用于使用乳酸脱氢酶转化体从c1化合物以生物方式产生乳酸的组合物和方法
【专利说明】用于使用乳酸脱氢酶转化体从C1化合物以生物方式产生 乳酸的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请依据35 U.S.C. § 119(e)要求临时申请：2013年6月18日提交的美国申 请号61/836,609和2014年1月16日提交的美国申请号61/928, 390的权益，所述申请两 者均以引用的方式整体并入本文。
[0003] 对序列表的引用
[0004] 依据37 C. F. R. § 1. 821与此同时通过EFS网以计算机可读形式（CRF)以文件名 200206_414W0_SEQUENCE_LISTING. txt电子提交的"序列表"以引用的方式并入本文。序列 表的电子拷贝于2014年6月17日创建，并且在磁盘上的大小是222千字节。
[0005] 背景
[0006] 可以化学或生物方式产生的乳酸是一种广泛使用的化合物，其使用范围从化妆 品行业到食品行业到药物和化学行业。因为乳酸含有两个反应性官能团，即羧基和羟基， 所以它可经受向潜在适用化学品的多种化学转化，所述化学品如氧化丙烯、乙醛、丙烯酸、 丙酸、2, 3-戊二酮和丙交酯（Varadarajan 和 Miller, Biotechnol. Progr. 15:845, 1999) 〇 近来，增加的注意力已指向使用乳酸产生聚乳酸（PLA)，其是一种用于制造生物塑料， 提供石油化学资源的更可持续替代物的可再生原材料。光学纯乳酸可通过缩聚、解聚 和开环聚合的连续反应来聚合成高分子质量的PLAC SSdergird和stolt, Prog. Polym. Sci. 27:1123, 2002)。所得PLA聚合物在广泛范围应用中具有各种用途，所述应用包括防护 月艮、食品包装、地膜、垃圾袋、刚性容器、收缩包装和短暂保存期限托盘（Drumright等，Adv. Mater. 12:1841，2000 ;Vink 等，Polym. Degrad. Stabil. 80:403, 2003)。
[0007] 当前用于生物乳酸生产的碳水化合物原料是相对昂贵的。其它原料，如甲烷，可大 量廉价获得。甲烷的转化潜在代表一种用以达成显著较低成本乳酸产生的途径。然而，尚 未开发实现这个的实际方式。
[0008] 简要概述
[0009] 在一个实施方案中，本发明提供一种包含编码乳酸脱氢酶（LDH)的外源性核酸的 非天然存在的C 1代谢细菌。
[0010] 在另一实施方案中，本发明提供一种包含编码乳酸脱氢酶的外源性核酸的非天然 存在的C 1代谢微生物，其中所述C i代谢微生物是甲烷氧化菌。
[0011] 在另一实施方案中，本发明提供一种包含编码乳酸脱氢酶的外源性核酸的非天然 存在的C1代谢微生物，其中所述C 谢微生物能够使碳原料转化成乳酸，并且其中所述碳 原料选自由甲烷、二氧化碳、一氧化碳、天然气和合成气组成的组。
[0012] 在某些实施方案中，本发明提供一种包含编码乳酸脱氢酶的外源性核酸的非天然 存在的C1代谢微生物，其中所述c 谢微生物不是酵母。
[0013] 在其它实施方案中，本发明提供一种包含编码乳酸脱氢酶的外源性核酸的非天然 存在的C 1代谢微生物，其中当在C i底物存在下在至少一组培养条件下培养时，所述非天然 存在的C1代谢微生物能够产生相较于相应参照C i代谢微生物的乳酸更多的乳酸。
[0014] 附图简述
[0015] 图1描绘相较于在生长72小时之后的0D_，表达异源性乳酸脱氢酶（Idh)核酸的 某些重组荚膜甲基球菌（Methylococcus capsulatus) Bath的乳酸产生水平。
[0016] 图2描绘各种碳源的δ 13C分布。
[0017] 图3描绘本发明的载体pMS3,其包含编码复制起始蛋白（trfA)以及启动子 (Pbla)、复制起点（oriV)、转移起点（oriT)、多克隆位点（MCS)、卡那霉素抗性基因（KanR) 和启动子（KanR_启动子）和用于大肠杆菌（E. coli)的复制起点（pUC_0ri_rc)的序列。
[0018] 详细描述
[0019] 本公开提供用于从碳原料生物合成乳酸的非天然存在的C1代谢微生物以及相关 组合物和方法。通常，碳原料包括C1底物。在一特定实施方案中，本发明提供一种包含编码 乳酸脱氢酶（LDH)的外源性核酸的非天然存在的C1R谢细菌。本发明也提供一种包含编 码乳酸脱氢酶的外源性核酸的非天然存在的(；代谢微生物，其中所述C 1代谢微生物是甲烷 氧化菌。在一特定实施方案中，本公开提供一种包含编码乳酸脱氢酶的外源性核酸的非天 然存在的C 1代谢微生物，其中所述C 谢微生物能够使碳原料转化成乳酸。通常，碳原料 选自由甲烷、二氧化碳、一氧化碳、合成气和天然气组成的组。本发明进一步提供一种包含 编码乳酸脱氢酶的外源性核酸的非天然存在的C1代谢微生物，其中所述c 谢微生物不是 酵母。在另一实施方案中，本发明提供一种包含编码乳酸脱氢酶的外源性核酸的非天然存 在的C1代谢微生物，其中当在C i底物存在下在至少一组培养条件下培养时，所述非天然存 在的C1R谢微生物能够产生相较于相应参照c 谢微生物的乳酸更多的乳酸。在另一实 施方案中，本发明提供包含编码乳酸脱氢酶的外源性核酸的非天然存在的C1代谢微生物， 其中当在C 1底物存在下在至少一组培养条件下培养时，所述非天然存在的C i代谢微生物能 够产生相较于相应参照C1代谢微生物的乳酸更多的乳酸。
[0020] 在更详细阐述本公开之前，可有助于理解本公开的是提供待用于本文中的某些术 语的定义。其它定义在整篇本公开中阐述。
[0021 ] 在本描述中，对本文任何范围的公开都意图是对所述范围内的任何数值的公开以 及对由所述范围内的任何数值形成的任何范围的公开，包括端点。如本文所用，除非另外指 示，否则术语"约"意指所指示范围、值或结构的±20%。术语"基本上由…组成"使权利 要求的范围限于指定材料或步骤，或不实质上影响要求保护的发明的基本和新型特征的那 些。应了解如本文所用的术语"一（a/an)"是指"一个或多个"列举的组分。替代物"或" 的使用应被理解为意指替代物中的一个、两个或其任何组合。如本文所用，术语"包括"、"具 有"和"包含"不排除存在未另外明确排除的其它要素。
[0022] 当与多肽结合使用时，术语"乳酸脱氢酶"和"LDH"在本文中可互换用于指具有乳 酸脱氢酶活性，即能够催化丙酮酸还原成乳酸的多肽。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶是催 化丙酮酸还原成L-乳酸的L-乳酸脱氢酶（EC I. 1. 1.27)。在其它实施方案中，乳酸脱氢酶 是催化丙酮酸还原成D-乳酸的D-乳酸脱氢酶（EC I. I. 1. 28)。
[0023] 术语"碳原料"在本文中是指能够由本发明的非天然存在的C1代谢微生物代谢的 任何碳化合物，例如像C1底物。
[0024] 如本文所用，术语底物"是指缺乏碳-碳键的任何含碳分子。C i底物可见于天 然气、非常规天然气、合成气中，并且包括例如像甲烷、甲醇、甲醛、甲酸（甲酸盐）、一氧化 碳、二氧化碳、甲基化胺（例如甲胺、二甲胺、三甲胺等）、甲基化硫醇、甲基卤素（例如溴甲 烷、氯甲烷、碘甲烷、二氯甲烷等）、氰化物等的分子。
[0025] 如本文所用，术语"甲烷"是指具有化学式014的最简单（C1)烷烃化合物，其是一 种在室温和压力下无色和无味的气体。
[0026] 如本文所用，术语"天然气"是指含有甲烷的天然存在的地下气体混合物。天然气 可通过常规方法（例如钻探、注水）从多孔储集层获取。尽管主要由甲烷组成，但天然气也 可包含其它轻质烷烃气体（例如乙烷、丙烷、丁烷、戊烷）、二氧化碳、氮气、硫化氢等或其任 何组合。
[0027] 术语"非常规天然气"在本文中是指于具有低可渗透性，必须通过非常规方法（如 水力压裂、水平钻探或定向钻探）达到的地层中产生的天然存在的气体混合物。示例性非 常规天然气沉积物包括在砂岩或碳酸盐岩中形成的致密砂岩气、在煤沉积物中形成并吸附 于煤粒子中的煤床甲烷、在细粒化页岩石中形成并吸附于粘土粒子中或保持在小孔或微小 断层内的页岩气、在低温和高压下在如海洋下和永冻层的地点中形成的是天然气和水的结 晶组合的甲烷水合物。非常规天然气相较于常规天然气倾向于具有更可变组成，包括具有 潜在较高水平的乙烷、丙烷、丁烷、〇) 2或其任何组合。
[0028] 如本文所用，术语"合成气体"或"合成气"是指主要含有一氧化碳（CO)和氢气 (H 2)的以合成方式产生的气体混合物。合成气可通过例如天然气或液体烃的蒸汽重整或通 过煤、生物质或废物的气化来产生。合成气也可包括甲烷、C0 2、H2S和相对于CO和H2呈较 小量的其它气体。
[0029] 如本文所用，"(^代谢微生物"是指能够使用（即代谢）C i底物作为能量、生物质来 源的任何微生物，并且可或可不使用其它碳底物（如糖和复合碳水化合物）来获得能量和 生物质。C 1代谢微生物包括细菌（如甲烷氧化菌和甲基营养菌）和酵母。在某些实施方案 中，C1R谢微生物不包括光合微生物，如藻类。在某些实施方案中，C 1代谢微生物将为"专 性C1代谢微生物"，这意味着它需要C i底物作为它的能源。在其它实施方案中，将在C 1底 物存在下（即使用C1底物作为能源）培养C i代谢微生物（例如甲烷氧化菌）。
[0030] 如本文所用，术语"甲烧氧化菌"、"甲烧氧化细菌（methanotrophic bacterium) " 或"甲烧氧化细菌（methanotrophic bacteria) "在本文中可互换指代能够利用甲烧的甲 基营养型细菌。举例来说，来自天然气的甲烷可用作生长的碳源和能源。如本文所用，术语 "甲烷氧化细菌"包括仅可利用甲烷（例如来自天然气）来获得碳源和能源的"专性甲烷氧 化细菌"和除甲烷之外，也天然地能够使用如乙酸、丙酮酸、、苹果酸或乙醇的多碳底物作为 它们的碳源和能源的"兼性甲烷氧化细菌"。
[0031] 如本文所用，术语"甲基营养菌"或"甲基营养型细菌"是指能够使用一碳化合 物（即不含有碳-碳键的化合物）的任何细菌。在某些实施方案中，甲基营养型细菌可 为甲烷氧化菌。举例来说，"甲烷氧化细菌"是指能够利用甲烷作为它的主要碳源和能源 的任何甲基营养型细菌。示例性甲烷氧化细菌包括甲基单胞菌属（Methylomonas)、甲基 杆菌属（Methylobacter)、甲基球菌属（Methylococcus)、甲基弯曲菌属（Methylosinus)、 甲基孢囊菌属（Methylocystis)、甲基微菌属（Methylomicrobium)或甲烧单胞菌属 (Methanomonas)。在某些其它实施方案中，甲基营养型细菌是"专性甲基营养型细菌"，其是 指局限于使用C 1底物来产生能量的细菌。
[0032] 如本文所用，术语"宿主"是指可用外源性核酸进行遗传修饰以产生目标多肽（例 如乳酸脱氢酶）的细胞或微生物（例如甲烷氧化菌）。在某些实施方案中，宿主细胞可任选 已具有或被修饰以包括赋予与由外源性核酸编码的外源性LDH相关或无关的所需性质的 其它遗传修饰（例如丙酮酸脱羧酶缺失）。举例来说，宿主细胞可具有以下遗传修饰：使对 所产生的乳酸产物的利用最小或降低，使宿主细胞生长抑制剂的产生最小或降低，提供高 生长，提供对污染物或特定培养条件的耐受性（例如酸耐受性、杀生物剂抗性），赋予代谢 其它碳底物的能力，或赋予合成其它合乎需要的产物或中间体的能力。
[0033] 如本文所用，术语"核酸分子"和"核酸"可互换用于指代由共价连接的核苷酸亚单 位组成的聚合化合物。合成产生核酸包括使核酸复制的化学和生物方法。核酸包括多核糖 核酸（RNA)、多脱氧核糖核酸（DNA)，其两者均可为单链或双链。DNA包括cDNA、基因组DNA、 合成DNA、半合成DNA等。术语"LDH核酸"和"LDH编码核酸"在本文中可互换用于指编码 具有LDH活性的多肽的核酸。
[0034] 术语"多肽"和"蛋白质"在本文中可互换用于指代氨基酸的聚合物。
[0035] 如本文所用，术语"重组"或"非天然"（或"非天然存在"）可互换指代生物体、微 生物、细胞、核酸或载体包括至少一个遗传改变或已通过引入外源性核酸而被修饰，或是指 细胞已被改变以使内源性核酸或基因的表达可被控制，其中所述改变或修饰通过遗传工程 改造引入或诱导。遗传改变包括例如引入编码蛋白质或酶的可表达核酸的修饰，或其它核 酸添加、缺失、取代或对细胞的遗传物质的其它功能性破坏，或通过本领域中已知的经典菌 株进化或定向分子进化方法实现的修饰。所述修饰包括例如在编码区（及其功能性片段） 和非编码调控区中的修饰，其中修饰改变基因或操纵子的表达。
[0036] 如本文所用，术语"转化"和"转化"是指将核酸（例如外源性或异源性核酸）引入 宿主细胞中。转化的宿主细胞可携带染色体外或整合在染色体中的外源性或异源性核酸。 整合至宿主细胞基因组和自我复制性载体中通常导致转化的核酸分子遗传稳定遗传。含有 转化的核酸的宿主细胞可互换称为"重组"或"非天然存在的"或"遗传工程改造的"或"转 化的"或"转基因"细胞（例如细菌）。
[0037] 如本文所用，术语"相应参照C1代谢微生物"是指无 LDH编码外源性核酸的相应C i 代谢微生物。
[0038] 当与核酸、多肽、化合物或活性结合使用时，术语"内源性"或"天然"可互换用于指 存在于野生型宿主细胞中的核酸、多肽、化合物或活性。当与细胞结合使用时，术语"天然" 是指野生型细胞。
[0039] 如本文所用，"异源性"或"外源性"核酸、构建体或序列在本文中可互换用于指不 是宿主细胞天然的核酸分子或核酸分子的部分，或已被改变或突变的宿主细胞天然的核酸 分子或核酸分子的部分，或在类似条件下相较于天然表达水平，表达改变的核酸分子。此 外，术语"异源性"和"外源性"可指生物活性与宿主细胞内源性生物活性不同或从其改变， 或不是宿主细胞天然的，而是代之以由引入宿主细胞中的核酸分子编码。
[0040] 两个或更多个核酸序列或两个或更多个氨基酸序列之间的"同一性百分比"是由 序列共有的相同位置的数目的函数（即同一性％=相同位置的数目/位置总数X100)，同 时考虑空位的数目以及需要被引入以优化两个或更多个序列的比对的各空位的长度。当在 使用确定参数（即确定的氨基酸取代矩阵、空位存在罚分（也称为空位开放罚分）和空位 延伸罚分）以便获得那对序列所可能的最高类似性评分下使两个序列对准时，它们被最优 比对。
[0041]使用数学算法，如 BLAST 算法（例如 Altschul 等，J Mol. Biol. 215:403, 1990 ; 也参见在万维网ncbi. nlm. nih. gov/BLAST处的BLASTN)实现用于确定两个或更多个序 列之间的同一性百分比的"最优比对"。对于氨基酸序列，BL0SUM62矩阵（Henikoff和 Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (22) : 10916-10919)用作如 BLASTP 的氨基酸 序列比对算法中的缺省评分取代矩阵。施加空位存在罚分以在一个比对序列中引入单一 氨基酸空位，并且对空位中的各残基位置施加空位延伸罚分。用以下比对参数使用BLASTP 来进行氨基酸序列的最优比对：BL0SUM62评分矩阵，空位存在罚分=11，以及空位延伸罚 分=1。对于核酸序列的最优比对，BLASTN与以下比对参数一起使用：匹配/错配评分= 1/-3,以及空位存在罚分=5和空位延伸罚分=2。类似性评分通过各序列的开始和结束比 对所处的氨基酸或核苷酸位置（例如比对窗），以及任选通过向一个或两个序列中插入一 个空位或多个空位以便获得最高可能的类似性评分来确定。
[0042] "保守性取代"在本领域中被公认为一个氨基酸被取代成具有类似性质的另 一氨基酸。示例性保守性取代在本领域中是熟知的（参见例如1997年3月13日公布 的 WO 97/09433，第 10 页；Lehninger, Biochemistry,第 2 版；Worth Publishers, Inc. NY:NY(1975),第 71-77 页；Lewin, Genes IV，0xford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA(1990)，第 8 页）。
[0043] 如本文所用，"过度表达"在关于核酸或蛋白质使用时是指所述核酸或蛋白质的表 达或活性增加。表达或活性增加包括核酸或蛋白质的表达或活性增加高于野生型（非遗传 工程改造）对照或参照微生物的水平。如果表达或活性处于其中核酸或蛋白质通常不被表 达或不具有活性的微生物中，那么它过度表达。如果表达或活性在重组微生物中比在野生 型对照或参照微生物中延长或存在更长久，那么核酸或蛋白质过度表达。
[0044] 如本文所用的"抑制"或"被抑制"是指相对于对照、内源性或参照分子，在靶标基 因的表达方面或在靶标分子的活性方面直接或间接改变、降低、下调、废除或缺失，其中所 述改变、降低、下调或废除是统计、生物、工业或临床显著的。
[0045] 如本文所用，术语"衍生物"是指通过化学或生物手段（例如用或不用酶）达成的 化合物的修饰，所述修饰的化合物在结构上类似于母体化合物，并且（实际上或理论上）可 从那个母体化合物衍生。衍生物与母体化合物可具有不同化学、生物或物理性质，如相较于 母体化合物更具亲水性或具有改变的反应性。衍生（即修饰）可涉及取代分子内的一个或 多个部分（例如官能团变化）。举例来说，氢可被如氟或氯的卤素取代，或羟基（-OH)可被 羧酸部分（-C00H)置换。其它示例性衍生包括聚合、糖基化、烷基化、酰化、乙酰化、泛素化、 酯化和酰胺化。
[0046] 术语"衍生物"也指母体化合物的所有溶剂合物（例如水合物或加合物（例如与 醇的加合物））、活性代谢物和盐。盐的类型取决于化合物内各部分的性质。举例来说，如羧 酸基团的酸性基团可形成碱金属盐或碱土金属盐（例如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐以及与在生 理上可耐受的季铵离子形成的盐和与氨和在生理上可耐受的有机胺（例如像三乙胺、乙醇 胺或三-(2-羟乙基）胺）形成的酸加成盐）。碱性基团可与例如无机酸（如盐酸、硫酸或 磷酸）或与有机羧酸或磺酸（如乙酸、柠檬酸、乳酸、苯甲酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石 酸、甲烷磺酸或对甲苯磺酸）形成酸加成盐。同时含有碱性基团和酸性基团（例如除碱性 氮原子之外也含有羧基）的化合物可以两性离子形式存在。盐可通过为本领域技术人员所 知的惯用方法，例如通过在溶剂或稀释剂中组合化合物与无机或有机酸或碱，或通过阳离 子交换或阴离子交换由其它盐获得。
[0047] 如本文所用，术语"乳酸"是指所有形式的乳酸，包括所有衍生形式，如乳酸盐、乳 酸离子、乳酸酯、乳酸溶剂合物和/或乳酸或乳酸酯的寡聚物。
[0048] 术语"表达控制序列"意指指导与其操作性地连接的核酸的转录的核酸序列，例如 像启动子或增强子。
[0049] 术语"可操作地连接"在本文中是指以下构型：其中控制序列相对于外源性LDH编 码核酸被适当放置在某一位置处以使所述控制序列影响编码的LDH的表达。
[0050] 如本文所用，术语"相应的亲本乳酸脱氢酶"是指天然存在的乳酸脱氢酶或LDH序 列变体的氨基酸序列所基于的另外已知的乳酸脱氢酶。
[0051] C1R谢微生物-宿主细胞
[0052] 通过将所需外源性LDH编码核酸引入所需宿主细胞中来制备本发明的非天然存 在的C1代谢微生物。将被遗传修饰的C 1代谢微生物可为天然菌株，被改适（例如进行发酵 以选择相较于亲本菌株，乳酸利用降低、生长速率提高或总生物质产量增加的菌株）或先 前被重组修饰以使烷烃或烯烃转化成乳酸，具有降低或最小丙酮酸脱羧酶活性，具有增加 的生长速率或其任何组合的菌株。在某些优选的实施方案中，C 1代谢微生物不是光合微生 物，如藻类或植物。常常，本发明的C1代谢微生物不是酵母，并且通常不是真菌。在一些实 施方案中，本发明的C 1R谢微生物不是光合微生物或真菌。
[0053] 在某些实施方案中，本发明的C1代谢微生物是作为来自以下属中的一个或多个 的遗传修饰的细胞的原核生物或细菌：甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯曲