专利名称：被二噁英样化合物转化的Ah受体的免疫测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测转化的Ah受体，以及随后通过检测转化的Ah受体而间接检测二噁英样化合物。
背景技术：
导言在最近的数十年里，二噁英已成为详细研究的热门课题。这归因于它们很大的毒性，以及据推测它们在环境中广泛的存在。对二噁英的毒理学研究主要集中在通过采用动物模型和细胞培养体系对它们的生物学活性进行研究。此外，二噁英对人类健康的潜在威胁还仅是通过对已知暴露于二噁英的人群进行流行病学研究的有限方法进行。从环境角度着眼于研究二噁英的产生、释放和降解。尽管在这些方面二噁英得到了广泛的研究，然而它们对生物系统的毒性的确切机制以及它们在环境中的分布范围尚不知晓。这部分是由于缺少评估生物系统暴露于二噁英及其相关化合物的简单方法。本发明的目的是克服本领域的这种缺陷。
环境中的TCDD及其相关化学制品术语二噁英，通常为新闻媒体所采用，是2，3，7，8-四氯二苯并-对-二噁英(″TCDD″)的缩写。TCDD仅仅是多氯化的二苯并-对-二噁英家族中的一员(即同类物)，而该家族具有75种可能的同类物，其结构随着氯原子的数目和位置而变化。引起混淆的来源是术语″二噁英″一词或者被用于专指TCDD，或者用于指整个多氯二苯并二噁英(PCDD)家族。从生物学上来讲，TCDD是最强的PCDD；多数其它的PCDD活性要弱10到上千倍。TCDD在所有PCDD同类物中是研究得最为深入的一种。
一些芳香烃同TCDD具有相同的生物学特性，尤其是当其侧向位置被氯所取代时。这些化合物中最为重要的是多氯二苯并呋喃(″PCDF″)和某些多氯联苯家族(″PCB″)的成员。可能数目很大的PCDD(75)、PCDF(135)和PCB(20)的同类物使得环境分析变得复杂了，并且在能够采取此类分析前需要进行复杂的清除程序。在此所使用的″二噁英样化合物″包括所有上述所定义化合物家族的成员以及其它诱导相似细胞效应的化合物，例如偶氮苯和苯并芘。使用2，4，5-三氯苯氧基乙酸和2，4-二氯苯氧基乙酸脱叶剂，特别是通过在美国和越南所进行的森林喷洒计划，TCDD作为其产生的一种污染物在本世纪70年代早期引起了科学界和公众的注意。
现有的TCDD检测技术在过去十年中检测二噁英样化合物的主要方法涉及使用物理-化学分析。这类方法通常包括一步或多步样品清除步骤以便从原始样本中提取出分析物，经气相色谱从与其它化合物的混合物中分离出感兴趣的分析物，通过质谱进行检测，并且与已知的合成标准物比较对分析物进行鉴定。这些步骤在R．E．Clement的“超痕量二噁英和二苯并呋喃分析30年来的进展”，分析化学，Vol．63，no．23(1991)和分析新闻(Sept／Oct 1992)中得到了综述。尽管很灵敏，但由于其高昂的价格(即每个样品达到2500美元)以及需要在中心实验室由熟练的操作者进行分析，这些技术并不适合筛选大批量的样品。此外，对二噁英样化合物进行物理-化学分析并不适合对含二噁英样化合物的混合物进行毒性预测，或对尚没有合成标准物存在的二噁英样化合物进行鉴定。
另一种检测二噁英样化合物的方法是采用生物检测，即对活细胞或动物给予检测样品，然后分析细胞色素P450IA1活性的诱导-这种特性据认为可提示二噁英样化合物的存在。
一系列的文献都公开了细胞系生物检测的方法。在D．E．Tillitt等“H4IIE大鼠肝癌细胞生物检测作为评估环境样品中平面卤化烃毒性强度的手段的特征”，环境科学技术，Vol 25，no．1，pp．87-92(1991)中，利用H4IIE大鼠肝癌细胞全面评估不同二噁英样化合物的毒性强度。当这种细胞被检测样品处理后，它们被采取分光荧光分析来检测芳香烃羟化酶和乙氧基试卤灵-正-脱乙基酶活性(细胞色素P450IA1诱导的指示物)。T．Zacharewski，“体外应用芳香烃羟化酶诱导分析法确定‘2，3，7，8-四氯二苯并-对-二噁英的等价物’；被热解的溴化阻燃剂，”毒理学，51∶177-89(1986)(″Zacharewski″)总的来说与之相似。
还采用了需要利用活动物的生物检测。在Zacharewski，大鼠注射检测样品并被处死。回收肝脏微粒酶部分，然后进行酶分析以检测芳香烃羟化酶或乙氧基试卤灵-正-脱乙基酶的诱导。
虽然在文献中生物检测法已经被广泛地应用，它们却没得到实际的商业应用。这种方法主要的不足是需要活的细胞或动物，使它们不适合于采用商业检测试剂盒的方式。此外，P450IA1的酶检测法不是很灵敏而且需要复杂的仪器设备。
由于存在上述与物理-化学分析和生物检测有关的问题，人们的注意力越来越集中于用体外检测法检测二噁英样化合物上。
在C．A．Bradfield等的“对2，3，7，8-四氯二苯并-对-二噁英及Ah受体相关配体的竞争结合检测”，分子药理学，34∶682-88(1988)中，将来自C57BL／6J小鼠肝细胞溶胶的硫酸铵级份与检测样品和放射性配体[I125]2-碘代-7，8-二溴二苯并-对-二噁英共同孵育。然后游离的配体经活性炭处理后去除，而结合放射活性的配体通过闪烁计数器进行测量。这种方法具有很多缺点，包括需要获得使用放射性同位素的批准，以及需要设备用来检测和处置这些具有放射活性的材料。另外，这种检测只能测量与毒性无关的结合。
在M．Vanderlaan等的“环境化学-用于筛选二噁英污染的环境样品的免疫检测的改进和应用”，环境毒理学和化学，vol．7，pp．859-70(1988)中，确定检测样品中二噁英样化合物的水平是通过单克隆抗体与二噁英样化合物自身结合的直接免疫检测。同时参见M．Vanderlaan，“环境科技评论综述-通过免疫检测进行环境监测”，环境科技，vol．22，no．3，pp．247-54(1988)。这种检测法并不是特别有用，因为它们不能区别结构可能相似的毒性和非毒性化学物质。
Gierthy的美国专利号4，904，595涉及一种上皮细胞系及其在体外生物检测二噁英样活性的应用。当暴露于二噁英时，与受致命剂量照射的3T3细胞共同培养的XBF细胞系被诱导发生形态改变，变为扁平鹅卵石样，而与之对照的未经二噁英处理的培养细胞处于纺锭状高密度状态。
Vanderlaan等的美国专利号4，798，807公开了与二噁英样化合物反应的单克隆抗体，以及使用这类抗体对这些化合物进行灵敏免疫检测的方法。这些抗体在竞争免疫检测中与二噁英样化合物识别并结合。
Albro等的美国专利号4，238，472公开了一种放射免疫检测方法，用于检测环境样品中的二噁英样化合物。这种方法包括一抗与含有二噁英的样品(经去污剂乳化)结合，这种一抗可与二噁英和由放射活性I125标记的二噁英结合，形成抗体-I125-二噁英复合物。这使得标记的和未标记的二噁英与抗体竞争结合。复合物随后与二抗反应形成含二噁英的沉淀，沉淀中的放射活性经分析并利用曲线确定样品中的二噁英含量。
另一种检测二噁英样化合物的方法是由M．M．Stantostefano等提出的，“配体结构对大鼠细胞溶胶芳香烃受体体外转化的影响”，生物化学和生物物理文献，vol．297，no．1，pp．73-79(1992)。如同其论文中图4所示，二噁英反应元件以及二噁英反应元件结合蛋白复合物的形成同应用凝胶移位分析中二噁英样化合物的浓度是相关的。尽管这种方法具有科学意义，但它不适合于商业形式。
纵观上述现有的检测二噁英样化合物的方法所存在的缺陷，仍然存在对适合商业、价廉而能准确检测有毒的二噁英样化合物的方法的需求。
发明概述本发明涉及一种检测方法，即通过Ah受体的转化检测测试样品中多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯及表现出此类化合物生物学活性特征的其结构类似物。该方法利用了由多种蛋白形成的异聚体，其中一种蛋白是处于无活性状态的Ah受体。检测样品在一定条件下与异聚体接触，以便使样品中的多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯等与Ah受体能有效地结合。这些配体与Ah受体的结合导致含有同配体结合的Ah受体的复合体从异聚体脱离，转化为活性状态。然后检测含有结合有配体的转化Ah受体的复合体的存在。
本发明的方法能通过任何一种已有的一些免疫检测试剂盒形式进行操作。一种适合的形式是固相俘获免疫检测试剂盒，它包括异聚体、一种带有能结合复合体区域的抗体和一种能检测出抗体的标记物，以及固体载体。还有一种适合的形式是竞争免疫检测试剂盒，它包括异聚体；一种结合物，其上带有的第一区段能与固体载体结合，第二区段能与复合体结合；一种类似物，带有能与结合物相结合的区段；一种能检测出类似物的标记物；以及一种固体载体。另一种适合的形式是夹心免疫检测试剂盒，它包括异聚体；一种结合物质，所具有的第一区段能与固体载体结合，第二区段能与复合体结合；一种抗体，所具有的一个区段能与带有可被检测的标记的复合体相结合；以及一种固体载体。
检测能直接在野外进行，而且除了在所检测的样品中可能存在的外，不会有任何环境污染物。样品能在同一天进行检测，许多空气、水或泥土样品的检测结果能就地获得报告。由于可以就地获得结果，所以允许立即对补救效果进行评估。
附图简述
图1为改进的固相俘获免疫检测试剂盒图示。
图2为蛋白印迹凝胶，显示出抗MAPS抗血清321对小鼠肝细胞溶胶蛋白的识别情况。第5-11道和13道记述了在不同抗血清稀释度下，对100k道尔顿大小无配体形式的Ah受体的抗血清识别。
图3为蛋白印迹凝胶，显示出抗MAPS抗血清377对小鼠肝细胞溶胶蛋白的识别情况。1、2和19道为经蛋白染色的蛋白标准，5和18道显示经蛋白染色的细胞溶胶，而12到15道描述对100k道尔顿大小无配体形式的受体的抗血清识别。
图4为蛋白印迹凝胶，证明对被TCDD转化的Ah受体的特异免疫检测。
图5A显示硝酸纤维素膜点杂交印迹，证明硝酸纤维素膜上TCDD-转化Ah受体的俘获和检测。
图5B为通过扫描图5A的点杂交印迹获得的TCDD密度对体积图。
图6显示TCDD的光密度对剂量图。
附图和发明详述本发明涉及一种检测方法，即检测测试样品中多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯及表现此类化合物生物学活性特征的其结构类似物。该方法利用了由多种蛋白形成的异聚体，其中一种蛋白为无活性状态的Ah受体。检测样品在一定条件下与异聚体接触，以便使样品中的多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯等与Ah受体有效地结合。这些配体与Ah受体的结合导致含有同配体结合的活性Ah受体的复合体从异聚体脱离。然后检测与配体结合的含有活性Ah受体的复合体的存在。
二噁英样化合物与Ah受体结合以及导致活性Ah受体与配体结合从而脱离的过程称为转化。无活性的Ah受体作为形成细胞溶胶高分子量异聚体的至少3种蛋白之一存在。尽管异聚体的精确成分和结构尚未知晓，但据信热休克蛋白90是另外一种组成蛋白。当配体与Ah受体结合后，Ah受体从复合体上脱离，然后经历构象变化形成异二聚体复合体，其对阳离子交换剂和双链DNA的亲和力增加。这种激活Ah受体的过程基本上是不可逆的。在活细胞中，结合有配体的被激活Ah受体进入细胞核中，可能与一些基因的细胞核调控序列结合。其中一种这样的序列已知为二噁英反应元件(″DRE″)，该元件同被激活的Ah受体间的相互作用据信可导致基因表达增强。尽管带有二噁英样化合物配体的Ah受体本身没有毒性，但是这种因与二噁英反应元件结合而引起的基因表达增强，据信是对二噁英样化合物产生毒性反应的基础。转化现象在G．P．Landers等的“综述文章-Ah受体和二噁英毒性的机理”，生物化学杂志，vol．26，pp．273-87(1991)和S．Safe的“多氯联苯(PCBs)，二苯并二噁英(PCDDs)，二苯并呋喃(PCDFs)和相关化合物支持毒性当量系数(TEF)发展的环境和机械考虑”，毒理学，vol．21，pp．51-87(1990)中有更多的详细讨论。
对于本发明，包含Ah受体的异聚体能通过任何一种来源获得。尽管异聚体在一些培养的人类组织和细胞中得到证实，它们包括肺、肝、肾、胎盘、B淋巴细胞和胸腺，然而更优选从其它易于获得的哺乳动物中得到。异聚体在啮齿动物的肝脏、胸腺、肺脏、肾脏、脑、睾丸和骨骼肌细胞中均存在。特别优选的异聚体来源是哺乳动物的肝细胞细胞溶胶部分。例如，异聚体可通过分离雄性Hartley豚鼠的肝细胞溶胶而获得，方法参照E．C．Henry等的“Ah受体多种形态的特点种属和组织比较”，生物化学，286430-40(1989)，并且在玻璃或塑料试管中按5毫升的等份进行冷冻或冻干。
本发明的方法用于对多种检测样品中二噁英样化合物的检测。这些检测样品可以是环境中分布的空气、水或者土壤。此外，该检测方法可以用于检测人或动物体液(例如血液)中的二噁英样化合物。
本检测方法希望以任何常规的检测试剂盒的形式实行。例如，免疫检测可以采用固相俘获、竞争或夹心免疫检测。
固相俘获免疫检测试剂盒包括异聚体、一种能与复合体结合并带有一种能被检测的标记物的抗体，以及固体载体。固体载体可作为检测试剂盒的一部分或与之分开出售。当采用本发明的检测方法时，异聚体与检测样品相接触。所产生的混合物与固体载体接触，以便复合体与载体结合。当除去未结合的材料后，抗体同已被结合的活化Ah受体接触。结果，抗体上面的标记就可以被检测出来。
本发明特别优选的形式是，异聚体和检测样品的混合物可与亲和基质接触，以便使复合体与亲和基质结合。当除去未结合的材料后，将复合体从亲和基质上洗脱出来，然后与固体载体接触并被吸收。经标记的抗体随后同被吸收的复合体接触以进行检测。亲和基质也可用于与复合体的结合，并因此在夹心和竞争形式中，将复合体与检测样品-异聚体混合物的残余物分开。在每种情况下，复合体可随后从亲和基质上洗脱，并且同固体载体进行接触吸收。
竞争免疫检测试剂盒包括异聚体；一种结合物，其上带有的第一区段能与固体载体结合，第二区段能与复合体结合；一种类似物，带有能与结合物的第二区段相结合的区段和一种能使类似物被检出的标记物；以及一种固体载体。当在本发明的检测方法中采用这种竞争免疫检测试剂盒形式时，结合物同固体载体接触以便前者与后者结合。然后，在导致类似物同检测样品和异聚体接触所形成的复合体进行竞争的条件下，类似物与结合物相接触而结合到结合物的第二区段上。通过这种竞争后，可进行检测步骤。在此，复合体的出现是通过分析被标记的类似物进行间接检测的。
夹心免疫试剂盒包括一种结合物，其上带有的第一区段能与固体载体结合，第二区段能与复合体结合；异聚体；一种抗体，带有能同含结合有配体的活性Ah受体的复合体相结合的区段和一种能使抗体被检出的标记物；以及一种固体载体。在使用中，结合物与固体载体相接触。当结合物同固体载体结合并且检测样品同异聚体结合后，检测样品和异聚体的混合物与固体载体相接触。其结果是复合体同结合物的第二区段接触。去除未结合的混合物后，标记抗体同已与固体载体结合的复合体相接触。结果，抗体上的标记能被检测出来。
在任何这些免疫检测试剂盒形式中所使用的固体载体，可以是这类试剂盒通常所用的任何水不溶性或悬浮于水的固体材料。合适的例子有聚合膜、塑料或玻璃珠、试管、或微量滴定板。复合体中的结合物，含有结合有配体的活性Ah受体，它可通过共价结合或吸收被固体载体结合。当使用试管或微量滴定板时，这些结合发生在这些载体的内壁上。
在竞争和夹心免疫检测试剂盒中，试剂盒可以组装成结合物已同固体载体结合的产品。通过将结合物同固体载体连接，并且维持此类连接足够的时间以便允许结合物上的第一区段结合到固体载体上，从而完成这类在固体载体表面的操作。一般，这类连接进行1-18个小时，优选4个小时。然后将未粘附的结合物与不可溶的结合物(即，结合到固体载体的结合物)分离，然后洗涤固体载体。
在所有这三种免疫检测试剂盒形式中，检测样品和异聚体以彼此间互相接触的方式放置，并且孵育足够的时间以允许转化。一般，这类转化进行2小时。这类接触之后让检测样品和异聚体的混合物同固体载体相接触较为理想。对于固相俘获检测，复合体直接同固体载体结合，而在竞争检测或夹心免疫检测中，复合体间接同固体载体结合(即，通过结合物)。对于本发明所有三类免疫检测试剂盒的形式来说，当有充足时间进行孵育后，残余的检测样品和异聚体混合物从同固体载体结合的不可溶材料上脱离。随后对不可溶的材料进行洗涤。
固相俘获的标记抗体或者竞争免疫检测试剂盒的标记类似物，在同结合于固体载体的不可溶材料接触后，充分孵育维持这种接触，以便被标记物间接结合到固体载体上。一般孵育1-18小时可充分结合，优选2小时。未结合的材料于是从不可溶的材料中分离，然后对不可溶的材料进行洗涤。
对于固相俘获、竞争和夹心免疫检测试剂盒的形式，需要标记的类似物或者抗体(依试剂盒而定)以检测类似物或抗体间接结合到固体载体的程度。这种检测优选包括标记材料的定量测定。对于固相俘获来说，标记抗体直接同复合体相结合，从而使检测步骤能直接确定所形成复合体的量。对于竞争免疫检测试剂盒来说，实际检测的标记类似物在没有复合体的位点是不溶性的。因此，所形成的复合体的量必需通过所检测的类似物的量间接地确定。标记物可以是与抗体或类似物结合的有色、荧光、化学发光、放射性或酶材料，或者是同第二结合物，例如结合有与复合体相互作用的结合物的抗体，结合的有色、荧光、化学发光、放射性或酶材料。
对于夹心和固相俘获免疫检测试剂盒，一种能结合到复合体的抗体被采用，该复合体含有结合有二噁英样化合物配体的活性Ah受体。抗体可以是多克隆或单克隆形式。
一个特别优选的获得检测抗体的方法是合成下列由小鼠Ah受体N-末端修饰后的肽序列氨基-Cys-Nor-Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Thr-Val-Lys-Pro-Ile-Pro-Ala-Glu-Gly-Ile-Lys-羧基SEQ．ID．NO．1注意Nor代表正亮氨酸。未纯化的肽通过使用顺丁烯二酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯与卵清蛋白偶联，产物中每摩尔卵清蛋白偶联有9到22摩尔肽。兔子随后使用0．5到1mg量的抗原每间隔两周进行免疫，8周后取血。从兔血中提取免疫血清。为了提纯抗Ah抗体，肽(SEQ．ID．NO．1)通过其末端半胱氨酸的巯基同碘乙酰胺衍生柱共价结合。抗Ah受体N末端的抗体通过用上面提到的柱子进行亲和层析而从血清中得到纯化。优选的抗体标记是商用抗兔IgG碱性磷酸酶共轭物。
对于竞争免疫检测，一种能同结合物第二区段相结合的带标记类似物得到采用。合适的类似物包括与碱性磷酸酶偶联的上述肽序列(即SEQ．ID．NO．1)。或者，类似物可以是一种抗原，具有相同免疫特性，并且在免疫学上和活化的Ah受体等价。参见Schuurs等的美国专利号Re 32，696，在此引作参考文献。
合成标记类似物的优选方法是，采用硫代琥珀酰亚胺4-(N-顺丁烯二酰甲基)环己烷-1-羧酸盐，在肽的巯基和碱性磷酸酶伯胺基之间将碱性磷酸酶与肽序列(SEQ．ID．NO．1)偶联。
在本领域中酶标记物为人熟知。这类标记物的实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖-6-磷酸、β-半乳糖苷酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶、尿素酶、葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶、β-葡糖醛酸酶以及β-B-葡萄糖苷酶。这些标记物可通过将底物转化为使用本领域众所周知的设备进行比色、荧光和分光光度测量所能测量的产物进行检测。这些仪器产生光密度值，通过与标准曲线的比较可以转换为二噁英样化合物的浓度。
或者，抗体或类似物能被直接标记。适宜的有色标记包括荧光、化学发光和比色。这类标记可用分光光度测定法或光密度分析法检测。这些仪器产生的光密度值通过与标准曲线的比较可以转换为二噁英样化合物的浓度。
适合抗体或类似物的荧光标记包括荧光素、若丹明及其衍生物。这类标记可为荧光测定法检测到。这些仪器产生的光密度值经过与标准曲线的比较可以转换为二噁英样化合物的浓度。
适合的化学发光标记包括鲁米诺、异鲁米诺、丫啶酯、硫酯、磺胺和菲啶酯。这类标记产生的光密度值通过与标准曲线的比较可以转换为二噁英样化合物的浓度。这类标记系统产生长效的发光。这种光可被光度计、光电倍增管和固态检测仪检测出来。
竞争和夹心免疫检测两者都使用结合物，它的第一区段能同固体载体结合，第二区段能同包含结合有二噁英样化合物配体的活性Ah受体的复合体相结合。结合物优选选自抗体、二噁英反应元件和二噁英反应元件的一部分。
当结合物为抗体形式时，这类抗体可以是多克隆或单克隆的。结合物可包括被固体载体吸收或共价连接的小牛胸腺DNA，或者是被固体载体吸收或共价连接的特殊DNA。
特别优选利用二噁英反应元件或其一部分形成结合物。不同种属细胞中二噁英反应元件的DNA序列已经得到了充分的研究。
在M．S．Dennison等的“大鼠肝细胞溶胶中转化的Ah受体R同二噁英反应转录增强子的相互作用的特性”生物化学与生物物理学文献，vol．284，pp．158-66(1991)中，以下的合成核苷序列被使用5’-GATCTGGCTCTTCTCACGCAACTCCG-3’ SEQ．ID．NO．25’-GATCCGGAGTTGCGTGAGAAGAGCCA-3’SEQ．ID．NO．3一旦被合成后，这些序列可退火形成双链DNA序列。
T．A．Gasiewicz在“加速交流-α-萘黄酮通过与Ah受体形成失活的复合体作为一种2，3，7，8-四氯二苯并-对-二噁英的拮抗剂”，分子药理学，40607-12(1991)中采用了下列的核苷序列5’-GATCCGGCTCTTCTCACGCAACTCCGAGCTCA-3’ SEQ．ID．NO．45’-GATCTGACTCGGAGTTGCGTGAGAAGAGCCG-3’ SEQ．ID．NO．5这些序列可退火形成Ah受体DNA结合形式的单核识别序列。采用通过下列核苷酸序列退火制备的DNA序列特别理想5’GATCCGGAGTTGCGTGAGAAGAGCCA-3’ SEQ．ID．NO．65’TGGCTCTTCTCACGCAACTCCGGATC-3’SEQ．ID．NO．7这两个序列都使用DNA合成仪制备，其中后者使用5伯氨基修饰的C6-TFA进行合成。这个接头在5’末端利用6碳间隔子提供伯胺。为了作进一步的化学修饰，这两个核苷序列用20mM(3-[N-吗啉代]丙磺酸缓冲液pH7．6加等摩尔量的1mM乙二胺四乙酸溶解，加热到90℃5分钟，冷却至37℃过夜杂交。杂交的二噁英-反应元件然后共价偶联到溴化氰活化的琼脂糖凝胶珠上。
其它的二噁英反应元件核苷酸序列在D．W．Nebert等的“小综述-哺乳动物细胞色素P1-450(CYP1A1)基因的调控”，国际生物化学杂志，vol．21，no．3，pp．243-52(1989)中被公开，在此引作参考文献。
在本发明的固相俘获免疫检测的一种特别优选的方式中，采用了如图1的装置。这种装置包括容器2，它带有许多小的聚丙烯柱子4。柱子4有开放的末端并且在其每根底部都安有亲和基质6。
在图1中也显示了固相俘获单元8。固相俘获单元8包含由诸如聚丙烯96孔平底板12组成的俘获膜容器1O，平底板每个孔底部有开口。组成俘获膜14的硝酸纤维素圆片粘合在这些孔上。带有真空岐管出口18的容器16被设计用于安置在俘获膜容器10的下部。
在应用时，含有包含未活化Ah受体的异聚体的细胞溶胶，与可能含有二噁英样化合物的检测样品混合。当混合物孵育几个小时后，被注入容器2中的每个柱子4中。流出物穿过柱子流到废物容器里(未显示)。
当亲和基质柱被检测样品和细胞溶胶的混合物处理后，放柱子4的架子2被放置在俘获膜容器8的上面，每个柱子4的底端都分别伸到板12的一个孔中，如图1所示。结合有二噁英样化合物配体的活性Ah受体随后被从亲和基质6上洗脱，并与俘获膜14相结合。多余的液体经真空岐管18从俘获膜14上抽走。标记的抗体于是能被加在俘获膜上，以便能检测带有二噁英样化合物配体的活性Ah受体的存在。
而且，亲和基质6可在本发明中的夹心和竞争免疫检测形式中应用。同上述在固相俘获形式中描述的内容基本一致，亲和基质同检测样品与异聚体形成的混合物接触，以便使复合体结合到基质上。结合后的复合体然后从基质上洗脱，与固体载体接触并被固体载体所吸收。
本发明的免疫检测具有许多潜在的用途。这种检测的其中一个用途是一步法确定毒性当量系数(″TEF″)。TEF用于度量Ah受体-依赖毒素的潜在毒性，并可被用于对这种化合物的危险和风险评估。该检测可被用于筛选抗雌激素药物，用于哺乳动物的肿瘤治疗。该检测还可被用于筛选潜在的天然或合成TCDD拮抗剂，它们可能具有作为抗促进剂或癌症预防的潜能。它可对药物或农用化学品中二噁英样毒性进行快速筛选。在基础研究中，该检测可作为研究人类细胞系中影响Ah受体转化的细胞事件的试验的终点，该试验是为了了解人类对二噁英样化合物的易感性。该检测能被用于确定人类或动物组织和细胞对TCDD与二噁英样化合物的暴露状况，人类Ah受体对TCDD和PCBs的反应，以及恶性细胞中Ah受体的水平。
实施例实施例1化学制品所有的化学制品均从商业途径购买，并且是所能获得的最高纯度。
抗原合成与抗血清生产多抗原肽合成(MAPS)如Poland等报道的以Ah受体的NH2末端部分为基础，分子药理学，vol．39，pp．20-26，(1990)。MAPS抗原包括人工合成的肽H2N-LYS-ARG-ARG-LYS-PRO-VAL-GLY-COOH，作为SEQ IDNO8，通过肽的羧基端结合到七赖氨酸分支上。肽与七赖氨酸的比例为8∶1。经氨基酸分析，抗原的纯度按重量为38％。抗原由TAES实验室，Entomology Department，Texas A&M University，College Station，TX77843依照合约合成。
粗抗原以2mg／ml的浓度溶于磷酸盐缓冲液中，并且按0．5ml的等份同等体积的弗氏完全佐剂(用于初次免疫接种)或弗氏不完全佐剂(用于后继免疫接种)混合。免疫接种包括对Flemish Giant／Chinchilla杂交兔进行1ml(380μg抗原)皮下注射。免疫接种程序如下在第0，21，35和49天注射，第63天采血。免疫接种和采血由Cornell动物资源研究部，Cornell University，Ithaca，NY 14853按合约实行。
血液在10℃凝固过夜，并且血清在IEC centra-7离心机中经2次2900 RPM 20分钟离心得到分离。以1ml的等份在-80℃冷冻备用。
小鼠肝细胞溶胶从雌性C57BL／6小鼠中制备。小鼠由Jackson实验室(Bar Harbor，ME)获得。实验使用4到6周龄、体重大约16到20克的雌性小鼠进行。小鼠以Prolab RMH 1000大鼠、小鼠、仓鼠食物(Agway，Cortland，NY)喂养并随意接受管道供水。所有小鼠每个笼子放养3到5只而且维持12小时的光照周期。小鼠被处死后肝脏灌注含1．15％KCL的MENG缓冲液。肝细胞溶胶部分通过在3倍体积的MENG缓冲液(Poland等，分子药理学，vol．39，20-26(1990)，在此引作参考文献)中将肝脏匀浆进行制备。随后9000xg离心20分钟，上清(S-9)在100，000xg离心60分钟，所产生细胞溶胶部分仔细移出然后迅速放于-80℃冻存。
免疫印迹十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法依照Laemmli，U．K．，1970，嗜菌体T4头部装配时结构蛋白的切割，自然227680-685。溶解蛋白转移到聚二氟乙烯膜是依照(Towbin等，1979，蛋白从聚丙烯酰胺凝胶到硝酸纤维素试纸的电泳转移方法与一些应用。美国国家科学院院刊764350-4354)。对聚二氟乙烯膜上抗原蛋白的免疫检测是依据Poland等．(1990)。
结果在图2中1-3道和20-22道代表经蛋白染色的蛋白标准。标准(从上到下)为116、97．4、66和45k道尔顿。4和19道为染色前的蛋白标准，从上到下分别为205，116．5，80和49．5k道尔顿。细胞溶胶总蛋白染色显示在5和18道。所有其它的道为抗血清进行的免疫染色。
使用以下抗血清(经稀释)。抗-MAPS 321-1(1∶1)在6和7道，抗-热休克蛋白90(HSP90，Source)(1∶500)在8道，抗-MAPS 321-2(1∶11)在10和11道，抗-MAPS 321-2(1∶50)在12和13道，抗-MAPS 321-2(1∶250)在14和15道，抗-MAPS 321-2(1∶1000)在16和17道。结果显示，第二次采血的兔321产生的抗体能在1∶50滴度时识别100k道尔顿的未转化状态的Ah受体。
图3中1、2和19道代表经蛋白染色的蛋白标准。所代表的分子量为116、97．4、66和45k道尔顿。在3和18道染色前的标准代表的分子量为205、116．5、80和49．5k道尔顿。经蛋白染色的细胞溶胶在4和17道。所有其它道为抗血清的免疫染色。使用以下抗血清(经稀释)抗-MAPS 377-2(1∶250)在6和8道，抗-MAPS 377-2(1∶50)在9和10道，抗-MAPS 377-2(1∶11)在11和16道，抗-MAPS 377-1(1∶11)在13道，以及抗-HSP90(1∶500)在14和15道。这些结果表明，在第二次采血时，兔377产生的抗体能在1∶250滴度时识别100k道尔顿未转化状态的Ah受体。
抗血清321-2和377-2针对Ah受体N末端的氨基酸序列，它们都能识别同TCDD或二噁英样化合物相互作用前所存在的Ah受体。通过对空气、水或土壤环境提取物中所存在的未转化Ah受体进行定量分析，这类抗血清能被于检测二噁英样化合物。定量可通过以前所描述的方法采用ELISA技术完成。
实施例2本实施例参见图1。
抗-043多克隆抗血清是通过SEQ．ID．NO．1的肽经顺丁烯二酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯与卵清蛋白偶联，产物中载体上偶联有9到22摩尔肽，然后接种兔子进行制备。兔子用0．5到1mg抗原，以每两周间隔进行接种，8周后采血。免疫血清从兔血中获得，并在经SEQ．ID．NO．1的肽同碘乙酰胺衍生凝胶珠结合形成的亲和柱上得到纯化。
二噁英反应元件(DREs)通过寡核苷酸SEQ．ID．NO．6(166nmoles)与5’末端含有N-TFA-C6接头的序列7杂交产生。这些寡核苷酸溶于20mM(3-[N-吗啉代]丙磺酸缓冲液pH7．6加1mM乙二胺四乙酸中，加热至90℃5分钟，然后冷却至37℃过夜杂交。杂交产生的二噁英反应元件于是按照下面的方法同溴化氰活化的琼脂糖凝胶珠共价结合。干珠子(1．14克)置于连接于真空吸出器的闪烁玻璃管道中。这些珠子随后经洗涤而膨胀，洗涤时依次使用冰冷的250ml 1mM HCL，冷的300ml去离子水，以及冷的40ml 10mM磷酸钾缓冲液pH8．0。载有DREs的珠子然后在室温下轻柔振荡孵育16小时。这些珠子随后用200ml水和100ml1M乙醇胺pH8洗涤，重新悬浮于5．6ml乙醇胺缓冲液中，室温振荡孵育6小时。珠子接着用100ml水、100ml 10mM磷酸钾缓冲液pH8．0、100ml1M磷酸钾pH8．0，100ml 1M KCl以及100ml 10mM含0．3M NaCl、1mM乙二胺四乙酸、0．02％叠氮化钠的Tris(羟甲基)氨基甲烷-HCl(pH7．6)进行洗涤。所产生的亲和基质在10ml注射器筒中形成两个2．4ml柱床体积的开放柱，并且在4℃保存。
雄性Hartley豚鼠(300-350克)获自Charles River。肝脏用冰冷的含有1．15％KCl的HEDG缓冲液(25mM N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸]，1．5mM乙二胺四乙酸，1．0mM二硫苏糖醇，pH7．6)灌注，并且用5倍体积(重量／体积)的HEDG缓冲液在冰上匀浆。肝脏被匀浆，然后提取物12，500xg离心20分钟。接着上清以100，000xg再次离心60分钟，然后将上清(肝细胞溶胶)在-80℃冷冻。
来自豚鼠的细胞溶胶(5ml)用5μl含有10μM的2，3，7，8-四氯二苯并-对-二噁英(TCDD)的二甲基亚砜(终浓度=10nM)或5μl二甲基亚砜处理，在室温下孵育2小时。细胞溶胶接着用500μl含活性炭(10％)／右旋糖苷(1％)的HEDG缓冲液在冰上孵育15分钟，以去除未结合的TCDD。活性炭／右旋糖苷通过将细胞溶胶穿过0．45μm聚砜滤膜得到滤除。过滤后的细胞溶胶接着穿过亲和基质柱，随后是2x4ml HEDG、2x4ml HEDG加350mM NaCl以及2x4ml HEDG加600mM NaCl。最后的洗涤物被收集，同时分别添加含有800μg牛血清蛋白的800μl水，随后是8．8ml 20％的冰冷三氯乙酸。蛋白在冰上沉淀30分钟，然后在临床离心机上离心30分钟。弃去上清，将沉淀溶于100μl 1M TRIS pH8．0、400μl水和500μl2x样品缓冲液中(5mM Tris，0．05％溴酚蓝，2％巯基乙醇，2％十二烷基硫酸钠，10％甘油，pH6．8)。被溶解的蛋白通过煮沸5分钟进行变性，每100μl经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Laemmli，1970)并依据Towbin等(1979)在聚二氟乙烯膜上进行印迹分析。蛋白标准跑相邻的泳道。含有蛋白标准的泳道用含0．1％酰胺黑10B的7％醋酸染色，然后用7％的醋酸脱色。含有柱子洗脱液的泳道在封闭缓冲液(含5％脱脂奶粉的TBST(50mM TRIS，150mM NaCl，0．02％吐温20，pH7．5))中孵育。孵育条件为50ml和1小时。印迹然后用40ml抗043抗血清(在封闭缓冲液中占0．1％)进行探针检测1小时。接着在100ml TBST中洗3遍，每次5分钟，然后同40ml含0．1％抗兔IgG／碱性磷酸酶共轭物的封闭缓冲液孵育一小时，用100ml TBST洗2次，每次5分钟，用100ml无吐温20的TBST洗一次，5分钟，并用碱性磷酸酶显影缓冲液(5．5克Trizma碱，0．8克Trizma-HCL，2．9克NaCl，5．1克MgCl2-6H2O)短暂冲洗。印迹用含3．3mg 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸和6．6mg氮蓝四唑的20ml碱性磷酸酶显影缓冲液显影5分钟，用水洗涤数遍，然后进行干燥。
在图4中，A道加载来自溶剂处理后的细胞溶胶的亲和基质洗脱液。B道加载10nM TCDD处理后的细胞溶胶的亲和基质洗脱液。C道加载分子量标准，在垂直栏中标为kD。
其结果如图4所示，证明抗043抗血清检测出柱洗脱液中一条单独的蛋白带。该蛋白的出现依赖于TCDD，因为它在TCDD处理的样品中出现，而在溶剂处理的样品中不出现。所估计的分子量(大约105kD)与豚鼠Ah受体相同。它同二噁英反应元件结合，如同对转化的Ah受体所预测的那样。它可被所制备的哺乳动物Ah受体中特殊保守序列的抗血清所识别。因此，这些结果证明，用二噁英样化合物处理细胞溶胶，然后分离并对转化的Ah受体进行免疫检测，能够检测二噁英样化合物的存在。进一步，对单条TCDD反应带的免疫检测提示，该方法对检测转化的Ah受体是特异的，并且能改进为简单的免疫检测试剂盒，而不需要分辨无关的免疫反应蛋白。
实施例3本实施例参见图5。除以下改变外，在方法学上与实施例2相同。来自亲和基质的8ml等份的(每份2ml，TCDD和溶剂处理的样品)、600mMNaCl洗脱液用0．5ml甲醇稀释。平行的0，50，100，200或400μl样品在硝酸纤维素膜上点印迹，并用真空管使液体穿过膜。该膜随后用抗043抗血清进行探针检测，然后依照实施例2进行显影。膜随后被Microtek 600ZS型扫描仪以300dpi、亮度-18％和对比度0％的条件扫描。光密度测量是在Macintosh Iisi计算机上使用BioSoft，Cambridge，United Kingdom的Scan Analysis 2．21软件进行。
在图5中，所给体积与原始细胞溶胶制品体积相同。(-)溶剂处理细胞溶胶，(+)10nM TCDD处理细胞溶胶。图5A表示硝酸纤维素膜经染色显示出转化的Ah受体。图5B为通过扫描图5A的点印迹获得的平均密度数值。网格柱溶剂对照。实心柱10nM TCDD处理。
结果表明，硝酸纤维素有效地俘获转化的Ah受体，并且背景低。增加TCDD处理样品的体积产生可被肉眼看到的增强显色，而增加溶剂处理样品的体积没有显示出或显示出极小的染色。在50到200μl上样量的范围内，可以看到很好的敏感性和线性俘获。这些结果表明，应用硝酸纤维素作固体载体，并用真空管使样品穿透膜，这种固相俘获检测形式是可行的。此外，该方法快速并容易显现出膜上的不溶性持久显色，这提示它不需要分光光度设备，对于现场快速半定量检测是一种适合的方式。
实施例4本实施例参见图6。除以下改变外，在方法学上与实施例2相同。亲和基质柱依照实施例2所描述的方法制备，但是在1ml结核菌素注射器筒中是形成多个100μl柱床体积的柱子。细胞溶胶(500μl)转化使用不同的量(0，0．016，0．08，0．4，2，10nM；分别对应于0，13，64，320，1600pg的TCDD)。当样品加载到小柱子中后，用2x160μlHEDG、2x160μlHEDG加350mM NaCl以及2x160μl HEDG加600mM NaCl进行洗涤。收集最后的洗涤物，加入32μg牛血清白蛋白和350μl 20％的三氯乙酸，蛋白沉淀经分离并用前述的SDS-PAGE和印迹法分析。印迹按以前的方法进行探针检测，直到最后一步检测。此时，Ah受体位置的条带由印迹处切离，放在检测试管中。另外，同样的对照条带也被切下(只加载样品缓冲液的道)。对每个条带，加入300μl含1mg／ml对硝基苯磷酸的二乙醇胺缓冲液(1mM MgCl2-6H2O，50mM二乙醇胺，0．02％NaN3，pH9．8)，均在室温孵育1小时。有色溶液随后吸入96孔ELISA板中，在405nm波长读取O．D值。数据减去对照值。
图6显示TCDD的剂量效应。误差棒代表标准差(除了13pg处理的样品为n=2外，所有的样品均为n=3)。
结果指出，1)小体积的细胞溶胶和小的亲和基质柱子可以用于检测，2)可溶的碱性磷酸酶对硝基苯磷酸能够用于检测，以便定量检测反应能够利用ELISA读数仪实行。此外，本实验的检测极限为0．08nM或13pg，此处检测反应已经饱和超出。
实施例5除了每个样品所处理细胞溶胶的体积从500μl增加到800μl，并且TCDD的剂量范围采用0，0．0032，0．016，0．08，0．4和2nM，在方法学上与实施例3相同。显示不同TCDD浓度的光密度的结果数据列于下表1。
表1nM TCDDO．D．@405nmx10002．0 214±52．1 *0．4 156±69．5 *0．08 166±84．1 *0．016 132±45．2 *0．0032 54±25．10-53±79．6*同0nM剂量存在显著差异，双尾t检验@p=0．05，n=3结果显示，与实施例3相似，该反应基本上在0．08和2nM之间饱和。然而，增加细胞溶胶的量可以检测到0．016nM或5pg的TCDD。
虽然为阐述本发明本文已作了详细介绍，但应当理解这种细节仅为介绍目的，本领域的技术人员可在不背离本发明的精神和范围的前提下对其加以变通，本发明的范围由所附权利要求书限定。
序列表
(1)一般资料(i)申请人Cornell Research Foundation，Inc．(ii)发明名称被二噁英样化合物转化的Ah受体的免疫测定(iii)序列数目8(iv)通信地址(A)收件人Nixon，Hargrave，Devans&Doyle LLP(B)街道Clinton Square，P．O．Box 1051(C)城市Rochester(D)州New York(E)国家U．S．A．(E)邮编14603(v)计算机可读形式(A)载体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS／MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1．0，Version #1．25(vi)当前申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)律师／代理人资料(A)姓名Goldman Mr．，Michael L．(B)登记号30，727(C)参考／摘要号19603／00013(ix)电讯资料(A)电话(716)263-1304(B)传真(716)-263-1600(2)SEQ ID NO1资料(i)序列特性(A)长度22氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构未知(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Cys Xaa Arg Lys Arg Arg Lys Pro Val Gly Lys Thr Val Lys Pro1 5 10 15Ile Pro Ala Glu Gly Ile Lys20(2)SEQ ID NO2资料(i)序列特性(A)长度26碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构未知(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO2GATCTGGCTC TTCTCACGCA ACTCCG 26(2)SEQ ID NO3资料(i)序列特性(A)长度26碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构未知(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO3GATCCGGAGT TGCGTGAGAA GAGCCA 26(2)SEQ ID NO4资料(i)序列特性(A)长度32碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构未知(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO4GATCCGGCTC TTCTCACGCA ACTCCGAGCT CA 32(2)SEQ ID NO5资料(i)序列特性(A)长度31碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构未知(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO5GATCTGACTC GGAGTTGCGT GAGAAGAGCC G 31(2)SEQ ID NO6资料(i)序列特性(A)长度26碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构未知(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO6GATCCGGAGT TGCGTGAGAA GAGCCA26(2)SEQ ID NO7资料(i)序列特性(A)长度26碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构未知(ii)分子类型DNA(基因组)(xi)序列描述SEQ ID NO7TGGCTCTTCT CACGCAACTC CGGATC 26(2)SEQ ID NO8资料(i)序列特性(A)长度7氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构未知(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Lys Arg Arg Lys Pro Val Gly1权利要求
1．一种用于检测测试样品中的多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯及能表现多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃和多氯联苯生物学活性特征的其结构类似物的方法，包括提供一种由多种蛋白形成的异聚体，其中一种蛋白为无活性状态的Ah受体；检测样品在一定条件下与异聚体接触，使样品中的多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯及能表现多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃和多氯联苯生物学活性特征的其结构类似物作为配体与Ah受体有效地结合，从而导致含有同配体结合的活性Ah受体的复合体从异聚体脱离；并且检测所出现的含有同配体结合的活性Ah受体的复合体。
2．根据权利要求1的方法，其中异聚体为固相俘获免疫检测试剂盒的一部分，该试剂盒包括一种固体载体；所述异聚体，其中从所述的异聚体脱离的含有同配体结合的活性Ah受体的复合体能够结合到所述的固体载体上；以及一种带有能结合复合体的区段的抗体，其中所述的抗体带有一种能在所述检测中检测出所述抗体的标记物，其中所述的方法进一步包括使复合体同所述的固体载体相接触，借此复合体结合到所述固体载体上，并且将所述抗体同与所述固体载体结合的复合体相接触。
3．根据权利要求1的方法，其中异聚体为竞争免疫检测试剂盒的一部分，该试剂盒包括一种固体载体；一种结合物，其上带有的第一区段能与所述固体载体结合，第二区段能与含有同配体结合的活性Ah受体的复合体相结合；所述异聚体；以及一种类似物，所带的一个区段能同所述结合物的第二区段相结合，其中所述类似物带有一种能在所述检测中检测出所述类似物的标记物，其中所述方法进一步包括使所述结合物同所述的固体载体相接触，借此所述结合物结合到所述固体载体上，并且在导致所述类似物与复合体竞争从而结合到结合物的第二区段的条件下，将所述类似物同与所述固体载体结合的所述结合物相接触，其中所述检测在所述类似物与所述结合物结合后进行。
4．根据权利要求1的方法，其中异聚体为夹心免疫检测试剂盒的一部分，该试剂盒包括一种固体载体；一种结合物，其上带有的第一区段能与所述固体载体结合，第二区段能与含有同配体结合的活性Ah受体的复合体相结合；所述异聚体；以及一种抗体，所带的一个区段能与包含结合有配体的活性Ah受体的复合体相结合，其中所述的抗体带有一种能在所述检测中检测出所述抗体的标记物，其中所述方法进一步包括使所述结合物同所述的固体载体相接触，借此所述结合物结合到所述固体载体上，使复合体与同所述固体载体结合的所述结合物相接触，并且在进行所述检测前，使所述抗体同结合到结合物第二区段的复合体相接触。
5．根据权利要求4的方法，其中所述结合物为一种抗体。
6．根据权利要求4的方法，其中所述结合物为二噁英反应元件或其一部分。
7．根据权利要求1的方法，其中所述检测提供对复合体的定量测量。
8．根据权利要求1的方法，其中检测样品为一种选自空气、水和土壤的环境基质。
9．根据权利要求1的方法，其中复合体由结合有配体的活性Ah受体组成。
10．根据权利要求1的方法，其中异聚体存在于哺乳动物肝细胞的细胞溶胶部分。
11．一种夹心免疫检测试剂盒，用于检测测试样品中的多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯及能表现多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃和多氯联苯生物学活性特征的其结构类似物，包括一种结合物，具有能结合固体载体的第一区段和能结合复合体的第二区段，该复合体所含的活性Ah受体结合有选自多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯或者能表现多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃和多氯联苯生物学活性特征的其结构类似物的配体；一种由多种蛋白形成的异聚体，其中一种蛋白为无活性状态的Ah受体，其中所述的异聚体同含有选自多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯及能表现多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃和多氯联苯生物学活性特征的其结构类似物的配体的检测样品接触时，经过转化，借此配体与Ah受体结合，导致含有结合有配体的活性Ah受体的复合体从异聚体脱离；以及一种抗体，其一个区段能同包含结合有配体的活性Ah受体的复合体相结合，其中所述的抗体带有一种能检测出所述抗体的标记物。
12．根据权利要求11的夹心免疫检测试剂盒，其中所述的结合物是一种抗体。
13．根据权利要求11的夹心免疫检测试剂盒，其中所述的结合物为二噁英反应元件或其一部分。
14．根据权利要求13的夹心免疫检测试剂盒，其中所述二噁英反应元件通过将下列核苷酸序列退火而制备5’GATCCGGAGTTGCGTGAGAAGAGCCA-3’ SEQ．ID．NO．65’TGGCTCTTCTCACGCAACTCCGGATC-3’ SEQ．ID．NO．7
15．根据权利要求11的夹心免疫检测试剂盒，其中复合体由结合有配体的活性Ah受体组成。
16．根据权利要求11的夹心免疫检测试剂盒，其中异聚体存在于哺乳动物肝细胞的细胞溶胶部分。
17．根据权利要求11的夹心免疫检测试剂盒，其中标记物为与所述抗体结合的有色、荧光、化学发光、放射性或酶材料。
18．根据权利要求11的夹心免疫检测试剂盒，进一步包括一种固体载体。
19．根据权利要求18的夹心免疫检测试剂盒，其中所述的结合物与所述固体载体结合。
20．一种竞争免疫检测试剂盒，用于检测测试样品中的多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯及能表现多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃和多氯联苯生物学活性特征的其结构类似物，包括一种结合物，具有能结合固体载体的第一区段和能结合复合体的第二区段，该复合体所含的活性Ah受体结合有选自多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯或者能表现多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃和多氯联苯生物学活性特征的结构类似物的配体；一种由多种蛋白形成的异聚体，其中一种蛋白为无活性状态的Ah受体，其中所述的异聚体在与含有选自多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯及能表现多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃和多氯联苯生物学活性特征的其结构类似物的配体的检测样品接触时，经过转化，借此配体与Ah受体结合，导致含有结合有配体的活性Ah受体的复合体从异聚体脱离；以及一种类似物，其一个区段能同所述的结合物相结合，其中所述的类似物带有一种能检测出所述类似物的标记物。
21．根据权利要求20的竞争免疫检测试剂盒，其中异聚体存在于哺乳动物肝细胞的细胞溶胶部分。
22．根据权利要求20的竞争免疫检测试剂盒，其中复合体由结合有配体的活性Ah受体组成。
23．根据权利要求20的竞争免疫检测试剂盒，其中标记物为与所述抗体结合的有色、荧光、化学发光、放射性或酶材料。
24．根据权利要求20的竞争免疫检测试剂盒，进一步包括一种固体载体。
25．根据权利要求24的竞争免疫检测试剂盒，其中所述结合物同所述固体载体相结合。
26．根据权利要求20的竞争免疫检测试剂盒，其中所述结合物选自一种抗体、一种二噁英反应元件和二噁英反应元件的一部分。
27．根据权利要求26的竞争免疫检测试剂盒，其中所述二噁英反应元件通过将下述核苷酸序列退火而制备5’GATCCGGAGTTGCGTGAGAAGAGCCA-3’SEQ．ID．NO．65’TGGCTCTTCTCACGCAACTCCGGATC-3’SEQ．ID．NO．7
28．一种固相俘获免疫检测试剂盒，用于检测测试样品中的多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯及能表现多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃和多氯联苯生物学活性特征的其结构类似物，包括一种由多种蛋白形成的异聚体，其中一种蛋白为无活性状态的Ah受体，其中所述的异聚体在与含有选自多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯及能表现多氯二苯并二噁英、多氯二苯并呋喃和多氯联苯生物学活性特征的其结构类似物的配体的检测样品接触时，经过转化，借此配体与Ah受体结合，导致含有结合有配体的活性Ah受体的复合体从异聚体脱离，其中复合体能结合到固体载体上；以及一种抗体，它的一个区段能同复合体相结合，其中所述抗体带有一种能检测出所述抗体的标记物。
29．根据权利要求28的固相俘获免疫检测试剂盒，其中异聚体存在于哺乳动物肝细胞的细胞溶胶部分。
30．根据权利要求28的固相俘获免疫检测试剂盒，其中复合体由结合有配体的活性Ah受体组成。
31．根据权利要求28的固相俘获免疫检测试剂盒，其中标记物为与所述抗体结合的有色、荧光、化学发光、放射性或酶材料。
32．根据权利要求28的固相俘获免疫检测试剂盒，进一步包括一种固体载体。
33．根据权利要求32的固相俘获免疫检测试剂盒，进一步包括一种多孔平板，每个孔底都有所述固体载体，其中所述固体载体是渗透性的膜。
34．根据权利要求33的固相俘获免疫检测试剂盒，进一步包括多个亲和柱，带有开放的端口，并且每根柱子在端口之间都具有由一种结合材料构成的亲和层，其中柱子的安放使其一端位于所述平板的一个孔中，从而使由亲和层洗脱的物质进入孔中。
全文摘要
本发明涉及一种在检测样品中检测出二噁英样化合物的方法。检测样品与一种由多种蛋白形成的异聚体接触,其中一种蛋白是活性Ah受体。如果检测样品中存在二噁英样化合物,它们将与Ah受体结合,导致后者脱离异聚体,形成含有活性Ah受体与二噁英样化合物配体结合的复合体。然后检测复合体的存在。本发明的方法可通过利用固相俘获、竞争和夹心免疫检测试剂盒的形式进行。
文档编号G01N33/538GK1205035SQ95198008
公开日1999年1月13日 申请日期1995年10月31日 优先权日1995年10月31日
发明者G·D·维罗克, J·G·巴比斯 申请人:康乃尔研究基金会有限公司