一种诊断子宫内膜癌的分子标志物，使用该分子标志物可以在子 宫内膜癌发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。
[0063]另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方 案策略。
[0064]本发明的包括SPARCL1基因或蛋白的激活剂的治疗药物可用作新的子宫内膜癌的 治疗药物。
【附图说明】
[0065] 图1显示利用Western blot检测SPARCL1蛋白在子宫内膜癌组织与正常子宫内膜 组织中的表达情况；
[0066] 图2显示利用Western blot检测SPARCL1基因过表达情况。
[0067]具体的实施方式
[0068] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0069] 实施例1基因芯片筛选差异表达基因
[0070] 1、样本收集：
[0071] 子宫内膜癌组织样本:收集子宫内膜癌患者，全部患者均经手术治疗，手术石蜡标 本10例。所有患者均经过病理检查确诊患有子宫内膜癌。其他入组条件为:所有患者入院前 未接受过任何治疗:未合并其他恶性肿瘤;未合并其他激素相关性疾病;临床资料完整。 [0072] 10例子宫内膜癌患者，发病平均年龄58岁。患者主要临床表现为阴道不规则出血、 下腹痛、月经紊乱、阴道排液等，亦有部分患者无明显症状而于健康查体发现。子宫内膜癌 标本经HE染色切片，组织形态学确诊为子宫内膜癌。
[0073] 正常子宫内膜组织样本：10例正常子宫内膜手术石蜡标本。样本来源的病人所患 疾病包括:子宫肌瘤、子宫脱垂、膀胧膨出、直肠膨出。
[0074] 2、组织RNA的获取
[0075] 使用Trizol-步法提取组织总RNA，通过Nanodrop ND-1000读取260nm和280nm处 的吸光度值(A)测定RNA溶液的纯度。经1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察， 检测RNA的完整性。
[0076] 3、基因芯片杂交及扫描
[0077] 总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit 纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美 国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4x 44K基因），在芯片杂交炉中65°C杂交17h，然后 洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
[0078] 4、芯片数据处理与分析
[0079] 杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值 的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。
[0080] 5、统计学处理
[0081] 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P〈 0.05差异有显著性意义。
[0082] 6、结果
[0083] 芯片结果显示，子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织之间共筛选出654个差异表 达基因，其中表达水平上调的基因421个，表达水平下调的基因233个。
[0084]实施例2大样本验证筛选出的差异表达基因
[0085]考虑现有技术中还未见关于该基因与子宫内膜癌相关性进行研究的基因作为候 选基因，同时考虑基因测序的结果，选择SPARCL1基因（其表达在子宫内膜癌组织中下调)进 行验证。
[0086] 1、样本收集
[0087]按照实施例1的方法收集子宫内膜癌组织50例，正常子宫内膜组织60例。
[0088] 2、在mRNA水平上进行验证
[0089] 2.1提取组织RNA
[0090] 步骤同实施例1。
[0091] 2.2逆转录
[0092] 使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lyg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μ1 反应体系，每个样品取lyg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分:DEPC水，5 X逆 转录缓冲液，10mm〇l/l dNTP，0.1mmol/l DTT，30ymmol/l Oligo (1Τ，20〇υ/μ1 MMLVRT，模板 RNA。42 °C孵育1小时，72 °C 10分钟，短暂离心。
[0093] 2.3PCR
[0094] 使用引物设计软件Primer Premier 5.0设计mRNA焚光定量上下游PCR引物，合成 引物序列，使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒操作，具体步骤按说明书进行操作，采 用25μ1反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可 靠性。配制以下反应体系(如表1所示），各项操作均于冰上进行：
[0096]
[0095] 表1荧光定量PCR各组分及相应体积
[0097]
[0098] 以GAH)H为内参，以SYBR Green I作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR 仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，△ ACT法进行相对定量。
[0099] SPARCL1基因引物序列如下所示：
[0100] 上游引物：5'-TCAATAAGCACATTCAAG-3'（SEQ ID N0.1);
[0101] 下游引物：5'-ATTACCATCATCAGTAGG-3'（SEQ ID N0.2)。
[0102] GAPDH基因引物序列如下所示：
[0103] 上游引物：5'-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID N0.3);
[0104] 下游引物：5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQ ID N0.4)。
[0105] 2.4结果
[0106] 结果显示，与正常子宫内膜组织相比，子宫内膜癌组织中SPARCL1基因的mRNA水平 明显下调，相对表达量为〇. 18 ±0.012，差异具有统计学意义(P〈0.05)。
[0107] 3、在蛋白水平上进行验证
[0108] 3.1提取组织总蛋白
[0109]按照EpiQuik组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
[0110] 3.2Western blot检测
[0111] 将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、 显色。
[0112] 3.3统计学处理
[0113]将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将SPARCL1蛋 白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用 SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0.05时具有统 计学意义。
[0114] 3.4 结果
[0115]结果如图1所示，与正常子宫内膜组织相比，子宫内膜癌组织中SPARCL1蛋白水平 显著降低，差异具有统计学意义(P〈〇. 05)。
[0116] 实施例3 SPARCL1基因过表达
[0117] 1、质粒构建
[0118] 根据SPARCL1基因的编码序列设计扩增引物，引物的设计为本领域技术人员所熟 知。从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的5?六1?(^1基因的编 码序列，上述cDNA序列插入到真核细胞表达载体pcDNA3. 1中，连接获得的重组载体 pcDNA3.1-SPARCL1用于后续实验。
[0119] 2、子宫内膜癌细胞的培养与转染
[0120] 2.1细胞培养
[0121] Ishikawa3-H-12细胞系均用50ml的培养瓶贴壁培养于RPMI 1640培养基(含10% 胎牛血清，l〇〇U/ml青霉素，100g/ml链霉素）中，在37 °C，5 %⑶2饱和湿度的培养箱中连续培 养。
[0122] 2.2细胞转染
[0123] 1、转染前一天将0.5_2*105个肿瘤细胞悬浮于500μ1不含抗生素的培养基，接种至 24孔培养板。
[0124] 2、转染当天细胞密度应达80%-90%，准备以下复合物Α:将lyg质粒DNA稀释于无 血清培养基中，轻轻混勾；复合物B:取4μ1 Lipofectamine2000稀释于无血清培养基中，混 匀。
[0125] 3、将复合物A和B混合，轻轻混匀，室温孵育。
[0126] 4、将100μ1脂质体复合体加入肿瘤细胞中，上下左右轻轻混匀，将细胞放入37°C含 5 % C02培养箱孵育5-7小时。
[0127] 5、加 lml含有2倍正常血清和抗生素浓度的生长培养基，继续培养细胞18-24小时。
[0128] 3、利用QPCR实验检测pcDNA3.1-SPARCL1的过表达情况
[0129] 3.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
[0130] 3.2逆转录
[0131] 步骤同实施例2。
[0132] 3.3QPCR
[0133] 步骤同实施例2。
[0134] 3.4 结果
[0135] 结果显示，pcDNA3.1-SPARCL1能够成功过表达，相对表达量为5.94 ± 0.78，差异具 有统计学意义(P〈〇.〇5)。
[0136] 3、Western blot实验检测pcDNA3 · 1-SPARCL1 过表达情况
[0137] 步骤同实施例2。
[0138] 结果如图2所示，与转染pcDNA3. 1组相比，转染pcDNA3. 1-SPARCL1的细胞中 SPARCL1蛋白的含量明显增加，差异具有统计学意义(P〈0.05)。
[0139] 实施例4 SPARCL1基因的表达对子宫内膜癌细胞增殖能力的测定
[0140] 1、步骤：
[0141] 应用5-溴-2'脱氧尿嘧啶(Brd U)标记及检测试剂盒。参照试剂盒使用说明，细胞 转染(转染步骤同实施例3)48小时后，吸弃培养基，加入Brd U标记培养基，37°C，5 %⑶2培 养箱中培育60min。弃去培养基，PBS冲洗后，以70 %乙醇固定，过夜。用一抗为小鼠的抗Brd U抗体，二抗为带FITC的抗小鼠的荧光抗体，进行免疫反应。然后进行流式细胞学检测。
[0142] 2、Brd U掺入结果：
[0143] 结果显示：转染pcDNA3 · 1细胞组掺入率平均为：（28 · 59 ± 1 · 37) % ; pcDNA3 · 1-SPARCL1细胞组掺入率平均为（11.64 ±0.53) %，差异具有统计学意义(P〈0.05)。上述实验 结果表明，SPARCL1基因表达抑制了子宫内膜癌细胞的增殖。
[0144] 实施例7 Transwell实验检测SPARCL1基因表达对细胞迀移的影响
[0145] 步骤：
[0146] 1、从-80 °C的冰箱中取出冻存的Matr i ge 1物，然后在4 °C温度条件下过夜，使其变 成液体。
[0147] 2、取出200μ1无血清细胞培养基，加入50μ1的Matrigel试剂，在低温条件，最好是 在冰面上操作将其混和均匀，然后各加入1〇〇μ1，放在37°C，二氧化碳的培养箱中培育5h，此 间常观察液体情况，当液体变成稍白色时，说明其已变为凝固态。
[0148] 3、将转染过的细胞(按照实施例3步骤操作）用胰酶消化，用不含血清的培养基清 洗3次，然后计数，再将其配成细胞悬浮液。
[0149] 4、用无血清的培养基将凝胶轻轻洗1次，然后将2*105细胞悬浮于100μΙ RPMI 1640中，再接种于transwell上室。
[0150] 5、下室加600μ1 10%FBS RPMI 1640。
[0151] 6、37 °C培养箱中，培养12h后，取出transwe 11小室，每组均重复4个样本。
[0152] 7、其中1个小室弃去培养基，用无钙的roS洗3遍，4%多聚甲酵固定lOmin，棉签擦 掉上层未迀移的细胞，PBS洗3遍，结晶紫染色或Giemsa染色，在显微镜下观察。剩余3个小室 将其下层迀移细胞用0.25%膜蛋白酶消化，计算迀移细胞数。
[0153] 结果：
[0154] 迀移实验结果显示，转染pcDNA3. 1细胞组细胞迀移个数平均为242个，转染 pcDNA3.1-SPARCL1细胞组细胞迀移个数平均为147个，差异具有统计学意义(P〈0.05)。
[0155] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的产品在制备诊断子宫内膜癌或预测子宫内膜癌 预后的工具中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的产 品包括检测SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的表达水平的产品。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合SPARCL1基因的 核酸或者能够结合SPARCL1蛋白的物质；所述核酸能够检测SPARCL1基因的表达水平;所述 物质能够检测SPARCL1蛋白的表达水平。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩 增SPARCL1基因的引物如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示。5. -种诊断子宫内膜癌或预测子宫内膜癌预后的工具，其特征在于，所述工具包括能 够检测SPARCL1基因或SPARCL1蛋白的表达水平的工具。6. 根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合SPARCL1基因的核 酸或者能够结合SPARCL1蛋白的物质；所述核酸能够检测SPARCL1基因的表达水平;所述物 质能够检测SPARCL1蛋白的表达水平。7. 根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩 增SPARCL1基因的引物如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示。8. -种治疗子宫内膜癌的药物，其特征在于，所述药物包含SPARCL1基因或SPARCL1蛋 白的激活剂。9. 根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述激活剂能够促进或增强SPARCL1或涉 及SPARCL1上游或下游途径的物质的表达或活性。10. 权利要求8或9所述的激活剂在制备治疗子宫内膜癌的药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK105907879SQ201610491574
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】杨承刚, 任静
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司