干预IGF-I受体基因转录抑制肝癌细胞增殖的shRNA及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种干预IGF-I受体基因转录抑制肝癌细胞增殖的shRNA，包括以下三条shRNA模板序列IGF-IR-shRNA2、IGF-IR-shRNA3、IGF-IR-shRNA4中的任一条或一条以上。上述的shRNA能够高效抑制IGF-IR基因转录，从而抑制肝癌细胞增殖，能够对靶向或抗癌药物治疗具有增敏作用。本发明的shRNA能够应用于制备抗肝癌的药物，具有很大的应用前景和经济价值。
【专利说明】干预IGF-1受体基因转录抑制肝癌细胞增殖的shRNA及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学与生物医药领域，特别涉及一种干预IGF-1受体基因转录抑制肝癌细胞增殖的shRNA及其应用。
【背景技术】
[0002]肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，每年有超过60万的新增肝癌患者，位列肿瘤相关死因的第三位。HCC的发生发展是多病因、多基因、多步骤及多因子协同的复杂过程，涉及到癌基因激活，抑癌基因失活及(或)胚胎期某些癌基因重新复活等多信号通路和基因调控。目前，手术切除或肝移植仍为治疗首选方法，而索拉非尼是唯一能够有效提高患者生存率的药物，但对于索拉非尼治疗无效，多数肝癌患者确诊时已经错过手术最佳时期，现在尚无有效治疗方法，因此，寻求新的有效治疗进展期HCC的方法已成为探讨前沿。
[0003]膜岛素样生长因子轴(Insulin-likegrowth factor axis, IGFs)被认为与 HCC的发生发展密切相关，尤其是IGFs中的重要成员IGF-1受体(IGF-1R)所介导的信号转导通路至关重要。肝细胞恶性转变和癌变过程中IGF-1R异常活化，过表达的IGF-1R既可作为肝癌早期诊断的标志，又可作为肝癌靶向治疗的新靶点，具有开发与应用前景。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种具有开发与应用前景、有效干预IGF-1受体基因转录抑制肝癌细胞增殖的shRNA及其应用。
[0005]为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种干预IGF-1受体基因转录抑制肝癌细胞增殖的shRNA，包括以下三条shRNA模板序列中的任一条或一条以上:
[0006]IGF-1R-shRNA2:
[0007]正义链
[0008]5’ -CACCGCGTGAGAGGATTGAGTTTCTTTCAAGAGAAGAAACTCAATCCTCTCACGCTTTTTTG-3’，
[0009]反义链
[0010]5， -GATCCAAAAAAGCGTGAGAGGATTGAGTTTCTTCTCTTGAAAGAAACTCAATCCTCTCACGC-3，；
[0011]IGF-1R-shRNA3:
[0012]正义链
[0013]5， -CACCGCAAAGTCTTTGAGAATTTCCTTCAAGAGAGGAAATTCTCAAAGACTTTGCTTTTTTG-3，，
[0014]反义链
[0015]5’ -GATCCAAAAAAGCAAAGTCTTTGAGAATTTCCTCTCTTGAAGGAAATTCTCAAAGACTTTGC-3’ ；
[0016]IGF-1R-shRNA4: [0017]正义链
[0018]5， -CACCGGACAGATCCTGTGTTCTTCTTTCAAGAGAAGAAGAACACAGGATCTGTCCTTTTTTG-3，，[0019]反义链
[0020]5’ -GATCCAAAAAAGGACAGATCCTGTGTTCTTCTTCTCTTGAAAGAAGAACACAGGATCTGTCC-3’。
[0021]上述干预IGF-1受体基因转录抑制肝癌细胞增殖的shRNA用于制备抗肝癌的药物。
[0022]本发明的shRNA 按照 Genbank 中人 IGF-1R Gene ID (3480),用 Ambion 公司 shRNA设计系统软件设计4条靶向IGF-1R的shRNA，由上海吉玛制药技术有限公司利用Ambion公司特定shRNA设计软件设计并合成。将四条寡核苷酸链退火形成双链的shRNA模板。通过分析得到:上述的shRNA模板能够高效抑制人HCC Bel-7404、PLC/PRF/5细胞株IGF-1R基因转录，及IGF-1R蛋白表达；用CCK-8法分析得出上述的shRNA能够明显抑制肝癌细胞增殖，对靶向或抗癌药物治疗具有增敏作用；通过流式细胞仪检测得出上述shRNA4干扰人肝癌Bel-7404及PLC/PRF/5细胞IGF-1R表达后通过促凋亡机制抑制肝癌细胞增殖，癌细胞发生的凋亡数明显高于对照组及阴性组；通过细胞周期分析，上述shRNA使癌细胞发生G0/G1期阻滞以及抑制细胞周期中重要蛋白CyclinDl的表达；通过裸鼠体内实验得出上述shRNA干预IGF-1R基因的转录可显著抑制肝癌的生长。
[0023]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0024]1、本发明的干预IGF-1受体基因转录抑制肝癌细胞增殖的shRNA能高效抑制IGF-1受体基因的表达，能够对靶向或抗癌药物治疗具有增敏作用。
[0025]2、本发明的干预IGF-1受体基因转录抑制肝癌细胞增殖的shRNA能有效抑制肝癌细胞的增殖。
[0026]3、本发明的shRNA序列对于开发新的抗肝癌药物和提高肝癌的治疗效果有重要的意义，其具有很大的开发与应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为本发明一实施方式的步骤(3)中将重组干扰质粒成功转染至人肝癌Bel-7404细胞和PLC/PRF/5细胞的显微镜视图；
[0028]图2为步骤(5)~(7)中重组干扰质粒对人肝癌Bel-7404及PLC/PRF/5细胞中IGF-1R的抑制效果图；
[0029]图3为步骤(8)中IGF-1R_shRNA4抑制细胞增殖、增加靶向或化疗药物敏感性的效果图；
[0030]图4为步骤(9)中Annexin V-PE/7-AAD双染流式细胞仪检测细胞的凋亡图；
[0031]图5为步骤(10)中IGF-1R_shRNA4转染人肝癌细胞后，对癌细胞增殖周期的影响以及对细胞周期中重要蛋白CyclinDl表达的影响；
[0032]图6为步骤(11)中移植瘤形成时间及下调IGF-1R蛋白抑制裸鼠肝癌生长曲线；
[0033]图7为步骤(11)中裸鼠移植瘤实体、及移植瘤病理组织学检查和IGF-1R免疫组织化学证实的结果图。
【具体实施方式】
[0034]下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。[0035]下述内容为本发明的干预IGF-1受体基因转录抑制肝癌细胞增殖的shRNA的设计及验证步骤。
[0036](I)干扰序列设计
[0037]按照Genbank 中人 IGF-1R Gene ID (3480)，用 Ambion 公司 shRNA 设计系统软件设计4条靶向IGF-1R的shRNA，由上海吉玛制药技术有限公司利用Ambion公司特定shRNA设计软件(design2.0)设计并合成。将四条寡核苷酸链(如表1所示)分别溶解于浓度为IOOyM的TE缓冲液(ρΗ=8.0)，取IOX shDNA退火溶液(由上海吉玛制药技术有限公司提供)5 μ L，正链寡核苷酸(表1，IOOnM) 5 μ L，反链寡核苷酸(表1，IOOnM) 5 μ L，双蒸水定容至50 μ L得到退火反应体系。加热至95°C、5min，产物为10 μ M的shRNA，得到的shRNA4°C保存。另将所得shRNA溶液稀释500倍用于连接反应，终浓度为20nM。将阴性对照shRNA(表1中来自线虫的正、反寡核苷酸序列作为Negative-shRNA)插入质粒载体(pGPU/GFP/Neo)得到阴性重组质粒，将四种shRNA分别插入同样的质粒载体得到重组干扰质粒。四条寡核苷酸链及阴性对照shRNA的序列见表1。
[0038]表1 IGF-1R shRNA模板序列及阴性对照shRNA序列
[0039]
【权利要求】
1.干预IGF-1受体基因转录抑制肝癌细胞增殖的shRNA，其特征在于，包括以下三条shRNA模板序列中的任一条或一条以上:
IGF-1R-shRNA2: 正义链
5，-CACCGCGTGAGAGGATTGAGTTTCTTTCAAGAGAAGAAACTCAATCCTCTCACGCTTTTTTG-3，,
反义链
5，-GATCCAAAAAAGCGTGAGAGGATTGAGTTTCTTCTCTTGAAAGAAACTCAATCCTCTCACGC-3，；
IGF-1R-shRNA3: 正义链
5，-CACCGCAAAGTCTTTGAGAATTTCCTTCAAGAGAGGAAATTCTCAAAGACTTTGCTTTTTTG-3，,
反义链
5，-GATCCAAAAAAGCAAAGTCTTTGAGAATTTCCTCTCTTGAAGGAAATTCTCAAAGACTTTGC-3，；
IGF-1R-shRNA4: 正义链
5， -CACCGGACAGATCCTGTGTTCTTCTTTCAAGAGAAGAAGAACACAGGATCTGTCCTTTTTTG-3，,
反义链
5，-GATCCAAAAAA GGACAGATCCTGTGTTCTTCTTCTCTTGAAAGAAGAACACAGGATCTGTCC-3，。
2.干预IGF-1受体基因转录抑制肝癌细胞增殖的shRNA的应用，其特征在于，用于制备抗肝癌的药物。
【文档编号】C12N15/113GK103805607SQ201410092891
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】姚登福, 严晓娣, 姚敏, 王理 申请人:南通大学附属医院