植物转化方法
【专利摘要】本发明提供产生转基因植物的方法。所述方法尤其包括以下步骤：a)提供包含下胚轴或其部分、至少一个子叶和损伤组织的损伤的可转化外植体，b)转化由所述外植体包含的细胞，和c)通过将所述外植体的下胚轴插入到所述生长培养基中来将所述外植体转移到包含针对选择标记的至少一种选择化合物的生长培养基中。此外，本发明提供通过本发明的方法获得的植物。
【专利说明】植物转化方法
[0001]
[0002]本发明涉及产生转基因植物的方法。所述方法尤其包括以下步骤:a)提供包含下胚轴或其部分、至少一个子叶和损伤组织的损伤的可转化外植体，b)转化所述外植体包含的细胞，和c)将所述外植体转移到包含针对选择标记的至少一种选择化合物的生长培养基上。此外，本发明涉及通过本发明的方法可获得的植物。
[0003]在1984年首次为烟草描述的农杆菌介导的植物转化目前广泛用于将基因导入植物中，用于基础研究以及产生商业使用的转基因作物的目的。能够成功转化的植物包括大部分主要的经济作物、蔬菜、观赏植物、药用植物、水果、树木和牧草植物。
[0004]植物转化主要通过农杆菌介导的植物转化来完成。农杆菌是天然存在的病原土壤细菌，其能够转移DNA进入植物细胞的基因组中。对于农杆菌介导的植物转化，将目的基因置于农杆菌T-DNA(转移DNA)的左边界和右边界重复序列之间。随后，使用合适的植物转化方案(对于综述参见 Gelvin，2003Microbiol Mol Biol Rev.67(1):16-37)将含有目的基因的T-DNA区稳定整合到植物基因组中。
[0005]除了农杆菌介导的植物转化之外，还存在其他植物转化方法，如病毒转化、植物原生质体的电穿孔和粒子轰击。
[0006]—般而言，植物转化技术基于相同的原理。在第一步中，将目的基因导入合适的转化载体中。随后将携带有目的基因的转化载体导入目标植物的再生细胞中。由于仅有一小部分的目标细胞接受了目的基因，因此在大`量过量的未转化细胞中进行转化的植物细胞的选择。此外，一旦已经将目的基因稳定导入宿主细胞的基因组中，那么确定再生条件以从单个转化的植物细胞再生完整植株至关重要(参见例如Birch，1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mo1.Biol.48:297-326)。
[0007]最简单可用的基于农杆菌的植物转化方法之一是“浸花转化”。浸花是种系转化方法，通过所述方法可以将目的基因转化到产生种子的细胞中。该方法涉及在农杆菌细胞的悬浮液中浸泡植物(开花早期阶段)(Clough和Bent, 1998，Plant J16:735-43)。浸泡后几周，收集浸泡植物的种子，并选择转化体的种子群体。浸花转化技术的优势是它避免使用成本密集并需要受过训练的工作人员的组织培养和植物再生。不幸的是，小的植物尺寸、短的世代时间以及每株植物大量的种子是用于浸花的必要条件。因此，该转化方法仅仅成功地应用于少数物种，主要用于拟南芥(Arabidopsis thaliana)(但还有蔡藜苜猜(Medicagotruncatula)和芸苔(Brassica),参见 Wang 等 2003.Plant Cell Reports22:274-281)。
[0008]认为难以进行种系转化的完整转化植物的再生是植物转化中的瓶颈，这是由于再生难以实现，耗时并且需要特殊设备。
[0009]植物再生的第一步通常在体外条件下进行，即在无菌条件下的特殊营养培养基上。转化目标细胞后，通过特定的植物激素诱导细胞分裂，以从转化的植物细胞中生长出愈伤组织。愈伤组织诱导后，将所获的愈伤组织转移到允许枝条诱导的培养基上。将愈伤组织在所述培养基上培养(在体外条件下)直至形成枝条。枝条形成后，将枝条转移到允许根形成的培养基上(在体外条件下)。根形成后，一般将再生的小植株(即具有根的枝条)从体外条件转移到离体(ex vitro)条件下，主要转移到温室条件下的土壤中。因此，愈伤组织诱导、枝条诱导和根诱导一般均在体外条件下进行。
[0010]然而，体外条件下再生植物的当前方法具有一些缺点。在体外条件下再生完整植物花费高，并且需要特殊的营养培养基、特殊的设备和受过训练的工作人员。当然，常常存在污染的风险(例如，真菌污染)。如果组织培养受到污染，数周或甚至数月的工作可能都会前功尽弃。
[0011]然而，不采用组织培养，植物转化是有挑战的，这是由于组织培养
[0012]a)允许分别选择转基因植物细胞(和植物枝条)并且
[0013]b)同时抑制了细菌和真菌微生物的生长。不进行选择的话，难以鉴定携带转基因的植物细胞、植物枝条或小植株(即具有枝条和根的植物)。
[0014]此外，转基因植物的再生一般是耗力并且非常耗时的工作。例如，从假定的转基因体外芸苔或短柄草(Brachypodium)枝条到离体适应的、适合温室的植物的分离所需时间为12周至14周(对于短柄草例如参见:Bablak等(1995)Plant Cell, Tissue and OrganCulture42:97-107 ;或 Christiansen 等(2005)Plant Cell Report23:751-758 ;对于芸苔:Cardoza 和 Stewart (2004), Transgenic cropsOf the World-Essential Protocols,379-387 ;或 Jonoubi 等(2005).Biologia Plantarum49 (2):175-180)。
[0015]避免组织培养或减少组织培养的转化程序将是有价值的，尤其对难以再生的植物而言。科研人员已经尝试开发不需要组织培养的植物转化程序，但这些尝试仅获得了有限的成功。例如，Graves和Goldman(1986PlantMol.Biol.7:43-50)报道了农杆菌可以感染萌发的玉米种子的中胚轴细胞，但所获的转化植物为嵌合体并且转化效率极低。
[0016]大?(大? (Glycine max))属于?科(Fabaceae) ( ?科(Leguminosae))。将该植物科被鉴定为它的种子长在 豆荚中(荚果)。认为大豆起源于中国。野生型大豆在自然界中是葡萄树样的(viny)，这可能是为何大豆首先作为干草作物被引进美国的主要原因。从中国、中国东北(Manchuria)、韩国和日本引进对于美国开发变种是重要的。改善农艺性状的现代育种努力，如更直立的生长、降低倒伏和提高的种子大小已经在将大豆开发成为世界重要的作物中起了主要作用。收获谷物的作物的栽培面积和比例稳步增长，并且如今大豆成为主要的世界性商品。
[0017]关于大豆转化，基于体细胞胚胎发生的方法是已知的:通过将外植体置于高水平的2，4-D(40mg / L)上从未成熟的大豆子叶上诱导胚，并且胚胎发生组织随后在诱导培养基上(Finer (1988)Plant Cell R印7:238-241)或液体悬浮培养(Finer和Nagasawa(1988)Plant Cell Tissue Organ Cultl5: 125-136)中增殖。
[0018]Hinchee等描述了经农杆菌介导的转化产生转基因大豆植物。转基因植物的产生基于其中在大豆子叶上诱导枝条器官发生的再生方案(参见Hinchee等(1988)NatureBiotechnology, 6:915-922)。
[0019]还已知的是基于合子未成熟子叶的农杆菌介导的转化方法(Parrott等(1989)Plant Cell R印7:615-617 ;Yan 等(2000)Plant Cell Repl9:1090-1097 ;Ko 等(2003)Theor Appl Genet.107:439-447)。然而,在Parrott等中，从多细胞来源产生的三种植物是嵌合的并且不能将转基因传递到下一代。Yan等(2000)Plant Cell Rep19:1090-1097报道了 0.03%的低转化频率。所产生的植物将转基因传递到下一代，这推测是由于连续选择转化的初生胚用于产生次生胚，由此产生非嵌合植物的缘故。目前，Ko等(2003)TheorApplGenet.107:439-447已经报道了 1.7%转化频率的转基因植物的重获，然而，该方法依赖于使用部分可卸甲的(致瘤的)农杆菌菌株PKYRT (其具有功能性的TR-DNA序列)，以刺激胚胎发生(Ko等(2004)Planta218:536-541)。这些方法使用未成熟的子叶作为目标组织，随后在固体培养基上进行增殖和选择。
[0020]US2009 / 0049567公开了利用初生叶节或更高叶节的分生细胞作为目标组织的农杆菌介导的大豆转化和所转化的细胞随后再生成完整植株。
[0021]CN101736028A描述了通过转化子叶节而不依赖于组织培养转化大豆的方法。在体外或田地中萌发大豆种子。5-7天后，从幼苗上取下顶端分生组织和分生组织。随后通过农杆菌介导的转化来转化子叶节区域。10-15天后，用选择化合物刷叶片。然而，所公开的方法仅产生相对少量的转基因植物(例如转化127株幼苗，仅获得8株转基因植物)。
[0022]Weeks 等(Transgenic Research (2008), 17, 587-597)公开了用于转化苜猜植物的方法。为了转化，在顶端节点处切割幼苗并在含有研磨介质的农杆菌悬浮液中剧烈涡旋。在所述方法中没有使用选择标记基因。因此，通过PCR和/或组织化学分析监测转化。然而，大量再生植物是嵌合的。
[0023]WOOO / 56904描述了用于在棉花、咖啡、可可、香蕉或葡萄植物中选择转基因分生组织细胞的方法和随后转基因植物的产生。该方法包括以下步骤:将外源基因导入棉花、咖啡、可可、香蕉或葡萄植物的胚轴顶端分生组织的细胞或含有所述植物分生组织的组织或器官中；通过在包含多枝条诱导剂的培养基中培养它们的胚轴或含有分生组织的组织来诱导在前述步骤中改变的顶端分生组织区中细胞的多发枝条；和通过在含有易位并富集于棉花、咖啡、可可、香蕉或葡萄植物的胚轴顶端分生组织中的分子的培养基中进一步培养所述分生组织来选择顶端区域的转基因分生组织细胞。
[0024]W099 / 18223公开`了用于产生含有外源DNA的转基因豆科植物的方法，其包括以下步骤:通过生物弹道(biobalistic)方法将外源基因导入豆科植物的胚轴顶端分生组织的细胞中；通过在含有多发枝条诱导剂的培养基中培养它们的胚轴来诱导在前述步骤中改变的顶端分生组织区中细胞的多发枝条；和选择通过在含有富集于所述豆科植物胚的顶端分生组织区中的分子的培养基中进一步培养而转化的顶端区的分生组织细胞。
[0025]Aragao等公开了通过生物射弹转化对菜豆(Phaseolus vulgaris)的转化(AragSo FJL, Barros LMC, Brasileiro ACM, Ribeiro S G，Smith FD, Sanford JC,Faria JC,Rech EL (1996)Inheritance of foreign genes in transgenic bean (Phaseolusvulgaris L.)co-transformed via particle bombardment.Theor.Appl.Genet.93:142-150.)。在其他文献中，Aragao描述了获得高频率可育转基因大豆植物的方法(AragSo FJL, Sarokin L, Vianna GR, Rech EL (2000) Selection of transgenicmeristematic cells utilizing an herbicidal molecule results in the recoveryof fertile transgenic soybean[Glycine max(L.)MerriI]plants at high frequency.Theor.Appl.Genet.101:1-6)。
[0026]W097 / 23126公开了用于微繁殖木本植物的枝条、生根的枝条或幼苗的方法，其包括在含氧液体培养基中培养所述枝条、生根的枝条或幼苗，其中所述枝条、生根的枝条或幼苗浸没在液体培养基中。[0027]W09407356公开了利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化苹果类果实幼芽(pomaceous fruit scion)或根莖品种的方法。
[0028]尽管已经在农杆菌介导的转化方法领域中获得了显著进步，但仍然存在对改进方法的需要，以促进该方法用于转化植物的便利、速度和效率。因此，本发明的目标是在产生转基因大豆植物的方法中提供具有更高的整体效率的改进方法。通过本发明来解决该目标。
[0029]因此，本发明涉及产生转基因植物的方法，其包括以下步骤:
[0030]a)提供损伤的可转化外植体，其包含下胚轴或其部分、至少一个子叶，和选自以下的损伤组织:
[0031]1.初生叶节或更高叶节的损伤的分生组织(尤其是初生叶节或更高叶节的损伤的腋生分生组织)，
[0032]i1.子叶节的损伤的分生组织，和
[0033]ii1.损伤的上胚轴组织
[0034]b)利用包含选择标记基因的至少一个植物表达盒的多核苷酸转化所述外植体所包含的细胞，
[0035]c)通过将所述外植体的下胚轴或其部分插入到所述生长培养基中来将所述外植体转移到生长培养基中，所述生长培养基包含针对所述选择标记基因的至少一种选择化合物，
[0036]d)允许所述外植体形成枝条，和/或允许该枝条伸长，所述枝条包含含有所述选择标记基因的至少一个 植物表达盒的植物细胞，和
[0037]e)从所述枝条再生转基因植物。
[0038]在本发明方法的上下文中，应该产生转基因植物。如本文所用，术语“转基因的”优选指已经引入了外源DNA序列的细胞或植物。优选地，所述外源DNA序列稳定引入到转基因植物或植物细胞的基因组中。优选地，所述外源DNA序列包含至少一个多核苷酸，其包含选择标记基因的至少一个植物表达盒。优选地，通过允许所述基因在植物中表达的启动子来调节选择标记基因的表达。此类启动子为本领域所熟知，并优选包括组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育特异性启动子。优选的启动子例如公开于US2009 /0049567中，在此完整引入作为参考。用于表达选择标记基因的最优选启动子是组成型启动子。
[0039]优选地，包含选择标记基因的至少一个植物表达盒的至少一个多核苷酸通常不存在于植物或植物细胞中，或通常存在于植物或植物细胞基因组中的不同位置上。优选地，包含选择标记基因的至少一个植物表达盒的多核苷酸还包含有价值的农艺性状的植物表达盒。
[0040]待转化的植物可以是单子叶植物。最优选地，待转化的植物是双子叶植物。
[0041]优选地，所述双子叶植物是豆科、爺科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、黎科(Chenopodiaceae)、菊科(Asteraceae)、锦奏科(Malvaceae)、亚麻科(Linacea)、大戟科(Euphorbiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、蓄蔽科(Rosaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、山茶科(Theaceae)、菌草科(Rubiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)或相桔科(Citrus)。尤其优选地，所述植物是豆科、茄科或十字花科。[0042]如果所述植物是豆科植物，那么该植物优选是大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、落花生属(Arachis)、鹰嘴豆属(Cicer)、蚕豆属(Vicia)、菜豆属(Phaseolus)、羽扇豆属(Lupinus)、苜猜属(Medicago)或兵豆属(Lens)。豆科的优选物种是蔡藜苜猜(Medicago truncatula)、紫花苜猜(Medicago sativa)、大豆、野生大豆(Glycine soia)、豌豆(Pisum sativum) > Archis hypogea、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、香豆(Vicia fab a)、菜豆、尖叶菜豆(Phaseolus acutifolius)、白羽扇豆(Lupinus albus)、黄羽扇豆(LupinusIuteus)、蓝羽扇豆(Lupinus angustifolius)或小扁豆(Lens culinaris)。更优选的是大豆、Archis hypogea和紫花苜蓿。最优选的物种是大豆。大豆的优选表型是用于实施例中的表型。
[0043]当所述植物是爺科时,优选的属是爺属(Solanum)、番爺属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)或辣椒属(Capsicum)。爺科的优选物种是马铃薯(S.tuberosum)、番爺(L.esculentum)(还称为番爺爺(Solanum Iycopersicon))、烟草(N.tabaccum)或黄灯笼辣椒(C.chinense)。更优选的是马铃薯。
[0044]当所述植物是藜科植物时,优选属是Beta或菠菜(Spinacia)。优选物种是甜菜(B.vulgaris)和疲菜(S.0leracea)。
[0045]当所述植物是菊科植物时，优选属是向日葵属(Helianthus),优选物种是向日葵(H.annuus)。 [0046]在一个优选实施方案中，所述植物是十字花科。如果所述植物是十字花科，那么该植物优选是芸苔属(Brassica)或萝卜属(Raphanus)。芸苔属的优选物种是欧洲油菜(B.napus)、甘蓝(B.0leracea)、芥菜(B.Juncea)或芜青(B.rapa)。最优选的是欧洲油菜物种。
[0047]当所述植物是锦葵科植物时，优选属是棉属(Gossypium)或秋葵属(Abelmoschus)。当所述属是棉属时，优选物种是陆地棉(G.hirsutum)或海岛棉(G.barbadense)。最优选的物种是陆地棉。秋葵属的优选物种是咖啡黄葵(A.esculentus)。
[0048]当所述植物是亚麻科时，优选属是亚麻属(Linum)。优选物种是亚麻(L.usitatissimum)。
[0049]当所述植物是大戟科植物时，优选属是木薯属(Manihot)、麻风树属(Jatropa)或蓖麻属(Rhizinus),并且优选物种是木薯(M.esculenta)、麻风树(J.curcas)或蓖麻(R.communis)。
[0050]当所述植物是旋花科植物时，优选属是番薯属(Ipomea)。优选物种是甘薯(L.batatas)。
[0051]尤其优选的植物物种是蒺藜苜蓿、紫花苜蓿、大豆、野生大豆、豌豆、Archishypogea、鹰嘴豆、白羽扇豆、黄羽扇豆、蓝羽扇豆、尖叶菜豆和菜豆。更优选的物种是大豆、Archis hypogeal和菜豆以及紫花苜猜。最优选的物种是大豆。
[0052]待用于本发明方法中的损伤的可转化外植体应该包含至少一个子叶，和选自以下的损伤组织:初生叶节或更高叶节的损伤的分生组织、子叶节的损伤的分生组织，和损伤的上胚轴组织。在优选的实施方案中，损伤的可转化外植体还包含下胚轴或其部分。
[0053]在本发明方法的上下文中，所述损伤的可转化外植体优选来自幼苗或从幼苗获得。[0054]优选地，所述幼苗是3-20天龄的幼苗。更优选地，所述幼苗是5-12天龄的幼苗。甚至更优选地，它是4-12天龄的幼苗，或6-10天龄的幼苗。最优选地，所述幼苗是7-8天龄的幼苗。优选地，从幼苗萌发开始计算幼苗的年龄。
[0055]应该特别考虑幼苗在体外条件，即元菌条件下生长。然而，还应考虑所述幼苗在非无菌条件下生长。
[0056]在本发明方法的上下文中，优选通过在i)初生叶节或更高叶节的分生组织，ii)子叶节的分生组织，或iii)上胚轴区中使所述幼苗受到损伤来从幼苗获得损伤的可转化外植体。优选地，所述损伤组织是转化的目标组织，即利用包含选择标记基因的至少一个植物表达盒的多核苷酸转化该目标组织包含的细胞。
[0057]因此，如果子叶节的分生组织受到损伤，那么目标组织是子叶节的分生组织。如果初生叶节或更高叶节的分生组织受到损伤，那么目标组织是初生叶节或更高叶节的分生组织。如果上胚轴组织受到损伤，那么目标组织是上胚轴组织，优选其中上胚轴组织已经受到损伤的组织。
[0058]术语“分生组织细胞”或“分生组织”为本领域技术人员所知。该术语优选指连续分裂并形成细胞的未分化植物细胞或组织。
[0059]优选地，初生叶节或更高叶节的损伤的分生组织是损伤的顶端分生组织。更优选地，初生叶节或更高叶节的损伤的分生组织是损伤的腋生分生组织。因此，目标组织优选为初生叶节或更高叶节的腋生分生组织。
[0060]如本文所用，术语“上胚轴”优选指定位在子叶节和初生叶节之间的植物部分。
[0061]可以使用许多损伤方法。优选方法为切割、打磨、穿孔、戳刺、利用精细颗粒或加压液体的穿透、等离子损伤、应用高压压力或超声。可以使用物体，如手术刀、剪刀、针、磨砂物体、颗粒、电基因枪或声波进行损伤。
[0062]在本发明方法的上下文中，优选通过在i)子叶节的分生组织，ii)上胚轴区，或iii)初生叶节或更高叶节的分生组织处切割幼苗完成损伤(根据目标组织)。更优选地，通过在子叶节的分生组织处、上胚轴区内，或初生叶节或更高叶节的分生组织内切开(decapitate)所述幼苗来完成所述损伤。
[0063]切口下面的植物部分用作可转化外植体。因此，优选去除定位在切口上面的幼苗部分。
[0064]此外，还特别设想从所述幼苗去除以下部分，以获得损伤的可转化外植体:
[0065]1.根，
[0066]i1.根和下胚轴部分，
[0067]ii1.如果从双子叶植物(其为最优选的植物)制备所述外植体，那么优选去除一个子叶。`
[0068]如本文所用，术语“下胚轴”优选指子叶和根之间的幼苗部分。下胚轴或其部分的使用是有利的，因为可以在本发明方法的步骤c)将该下胚轴插入到生长培养基中。由此，外植体可以更好地保持向上的位置上。
[0069]特别优选至少三分之二的下胚轴，并更优选至少三分之一，或甚至更优选十分之一的下胚轴(如幼苗所包含的)保持附着在损伤的可转化外植体上。甚至更优选地，0.5-2cm或0.5-lcm的下胚轴保持附着在外植体上。还考虑0.l_2cm的下胚轴保持附着在外植体上。
[0070]因此，所述损伤的可转化外植体包含的下胚轴部分优选包含至少三分之二、至少三分之一，或至少十分之一的下胚轴(如幼苗所包含的)。所述部分还优选包含0.5-2cm、0.5-lcm或0.l-2cm的下胚轴(如幼苗所包含的)。此外，还应设想下胚轴部分少于三分之一、少于四分之一，或特别少于十分之一的下胚轴(如幼苗所包含的)。因此，下胚轴部分优选具有至少0.2,0.4或0.5cm的长度。然而，如果目标组织是初生叶节或更高叶节的损失的分生组织，那么可以从植物中完全去除下胚轴。在这种情况下，待转化的外植体不包含下胚轴组织。
[0071]优选地，如果所述幼苗在子叶节的分生组织处受到损伤(例如通过切割或切开)，那么子叶节的分生组织或其部分保持附着在可转化外植体上。
[0072]因此，在本发明方法的优选实施方案中，来自幼苗的损伤的可转化外植体包含:
[0073]1.下胚轴或其部分，
[0074]i1.至少一个子叶，
[0075]ii1.子叶节的损伤的分生组织。
[0076]优选地，如果所述幼苗在上胚轴处受伤(例如通过切割或切开，见上文)，那么损伤的上胚轴部分保持附着在可转化外植体上。所述上胚轴可以在任何位置处受到损伤。
[0077]因此，在另一优选实施方案中，来自幼苗的损伤的可转化外植体包含:
[0078]1.下胚轴或其部分，
[0079]i1.至少一个子叶,和
[0080]ii1.损伤的上胚轴组织。
[0081]优选地，如果所述幼苗在初生叶节或更高叶节的分生组织处受伤，那么损伤组织部分附着在可转化外植体上。
[0082]因此，在本发明方法的优选实施方案中，来自幼苗的损伤的可转化外植体包含:
[0083]1.下胚轴或其部分，
[0084]i1.至少一个子叶，
[0085]ii1.上胚轴，和
[0086]iv.初生叶节或更高叶节的损伤的分生组织。
[0087]在本发明方法的步骤b)中，应该用包含选择标记基因的至少一个植物表达盒的多核苷酸转化所述外植体包含 的细胞。
[0088]待转化的多核苷酸应该包含选择标记基因的至少一个植物表达盒。
[0089]如本文所用，术语“选择标记基因”指相比于未用所述植物表达盒转化并因此不包含所述选择标记基因的植物或植物细胞，在生长培养基中存在相应的选择化合物(本文中还称为“选择标记基因的选择化合物”)时赋予所述选择标记的植物表达盒转化的植物或植物细胞生长优势。优选地，所述选择标记基因和/或所述选择标记基因的植物表达盒对待转化的植物是异源的，并因此不天然存在于待转化的植物中。
[0090]优选地，所述选择标记基因是负选择标记基因。负选择标记基因赋予针对选择化合物的抗性和/或增强的耐受性。优选的选择化合物是除草剂。
[0091]在本发明方法的上下文中，所述选择化合物优选能够从生长培养基中被运输到已经转化有包含选择标记基因(因此，对应于所述选择化合物的标记基因)的至少一个植物表达盒的多核苷酸的细胞，和/或(通过细胞分裂)来自所述细胞的细胞中。因此，所述选择化合物优选能够从生长培养基中被运输到包含所述多核苷酸的转化细胞/组织中。优选地，运输通过外植体的维管束，特别通过韧皮部或木质部。特别优选的能够被运输通过外植体的选择化合物是咪唑啉酮除草剂(参见下文)和D-氨基酸，特别是D-丙氨酸和D-丝氨酸，或与氨基酸具有相似性的除草剂，像膦丝菌素或草甘膦。
[0092]因此，还可以用于本发明的标记基因是例如，但不限于其他:
[0093]-膦丝菌素乙酰转移酶(PAT;还命名为Bia丨aphos? resistance ；bar ；De Block等(1987)Plant Physiol91:694-701 ；EP0333033 ；US4, 975, 374)
[0094]-5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS ；US5, 633，435)或草甘膦氧化还原酶基因(US5，463，175)，其赋予对Glyph0SateTM(N-(磷酸基甲基)甘氨酸)的抗性(Shah efal.(1986)Science233:478)
[0095]-Glyphosate? 降解酶(Glyphosate? 氧化还原酶；gox),
[0096]-磺酰脲类和咪唑啉酮-失活的乙酰乳酸合酶(例如突变的ALS变体，例如具有S4和/或Hra突变)
[0097]-BromoxyniI? 降解腈水解酶(bxn)
[0098]-卡那霉素，或G418-编码例如新霉素磷酸转移酶的抗性基因(NPTII;NPTI)(Fraley等(1983) Proc Natl Acad Sci USA80:4803),其表达赋予抗生素卡那霉素和相关抗生素新霉素、巴龙 霉素、庆大霉素和G418抗性的酶，
[0099]-麦草畏降解酶(O-脱甲基酶、加氧酶、铁氧还蛋白)(Behrens等2007Science316:1185-1188 ；US7022896)
[0100]-针对D-氨基酸，例如D-丙氨酸和D-丝氨酸强加的毒性效应赋予抗性的标记基因(W003 / 060133)。在该竞争(contest)中尤其优选为标记基因的是来自酵母红酵母(Rhodotorula gracilis)(圆红冬抱酵母(Rhodosporidium toruloides))的 daol 基因(EC:1.4.3.3:GenBank Acc.-N0.:U60066)和大肠杆菌(E.coli)基因 dsdA(D_ 丝氛酸脱水酶(D-丝氨酸脱氨酶)[EC:4.3.1.18 ；GenBank Acc.-N0.J01603)。
[0101]备选标记基因是正选择标记，其赋予转化植物相比于非转化植物的生长优势。例如在EP-A0601092中描述了此类选择标记。正选择标记可包括(但不应限于)甘露糖_6_磷酸异构酶(与甘露糖组合)、UDP半乳糖-4-差向异构酶(与例如半乳糖组合)，其中尤其优选与甘露糖组合的甘露糖-6-磷酸异构酶。
[0102]赋予生长优势的标记基因可以与提供针对除草剂、D-氨基酸或抗生素的抗性的标记基因组合使用。
[0103]特别优选的标记基因如下:
[0104]特别优选的选择标记基因是乙酰羟基酸合酶(AHAS)基因，特别是突变的AHAS基因。该乙酰羟基酸合酶(也称为乙酰乳酸合酶，或ALS)是发现于植物和微生物中的蛋白质，并且其催化支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)合成的第一步。优选地，其具有在Enzyme Commission Code EC2.2.1.6中阐明的酶促活性。所述突变的AHAS蛋白质优选赋予针对至少一种咪唑啉酮除草剂的抗性。咪唑啉酮除草剂为本领域所熟知，并优选包括灭草烟(imazapyr)、灭草喹(imazaquin)、咪草烟(imazethapyr)、甲基咪草烟(imazapic)、甲氧咪草烟(imazamox)和咪草酯(imazamethabenz)。优选地,所述咪唑啉酮除草剂是灭草喹。更优选地，所述咪唑啉酮除草剂是咪草烟。最优选地，所述咪唑啉酮除草剂是灭草烟。
[0105]优选的突变AHAS基因公开于W02004 / 005516或W02008 / 124495中，其完整引入作为参考。其他优选的突变AHAS基因公开于W02006 / 015376或W02007 / 054555或US20100287641中。所述突变AHAS酶优选针对咪唑啉酮除草剂赋予抗性。
[0106]在GenBank-检索号FW503642.1G1:313050309中显示了特别优选的突变AHAS基因的多核苷酸序列。所得突变AHAS多肽尤其包含S653N突变。
[0107]其他优选的选择标记基因是赋予对D-氨基酸强加的毒性效应抗性或增强的耐受性的标记基因。此类优选的标记基因优选编码能够代谢D-氨基酸的蛋白质。优选的D-氨基酸是D-丙氨酸和D-丝氨酸。特别优选的标记基因编码D-丝氨酸脱氨酶、D-氨基酸氧化酶和D-丙氨酸转氨酶。编码能够代谢D-氨基酸的蛋白质的此类标记基因的优选实例是在 TO03 / 060133、W005 / 090584、W007 / 107516 和 W008 / 077570 中描述的那些，其完整引入作为参考。
[0108]已知用于转化植物细胞的几种方法。优选通过农杆菌介导的转化、通过裸DNA转化，如电穿孔和PEG介导的转化，或通过粒子轰击完成目标组织包含的细胞的转化。
[0109]特别优选通过将外植体与包含T-DNA的农杆菌共同培养来进行步骤b)。所述T-DNA应该包含这样的多核苷酸，其包含本发明方法步骤b)中提及的选择标记基因的至少一个植物表达盒。优选地，外植体与农杆菌的共培养应该允许转化损伤的可转化外植体包含的细胞，以便获得嵌合的外植体。如何共培养外植体与农杆菌为本领域所熟知并且例如描述于US2009 / 0049567中。在本发明背景下进行的研究背景中，固体和液体共培养培养基均成功用于转化。对于共转化，优选利用在液体共培养培养基中重悬的农杆菌培养物接种外植体几分钟至几小时，通常约10分钟-3小时，优选约0.5小时-1小时。允许农杆菌与目标组织优选在液体共培养培养基或含有(凝固的)共培养培养基的平板上，暗中共培养几天，通常3-5天 。在实施例部分中描述了优选的共培养培养基。在共培养步骤中，农杆菌将其T-DNA转移到目标组织的一些细胞中。优选地，在体外条件，即无菌条件下进行共培养。通常，在该步骤过程中不存在选择化合物。
[0110]优选地，如果所述外植体包含初生叶节或更高叶节的损伤的分生组织(参见上文)，那么转化所述损伤的分生组织包含的细胞(还参见例如US2009 / 0049567)。因此，损伤的分生组织包含的细胞是转化的目标。因此，共培养优选应该允许转化初生叶节或更高叶节的损伤的分生组织包含的细胞。由此，获得嵌合外植体，即这样的外植体，其包含利用选择标记基因的至少一个植物表达盒转化的细胞和未利用选择标记基因的至少一个植物表达盒转化的细胞。
[0111]优选地，如果所述外植体包含子叶节的损伤的分生组织，那么转化所述损伤的分生组织包含的细胞。因此，子叶节的损伤的分生组织包含的细胞是转化的目标。因此，共培养优选应该允许转化子叶节的损伤的分生组织包含的细胞。由此，获得嵌合外植体。
[0112]优选地，如果所述外植体包含损伤的上胚轴组织，那么转化所述损伤的上胚轴组织包含的细胞(参见例如 Wright 等(Plant Cell, Tissue and Organ Culture8:83to90(1987))。因此，损伤的上胚轴组织包含的细胞是转化的目标。由此，获得嵌合外植体。
[0113]如本文所用，术语“农杆菌”表示农杆菌家族的所有物种(包括根癌农杆菌和毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes))。通过农杆菌介导DNA转移的植物转化的原理为本领域所熟知(Horsch R B 等(1985) Science225:第 1229 页)。
[0114]农杆菌是土传植物病原菌，其将一段DNA (T-DNA)整合到大量双子叶植物和少量单子叶植物的基因组中(Chilton，等，1977Cellll:263-271 ；Hoekema,等，1985Nature303:179-180 ；Bevan,1984Nucleic Acids Res.12:8711-8721 ；Sheng 和 Citovsky，1996ThePlant Cell，第8卷.1699-1710)。优选的农杆菌菌株是通常在被感染的植物中引起冠瘿的根癌农杆菌和通常在被感染的宿主植物中引起发根疾病的毛根农杆菌。然而，如本发明上下文中使用的农杆菌菌株优选应该缺乏分别引起冠瘿疾病和发根疾病的能力(其可以通过使用卸甲的农杆菌菌株完成，参见下文)。
[0115]农杆菌，特别是根癌农杆菌(也可以是毛根农杆菌)用于植物转化的用途是众所周知的(对于综述，参见 Gelvin，2003Microbiol Mol Biol Rev.67(1):16-37)。对于农杆菌介导的植物转化，将目的基因置于农杆菌T-DNA (转移DNA)的左边界和右边界重复序列之间。然后，使用适当的植物转化方案将含有目的基因的T-DNA区稳定整合到植物基因组中。
[0116]具有不同染色体背景和Ti质粒内含物的农杆菌的多种菌株均可用于转化。然而，优选农杆菌菌株含有卸甲的Ti质粒或卸甲的Ri质粒。卸甲的Ti质粒理解为缺乏其冠瘿疾病介导性质但却提供感染植物的功能的Ti质粒。卸甲的Ri质粒理解为缺乏其发根疾病介导性质但却提供感染植物的功能的Ri质粒。待用于转化植物细胞的农杆菌菌株选自 LBA4404、GV2260、GV3600、EHAlOl、EHA105、AGL-1、LBA9402、GV3101、C0R341、C0R356、瓜八14340132、818402、058(:14]\^90和461'121。在优选的实施方案中，所述农杆菌菌株选自〇58(:13撤101、？1^90、5撤017和1^44404。在另一优选实施方案中，所述农杆菌菌株是K599的卸甲变体(NCPPB2659)，其优选携带如W003 / 017752中公开的pri2659的卸甲变体。
[0117]优选地，待用于本发明方法的上下文中的农杆菌包括DNA构建体(例如双元载体)，其包含含有选择标记基因的表达盒的T-DNA。优选地，所述T-DNA包含赋予有价值的农艺性状的至少一个表达盒。由于农杆菌介导的转移，所述T-DNA通常存在，即稳定整合到转化细胞的基因组中。
[0118]为了允许转化，通过已知方法制备农杆菌。包含农杆菌菌株的T-DNA例如可以在补充有适当抗生素的液体YEP培养基中生长。对于共培养，优选将细菌重悬浮在液体共培养培养基中。用于共培养的农杆菌的浓度可以变化。因此，一般可以使用OD6tltl在0.1-3.0之间的农杆菌浓度范围和几小时-7天的共培养时间范围。特别优选农杆菌浓度在OD6000.1-2.0范围内变化。
[0119]另外，还用于转化细胞的优选方法是粒子轰击。如本文所用，术语“粒子轰击”优选指向目标生物学样品(特别是细胞和植物组织)，加速目的基因包被的颗粒，以有效损伤目标生物学样品中细胞的细胞膜和/或颗粒进入目标生物学样品的过程。用于粒子轰击的方法(还经常称为“生物射弹轰击”)为本领域所知，参见例如US5，584，807，并是通过商业途径可以获得的(例如氦气驱动的微粒加速器(PDS-1000 / He) (BioRad))。
[0120]在优选的实施方案中，所述方法还包括步骤bl):将步骤a)的外植体(特别是共培养的外植体)转移到枝条诱导培养基上并在所述枝条诱导培养基上培养所述外植体。优选地，优选通过将外植体优选以水平位置放置到枝条诱导培养基上而将该外植体转移到所述培养基中。还应设想将所述外植体沉浸在所述培养基中(优选也在水平位置上)。通过进行步骤bl)，产生包含枝条组织的外植体，所述枝条组织包含含有选择标记基因的至少一个植物表达盒的细胞。所述枝条组织在本文中也称为“从头形成的枝条组织”。优选地，所述枝条组织来自转化目标的组织。
[0121]优选地，所述枝条诱导培养基包含允许诱导枝条的至少一种植物生长因子，特别是细胞分裂素(cytokinin)。优选地，所述枝条诱导培养基以适合于从目标组织从头诱导枝条诱导的浓度包含所述至少一种植物生长因子。优选地，所述枝条诱导培养基包含用于至少一个植物表达盒包含的可选择标记基因的选择化合物。
[0122]如本文所用，术语“植物生长因子”优选包括可以调节植物生长和发育的天然发生的或合成的(非天然发生的)化合物。优选的植物生长因子是细胞分裂素或生长素。
[0123]优选的生长素选自吲哚乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和2，4一二氯苯氧乙酸(2，4-D)。特别优选的生长素是IAA(对于优选浓度，参见实施例)。
[0124]优选的细胞分裂素是细胞分裂素(kinetin)、玉米素、6.异戊烯腺嘌呤(IPA)和6-苄基腺嘌呤/ 6-苄氨基嘌呤(BAP)。
[0125]枝条诱导培养基优选包含细胞分裂素，特别是细胞分裂素和/或BAP。
[0126]枝条诱导培养基可以进一步含有抗生素，以终止或延迟剩余农杆菌细胞的生长。优选地，所述抗生素不是用于应该转化到植物中的选择标记基因的选择化合物。优选的抗
生素是羧苄青霉素或Hment in?,其为替卡西林钠和克拉维酸钾的混合物。优选地，培养基含有适合于终止或延迟农杆菌细胞生长的量的抗生素。或者，可以在共培养之后利用含有所述抗生素的溶液洗涤外植体。
[0127]枝条诱导培养基优选进一步包含足以允许选择转基因细胞的量的选择化合物(用于转化的选择标记基因)。在下文本发明方法步骤c)的上下文中给出了对术语“足以允许选择转基因细胞的量”的解释。在步骤c)的上下文中给出的选择化合物的优选量还应用到枝条诱导培养基上。
[0128]优选在所述枝条诱导培养基上培养外植体，直至已经产生枝条。转基因枝条原基(shoot primordia)的形成在枝条诱导培养基上约I周后变得可见，并且平均而言，外植体在枝条诱导培养基上培养约3-6周，以允许大多数外植体形成新的枝条。因此，可以在枝条诱导培养基上培养所述外植体高达5周。然而，外植体在枝条诱导培养基上的培养可以显著少于5周，因为在本发明背景下进行的研究已经惊奇地显示，当进行本发明的方法时，在枝条诱导培养基上的培养时间可以减少。这种惊奇的效应导致获得完全再生植物所需要的时间整体减少。因此，在本发明方法的步骤bl)中，在将所述外植体转移到如下文所述的生长培养基之前，优选将该外植体在枝条诱导培养基上培养1-4周，更优选1-3周，甚至更优选2-3周。
[0129]在本发明方法的步骤c)中，应该将该外植体转移到生长培养基上。如果已经进行了步骤bl)，那么所述生长培养基应该允许促进转基因枝条的伸长。如果还未进行步骤bl)，那么所述生长培养基应该允许转基因枝条的从头形成和转基因枝条的伸长。该生长培养基可以是允许转基因枝条伸长和植物生长的任何培养基(参见下文)。在本发明方法的上下文中，生长培养基优选包含针对所述选择标记基因的至少一种选择化合物。优选地，生长培养基包含足以允许选择转基因细胞(即包含含有如上所提及的植物表达盒的多核苷酸的细胞)的量的所述至少一种选择化合物。
[0130]优选地，通过进行步骤bl)获得外植体，即将在枝条诱导培养基上培养并包含从头形成的枝条组织的外植体转移到生长培养基上。然而，还应该设想，在步骤b)后立即进行本发明方法的步骤c)(并因此不进行步骤bl)。特别地，应设想将已经与包含如上所述T-DNA的农杆菌共培养(步骤b))的外植体直接转移到生长培养基中。在这种情况下，所述生长培养基应该允许转基因枝条的形成和伸长。如果已经进行了步骤bl)(并因此如果已经在枝条诱导培养基上培养了外植体)，那么在将所述外植体转移到生长培养基上之后，优选应该允许该外植体包含的从头形成的枝条伸长。如何完成转基因枝条的形成和伸长为本领域所熟知。
[0131]优选地，将外植体垂直(并因此以向上的位置)放置在生长培养基中，其中目标组织朝上。更优选地，将所述外植体垂直放置在生长培养基(其中目标组织朝上)中，以便该外植体包含的目标组织不直接与生长培养基的表面接触。这优选通过将外植体包含的下胚轴或其部分插入到生长培养基中来完成。优选地，至少一个子叶不插入到生长培养基中。因此，其应该优选留在生长培养基表面之上。
[0132]将所述下胚轴或其部分插入到所述生长培养基中之后，所述外植体优选处于向上的位置(以便该外植体包含的目标组织不直接与生长培养基的表面接触)。如果已经进一步进行了步骤bl)，那么这也可以进行应用。在这种情况下，将所述外植体转移到所述生长培养基中之后，该外植体包含的从头形成的枝条组织不应该直接与生长培养基的表面接触。
[0133]当然，不必将整个下胚轴插入到生长培养基中。将下胚轴的部分插入到足以保持外植体处于向上位置的所述生长培养基中就足够了。本领域技术人员能够立即确定是哪部分允许保持外植体向上的位置。
[0134]如果该外植体不包 含子叶(当试图将其插入到孔中时，如果子叶脱落，那么就是这种情况)，优选将上胚轴部分插入到生长培养基中。在这种情况下，外植体也应该垂直放置在生长培养基中，以便目标组织不直接与生长培养基的表面接触。然而，应该特别设想，在转移到生长培养基之后，上胚轴保留在生长培养基表面上方。
[0135]所述生长培养基可以是允许植物生长的任何培养基。优选地，所述生长培养基是固体培养基。
[0136]优选地，该生长培养基(本文中还称为“生长培养基”)选自土壤、腐殖土和水培培养基。最优选的生长培养基是水培培养基。优选地，将所述外植体转移到所述生长培养基上后，将外植体在离体条件下，并因此在非无菌条件下培养。
[0137]此外，还应该设想，生长培养基是植物组织培养基。在这种情况下，在体外条件，即无菌条件下进行步骤C)。优选地，所述植物组织培养基选自Gamborg B5培养基、Murashige&Skoog 培养基、Linsmaier & Skoog 培养基和 Murashige & Miller 培养基。当然，特别优选Gamborg B5培养基和Murashige&Skoog培养基。
[0138]水培法用于植物生长的用途是众所周知的(对于综述，参见Hydroponics:APractical Guide for the Soilless Grower, J.Benton Jones，published CRC Press，2004)。水培法是在没有土壤的营养液中培养植物的技术。两种主要类型的水培法是液体水培培养基和基质水培培养基。在本发明方法的上下文中，所述水培培养基是基质水培培养基，并因此是包含水培化合物和营养培养基的无土壤的培养培养基。
[0139]优选地，所述水培培养基包含的水培化合物是无机化合物。更优选地，所述水培化合物是矿棉。最优选地，所述水培化合物是基于酸性酚醛、尿素甲醛或纤维素的泡沫。此类泡沫优选具有模拟植物细胞结构的开放格栅结构。优选的泡沫作为来自Smithers-Oasis
C0.的Oasis?生根培养基也称为Oasis? wedges, (Kent, OH, USA)可用或作为来自Grow-Tech的微孔泡沫生根海绵(Lisbon FalIs,ME,USA)可用。例如在US2，753，277中描述了优选的基于酸性酚醛的泡沫(也称为酚醛泡沫)。
[0140]用于植物生长的矿棉水培化合物为本领域所知并优选包含从天然的或合成的矿物质或金属氧化物制备的矿物纤维的粘着基质(coherent matrix)。优选地,矿棉选自玻璃棉、岩棉和渣棉。还考虑的是上述矿棉的混合物。在本发明背景下最优选矿棉是岩棉(还参见W001 / 87070) ο岩棉(也经常被称为石棉)是从火山岩制备的矿棉。其包含孔(约95% )和岩石纤维形式的固体(5% ) ο优选地，从玄武岩和石灰岩制备岩棉。为了制备岩棉，例如将这些原料在烘箱中约150(TC下加热，在该温度下它们熔化成熔岩。然后将所述熔岩倾注到高速旋转的许多圆盘上。离心力从圆盘上抛掷熔岩滴，然后将其转变成线。压缩所述线，以形成实体，其然后被锯成石板和石块。
[0141]应该理解的是，可以提供许多形状和大小的水培培养基，例如小方块、方块、块状、垫子和平板(还参见实施例)。
[0142]当然，生长培养基应该还包含营养物。所述培养基优选包含植物生长和发育需要的基本元素，如氮、磷和钾。优选地，所述生长培养基还包含植物生长调节剂，特别是生长素，如IAA。
[0143]在本发明 方法的上下文中，上文提及的生长培养基应该包含用于上述表达盒包含的针对选择标记基因的至少一种选择化合物。当将外植体转移到生长培养基中时，所述选择化合物优选早已存在于该生长培养基中。然而，还应该考虑，在转移后向生长培养基中加入选择化合物。如果在转移后加入选择化合物，那么优选转移后立即、一天、两天、三天或四天加入该化合物。优选地，通过利用含有选择化合物的溶液灌溉外植体加入所述选择化合物，特别是一周一次或两次。
[0144]优选地，所述生长培养基还包含植物生长因子，特别是IAA。当将外植体转移到生长培养基中时，所述植物生长因子优选早已存在于该生长培养基中。然而，还应该考虑，在转移后向生长培养基中加入选择化合物(参见上文)。所述植物生长因子优选允许根诱导。
[0145]如上所阐明，生长培养基还该包含足以允许选择转基因细胞的量的选择化合物。培养基中选择化合物的充足量取决于待转化的植物以及选择化合物本身。然而本领域技术人员可以立即确定选择化合物的充足量。例如，通过比较实验可以确定充足量，在所述比较实验中测试了选择化合物的多种量。一般而言，如果未曾用相应选择标记的植物表达盒转化的细胞的生长被抑制，而已经用所述植物表达盒转化成功转化的细胞却能够生长(并因此发生细胞分裂)，那么可认为选择化合物的量是充足的。在下文中给出了特定选择化合物的优选量，认为所述优选量足以允许选择转基因细胞。
[0146]如果选择标记基因编码AHAS或突变的AHAS，所述生长培养基优选包含优选
0.5 μ 1Μ-25 μ Μ,更优选I μ Μ-10 μ Μ,并且甚至更优选I μ Μ-5 μ Μ,最优选I μ Μ-3 μ M的量的至少一种咪唑啉酮除草剂(即相应的选择化合物)，特别是灭草烟。还优选用含有上述量的选择化合物的溶液对外植体进行灌溉。在实施例中给出了灭草烟的其他优选量。
[0147]如果选择标记基因针对D-氨基酸强加的毒性效应赋予抗性或增强的耐受性(特别是如果标记基因编码D-丝氨酸脱氨酶)，那么所述生长培养基优选包含0.05mM-100mM,优选0.lmM-50mM,并更优选5mM_7.5mM的量的至少一种D-氨基酸,特别是D-丝氨酸。还优选用含有上述量的选择化合物的溶液对外植体进行灌溉。
[0148]其他选择化合物的优选浓度例如是:
[0149]利用膦丝菌素抗性基因(bar)作为选择标记，膦丝菌素可以以约l_75mg/l的浓度包括在培养基中。用于选择的典型浓度是约1-约15mg / I。用于选择的优选浓度是约3_5mg / I。
[0150]利用卡那霉素抗性基因(新霉素磷酸转移酶，NPTII)作为选择标记，卡那霉素可以以约3-200mg/l的浓度包括在培养基中。用于选择的典型浓度是5-50mg/l。
[0151]已知一般通过含有选择剂的溶液喷洒植物/外植体或通过将选择化合物加入到所述植物/外植体的叶上来与选择化合物接触来选择植物。然而，在本发明的上下文中，所述选择化合物应该存在于生长培养基中。因此，其被外植体的非转基因部分吸收并易位到上胚轴及以上部分，而不是通过含有选择剂的溶液喷洒植物/外植体或通过将选择化合物加入到所述植物/外植体的叶上来接触该植物/外植体。
[0152]在本发明方法的其他步骤d)中，应该允许所述外植体形成枝条并且应该允许该枝条伸长。如果已经进行了步骤bl)，应该允许所形成的枝条(或形成的枝条原基)伸长。所形成的/伸长的枝 条优选包含这样的植物细胞，其包含所述选择标记基因的所述至少一个植物表达盒。
[0153]可以在体外或离体条件下进行步骤d)。优选地，如果生长培养基是植物组织培养基，那么在体外条件下进行步骤d)。如果生长培养基是水培培养基、土壤或腐殖土，那么优选在离体条件下，并因而在非无菌条件下进行步骤d)。
[0154]枝条水培培养基上的伸长是有利的，因为与在植物组织培养基上6-8周相比，其仅需要2周来获得伸长的枝条。由此，用于产生转基因植物所需要的时间可以显著减少。
[0155]本发明的方法优选包含进一步的步骤e)，其包括从在步骤d)中所形成和/或伸长的所述枝条，并因此从来自步骤d)的小植株再生转基因植物。所再生的植物优选包含插入到其基因组中的多核苷酸，所述多核苷酸包含所述选择标记基因的所述至少一个植物表达盒。
[0156]在优选的实施方案中，步骤e)包括以下步骤:
[0157]el)从外植体分离步骤d)中获得的伸长的枝条，
[0158]e2)将所分离的伸长的枝条转移到生长培养基中，和
[0159]e3)从所述伸长的枝条再生转基因植物。
[0160]在步骤el)中，仅优选分离伸长的枝条。本领域技术人员能够立即确定是否认为枝条是伸长的。优选地，分离的伸长的枝条是形成具有全三叶的叶的枝条。如果已经转化了大豆外植体，那么分离具有伸长的茎的枝条，所述茎具有优选至少2cm，或更优选至少3cm，或甚至更优选至少5cm的长度。
[0161]可以通过认为适当的任何方法从外植体分离伸长的枝条。优选地，通过使用一把剪刀从外植体切割伸长的枝条来完成分离。
[0162]应该将所分离的伸长的枝条转移到生长培养基中。已经在上文中描述了术语“生长培养基”。优选地，所述生长培养基是水培培养基。用于再生植物的生长培养基可以或可以不包含用于选择标记基因的选择化合物。优选地，其包含所述选择化合物。将分离的枝条转移到生长培养基中，以诱导根的形成。根形成优选耗费1-2周。植物可以在生长培养基上生长至成熟。然而，优选将发育出根的小植株转移到土壤中，并将它们在土壤上培养至完全成熟(例如，如果在步骤e2中已经将它们转移到水培培养基中)。在转移到土壤中之后并且在转移到温室之前，可以将生根的枝条在生长室中保持1-3周。
[0163]在进一步的步骤e4)中，允许再生的植物发育出种子。优选地，在进一步的步骤e5)中收集种子。优选地，种子包含的细胞包含这样的多核苷酸，其包含本发明方法的选择标记基因的至少一个植物表达盒(参见，例如步骤a)，并因此转化有所述植物表达盒。优选地，利用所述植物表达盒稳定转化所述细胞。如本文所用，术语“稳定转化”优选表示包含选择标记基因的至少一个植物表达盒的多核苷酸被整合到细胞的基因组中。
[0164]在本发明方法甚至更优选的实施方案中，在不从所述外植体分离伸长的枝条的情况下再生步骤e)的植物。植物可以在生长培养基上生长至成熟。然而，优选将具有发育出根的小植株转移到土壤中并将它们在土壤上培养至完全成熟。优选，允许植物开花。更优选地，允许植物结种子。在进一步的步骤中，可收集所结出的种子。优选地，种子包含的细胞包含这样的多核苷酸，其包含本发明方法的选择标记基因的至少一个植物表达盒(参见，例如步骤a)，并因此转化有所述植物表达盒。优选地，利用所述植物表达盒稳定转化所述细胞。
[0165]在不从外植体分离伸长的枝条的情况下进行步骤e)，再生植物，其包含非转基因的上胚轴和/或下胚轴组织，即未用包含选择标记的至少一个植物表达盒的多核苷酸转化的组织，和来自转化的目标组织的转化细胞的转基因组织/器官，如茎、叶、花和/或种子。所述转基因组织/器官包含含有选择标记的至少一个植物表达盒的多核苷酸。
[0166]因此，本发明涉及通过本发明的方法获得的或可获得的植物。在一个实施方案中，通过本发明的方法获得的或可获得的植物是复合植物。复合植物是这样的植物，其包含非转基因部分，特别是上胚轴和/或下胚轴组织和来自转化植物细胞的转基因部分。通过在选择条件下在野生型上胚轴和/或下胚轴组织上诱导转基因枝条，然后在非选择条件下将包含转基因枝条的野生型上胚轴和/或下胚轴组织转变到生根步骤。在本发明方法获得的或可获得的植物的背景中的“非转基因的”表示，上文提及的植物的组织或部分不包含并因而未转化有包含选择标记的至少一个表达盒的多核苷酸。
[0167]优选地，所述植物已经开花。更优选地，所述植物已经结种子。最优选地，该植物所结的种子包含转化的多核苷酸，其包含选择标记的至少一个表达盒。因此，所转化的多核苷酸将被传递到下一代。图3显示了合成的(composite)植物。
[0168]本发明是有利的，理由如下:
[0169]一般而言，通过利用合适的农杆菌菌株转化易于农杆菌介导的转化的植物组织获得转基因植物。共培养之后，外植体在枝条诱导培养基上进行培养并通过使用选择标记基因选择转基因枝条。枝条伸长后，从外植体上分离枝条并在根诱导培养基上诱导根生长。一般而言，在体外条件下，即无菌条件下进行所有这些步骤。因此，在无菌条件下进行许多步骤。这增加了真菌或细菌污染的风险。此外，上述方案是非常耗时的。例如，当如上述转化大豆时，转化耗费高达100天或甚至更长时间。
[0170]然而，当应用本发明的方法时，可以缩短用于大豆转化的时间轴并可以在50-60天内获得生根的转基因大豆植物。具体而言，当仅在枝条诱导培养基上短时间培养外植体时，和/或在不从外植体分离伸长的枝条的情况下培养植物至成熟时，可以缩短时间轴。这已经显示用于多种大豆品种如93061、Williams82、Stoddard和Jake以及用于根癌农杆菌和毛根农杆菌。
[0171]根据本发明的方法，将外植体垂直置于生长培养基上，例如土壤、腐殖土或水培培养基，其剩余的下胚轴部分插入到生长培养基中，例如水培培养基，像Oasis? wedges.,然而，尽管外植体包含的转化植物细胞不直接与包含选择化合物的生长培养基表面接触，但选择已经显示是有效的。仅非转化的下胚轴/子叶组织直接与生长培养基，并因而与选择化合物接触。因此，根据本发明进行的研究结果是令人惊奇的。
[0172]此外，水培培养基的使用是有利的，因为其与其他系统，例如植物组织培养基相比显著减少了枝条伸长所需要的时间。由此，用于产生转基因植物所需要的总时间可以显著减少。
[0173]此外，当应用本发明的方法时，可以减少在体外条件下进行的步骤数量，导致污染的风险降低。
[0174]此外，当在不从外植体分离伸长的枝条的情况下进行步骤e)时，可以减少用于获得转基因植物和/或转基因种子所需要的步骤数量。
[0175]上文在本发明的第一个方法的上下文中给出的定义和解释适用于下文描述的本发明的方法(除非另有说明)。
[0176]此外，本 发明涉及产生转基因植物的方法，其包括以下步骤:
[0177](i)提供损伤的可转化外植体,其包含至少一个子叶,和初生叶节或更高叶节的损伤的分生组织(特别是初生叶节或更高叶节的损伤的腋生分生组织)，
[0178](ii)利用包含选择标记基因的至少一个植物表达盒的多核苷酸转化所述外植体所包含的细胞，
[0179](iii)将所述外植体转移到枝条诱导培养基中并在所述枝条诱导培养基上培养所述外植体，所述枝条诱导培养基包含针对所述选择标记基因的至少一种选择化合物，由此允许包含植物细胞的至少一个从头形成的枝条的形成，所述植物细胞包含选择标记基因的所述至少一个植物表达盒，
[0180](iv)分离包含所述至少一个从头形成的枝条的所述初生叶节或更高叶节的分生组织区并将所述分生组织区转移到水培培养基上，所述水培培养基包含针对所述选择标记基因的至少一种选择化合物，并允许所述至少一个从头形成的枝条伸长，和
[0181](V)从所述如此来源的小植株再生转基因植物。
[0182]优选地，上述方法的步骤(i)和(ii)对应于该说明书中描述的第一种方法的步骤(a)和(b)。此外，损伤的可转化外植体还可以包含本文其他地方描述的下胚轴或其部分。然而，还优选所述损伤的可转化外植体不包含下胚轴组织。优选地，通过从幼苗去除根和下胚轴或其部分获得外植体。还可以去除一个子叶。当然，所述损伤的可转化外植体包含上胚轴。[0183]优选地，在体外条件下进行步骤(i)和(ii)。
[0184]优选地，上述方法的步骤(iii)对应于该说明书中描述的第一种方法的步骤(bl)。通过进行步骤(iii)，优选允许外植体，特别是共培养的外植体形成包含植物细胞的枝条(枝条从头形成)，所述植物细胞包含针对所述选择标记基因的所述至少一种选择化合物。优选地，所述枝条诱导培养基包含允许诱导枝条的至少一种植物生长因子。在本文其他地方描述了允许诱导枝条，即用于枝条从头形成的优选植物生长因子。优选地，还在体外条件下进行步骤(iii)。
[0185]将外植体优选在所述枝条诱导培养基上进行培养，直至已经出现从头形成的枝条。因此，可以在枝条诱导培养基上将外植体培养高达5周。根据上述方法，在将外植体转移到如下文所述的生长培养基中之前，优选将所述外植体在枝条诱导培养基上培养3-5周，更优选3-4周，甚至更优选3周。还应该考虑，在枝条诱导培养基上培养外植体。
[0186]在枝条诱导培养基上进行培养之后，初生叶节或更高叶节的分生组织区包含新形成的叶或枝条结构的群体(cluster)。因此,枝条来自枝条群体(枝条聚集体)。优选地，从头形成的枝条的至少一个(特别是一个)包含植物细胞，其包含针对所述选择标记基因的所述至少一种选择化合物。
[0187]群体包含的一些枝条可以是非转基因的。然而，优选至少一个从头形成的枝条包含植物细胞，其包含针对所述选择标记基因的所述至少一种选择化合物。
[0188]在步骤iv)，从外植体分开，并因此分离初生叶节或更高叶节的分生组织区(并因此，分生组织)，其包含至少一个从头形成的枝条(包含啥有所述选择标记基因的所述至少一个植物表达盒的植物细胞)。优选地，通过从上胚轴分离而从外植体上分离所述分生组织区。可以通过认为适当的任何方法从外植体进行分离。优选地，通过使用一把剪刀从外植体切割分生组织区来完成分离。`所分离的分生组织区优选包含上胚轴的部分。
[0189]然后优选通过将其部分插入到水培培养基中，以将所分离的分生组织区转移到水培培养基中。(对于优选的水培培养基，参见本文其他地方，特别是该说明书描述的第一种方法的步骤C))。如果所分离的分生组织区包含上胚轴的部分，优选将上胚轴的所述部分插入到水培培养基中。优选地，将所述分生组织区以向上的位置插入到水培培养基中。
[0190]所述水培培养基优选包含针对所述选择标记基因的至少一种选择化合物(对于细节，也参见第一种方法的步骤c))。此外，在转移后，应该允许包含植物细胞的至少一个枝条伸长，所述植物细胞包含所述选择标记基因的所述至少一个植物表达盒。此外，应该允许所述至少一个枝条形成根。这可以通过加入合适的植物生长因子来完成。由此，获得转化有包含选择标记基因的至少一个植物表达盒的多核苷酸的小植株。
[0191]与步骤(i)-(iii)相反，步骤(iv)应该优选在非无菌，并因此在离体条件下进行。
[0192]在进一步的步骤(V)中，从来自步骤(iv)的小植株再生植物。所再生的植物优选包含插入到其基因组中的包含所述选择标记基因的所述至少一个植物表达盒的多核苷酸。优选地，允许再生的植物结种子。优选地，收集所述种子。优选地，种子包含的细胞包含这样的多核苷酸，其包含本发明方法的选择标记基因的至少一个植物表达盒(参见，例如步骤a)，并因此转化有所述植物表达盒。优选地，利用所述植物表达盒稳定转化所述细胞。如本文所用，术语“稳定转化”优选表示包含选择标记基因的至少一个植物表达盒的多核苷酸被整合到细胞的基因组中。[0193]有利地，已经显示在为本发明进行的研究的上下文中，在水培培养基上，优选离体下促进枝条伸长和根形成与在其他系统上促进枝条伸长和/或根形成相比，已经极大地减少了产生转基因植物中的时间轴。例如，用于枝条伸长所需要的时间可以从6-10周减少到约28天。
[0194]该说明书中引用的所有文献的全部内容以及在说明书中明确提及的内容引入作为参考。
[0195]在下文中，公开了本发明的优选实施方案。上文给出的定义和解释也适用。
[0196]实施方案
[0197]1.用于产生转基因植物的方法，其包括以下步骤:
[0198]a)提供损伤的可转化外植体，其包含下胚轴或其部分、至少一个子叶，和选自以下的损伤组织: [0199]1.初生叶节或更高叶节的损伤的分生组织，
[0200]i1.子叶节的损伤的分生组织，和
[0201]ii1.损伤的上胚轴组织
[0202]b)利用包含选择标记基因的至少一个植物表达盒的多核苷酸转化所述外植体所包含的细胞，
[0203]c)通过将所述外植体的下胚轴或其部分插入到生长培养基中来将所述外植体转移到所述生长培养基中，所述生长培养基包含针对所述选择标记基因的至少一种选择化合物，
[0204]d)允许所述外植体形成枝条和/或允许该枝条伸长，所述枝条包含植物细胞，所述植物细胞包含含有所述选择标记基因的至少一个植物表达盒的所述多核苷酸，和
[0205]e)从所述枝条再生转基因植物。
[0206]2.实施方案I的方法，其中通过共培养所述外植体与包含T-DNA的农杆菌进行步骤b)，所述T-DNA包含含有选择标记基因的至少一个植物表达盒的多核苷酸。
[0207]3.实施方案I的方法，其中步骤a)中的外植体来自6_10天龄幼苗。
[0208]4.实施方案2和3的方法，其中所述共培养允许转化损伤的分生组织包含的细胞，以便获得嵌合外植体。
[0209]5.实施方案1-4任一项的方法，其中所述方法还包括步骤bl)，即将所述外植体转移到枝条诱导培养基上并在所述枝条诱导培养基上培养所述外植体。
[0210]6.实施方案1-4任一项的方法，其中在步骤b)后立即进行步骤C)。
[0211]7.实施方案1-6任一项的方法,其中在将所述外植体转移到生长培养基中之后在离体条件下培养所述外植体。
[0212]8.实施方案1-7任一项的方法，其中步骤e)包括以下步骤:
[0213]el)从外植体分离步骤d)中获得的伸长的枝条，
[0214]e2)将所分离的伸长的枝条转移到生长培养基中，和
[0215]e3)从所述伸长的枝条再生转基因植物。
[0216]9.实施方案1-7任一项的方法，其中在不从所述外植体分离伸长的枝条的情况下再生步骤e)中的转基因植物。
[0217]10.实施方案1-9任一项的方法，其中步骤c)中的所述生长培养基是水培培养基。[0218]11.实施方案10的方法，其中所述水培培养基是基于甲醛或纤维素的泡沫。
[0219]12.实施方案1-11任一项的方法，其中所述选择标记基因是突变的AHAS基因(乙酰乳酸合酶基因)或针对D-氨基酸强加的毒性效应赋予抗性或增强的耐受性的标记基因，特别是编码D-丝氨酸脱氨酶、D-氨基酸氧化酶，或D-丙氨酸转氨酶的标记基因。
[0220]13.实施方案12的方法，其中所述选择标记基因是突变的AHAS基因，并且其中所述选择化合物是咪唑啉酮除草剂，特别是灭草烟。
[0221]14.实施方案1-13任一项的方法，其中所述植物是双子叶植物。
[0222]15.实施方案1-14任一项的方法，其中植物选自大豆属、苜蓿属和菜豆属。
[0223]16.实施方案15的方法，其中所述植物是大豆。
[0224]17.植物，其可以通过实施方案9的方法获得。
[0225]18.实施方案17的植物，其中所述植物已经开花。
[0226]19.实施方案17和18的植物，其中所述植物已经结种子。
[0227]下图显示:
[0228]图1A:外植体的制备:通过从7-8天龄大豆幼苗去除大部分的下胚轴、一个子叶和所有预先形成的叶(包括 顶端分生组织)来制备外植体。
[0229]图1B:损伤的可转化大豆外植体
[0230]图1C:与农杆菌的共培养。将大豆外植体与农杆菌共培养约5天。
[0231]图2A:来自转化的初生叶节的具有成形的叶/枝条结构的外植体。已经将外植体以向上的位置插入到生长培养基中，以便所转化的细胞不直接与包含选择化合物的生长培
养基接触。
[0232]图2B:从外植体分离伸长的枝条。分离后，枝条各自生根。
[0233]图3A:具有来自转化植物细胞的非转化(野生型)下胚轴和上胚轴转基因部分的复合植物。为了获得该植物，已经转化了初生叶节的分生组织。与图2B中显示的植物相反，伸长的枝条不是从外植体上分离的。
[0234]图3B:从水培培养基上的幼苗外植体的初生叶节区伸长的转基因枝条(含有DsRed基因)
[0235]以下实施例仅旨在阐明本发明。它们不应以任何方式限制本发明的范围。
实施例
[0236]实施例1.大豆种子的灭菌和萌发
[0237]在具有氯气的干燥器中对大豆种子进行灭菌，所述氯气是通过向100ml漂白剂(5.25%次氯酸钠)中逐滴加入3.5mll2N HCI来产生的。24-48小时后，从干燥器中移出种
子并在使用前在室温下短时间储存。为了种子萌发,将大约30-50粒种子置于P丨antCon?容器中的固体种子萌发培养基上并在27°c下生长7-8天。
[0238]实施例2.用于转化的农杆菌培养物和外植体的制备
[0239]通过将携带想要的双元载体的农杆菌(例如根癌农杆菌或毛根农杆菌)划线到含有适当抗生素，如卡那霉素或壮观霉素的固体YEP生长培养基上来制备农杆菌细胞培养物。它们在28°C培养箱中生长。大约2天后，(利用无菌牙签)挑取一个或几个菌落并接种到含有适当抗生素(卡那霉素或壮观霉素)的50ml液体YEP培养基中。然后将其置于振荡器上并在200-250转/分钟(28°C )下振荡约24小时或直至达到1.0-1.5的0D66(I。通过将等体积的农杆菌悬浮液与甘油混合来制备农杆菌甘油工作贮存液。将各160-170 μ I农杆菌贮存液作为等分试样装入200 μ IEppendorf管中，然后在储存在_80°C，直至使用。在农杆菌感染外植体前一天，将100-150 μ I农杆菌工作贮存液吸入400ml离心瓶中100_150ml的YEP中。将所述离心瓶置于振荡器上并在28°C下振荡过夜或直至达到1.0-1.5的0D66(I。
[0240]在进行转化实验的当天，通过在5，OOOg下离心8分钟来收集农杆菌。将沉淀在液体共培养培养基中重悬浮至想要的密度(OD66tl=L 5)并在使用前在室温下放置至少30分钟。
[0241]下表显示了液体共培养培养基(pH5.4)的组成。
[0242]
【权利要求】
1.用于产生转基因植物的方法，其包括以下步骤: a)提供损伤的可转化外植体，其包含下胚轴或其部分、至少一个子叶和选自以下的损伤组织: .1.初生叶节或更高叶节的损伤的分生组织， i1.子叶节的损伤的分生组织，和 ii1.损伤的上胚轴组织， b)利用包含选择标记基因的至少一个植物表达盒的多核苷酸转化所述外植体所包含的细胞， c)通过将所述外植体的下胚轴或其部分插入到生长培养基中来将所述外植体转移到所述生长培养基中，所述生长培养基包含针对所述选择标记基因的至少一种选择化合物，其中将所述外植体以向上的位置置于所述生长培养基中， d)允许所述外植体形成枝条和/或允许该枝条伸长，所述枝条包含植物细胞，所述植物细胞包含含有所述选择标记基因的所述至少一个植物表达盒的所述多核苷酸，和 e)从所述枝条再生转基因植物。
2.权利要求1的方法，其中通过共培养所述外植体与包含T-DNA的农杆菌进行步骤b)，所述T-DNA包含含有所述选择标记基因的至少一个植物表达盒的多核苷酸。
3.权利要求1的方法，其中步骤a)中的外植体来自6-10天龄幼苗。
4.权利要求2和3的方法，其中所述共培养允许转化损伤的分生组织包含的细胞，以便获得嵌合外植体。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述方法还包括的步骤bl)，即将所述外植体转移到枝条诱导培养基上，并在所述枝条诱导培养基上培养所述外植体。
6.权利要求1-4任一项的方法，其中在步骤b)后立即进行步骤C)。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中在将所述外植体转移到生长培养基中之后，在离体条件下培养所述外植体。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中步骤e)包括以下步骤: el)从外植体分离步骤d)中获得的伸长的枝条， e2)将所分离的伸长的枝条转移到生长培养基中，和 e3)从所述伸长的枝条再生转基因植物。
9.权利要求1-7任一项的方法，其中在不从所述外植体分离伸长的枝条的情况下再生步骤e)中的转基因植物。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中步骤c)中的所述生长培养基是水培培养基，特别是其中所述水培培养基是基于甲醛或纤维素的泡沫。
11.权利要求1-11任一项的方法，其中所述选择标记基因是突变的AHAS基因(乙酰乳酸合酶基因)，或针对D-氨基酸强加的毒性效应赋予抗性或增强的耐受性的标记基因，特别是编码D-丝氨酸脱氨酶、D-氨基酸氧化酶，或D-丙氨酸转氨酶的标记基因。
12.权利要求12的方法，其中所述选择标记基因是突变的AHAS基因，并且其中所述选择化合物是咪唑啉酮除草剂，特别是灭草烟。
13.权利要求1-13任一项的方法，其中所述植物是双子叶植物，优选其中所述植物的属选自大豆属、苜蓿属和菜豆属，更优选其中所述植物是大豆。
14.用于产生转基因植物的方法，其包括以下步骤: (i)提供损伤的可转化外植体，其包含至少一个子叶，和初生叶节或更高叶节的损伤的分生组织(特别是初生叶节或更高叶节的损伤的腋生分生组织)， (?)利用包含选择标记基因的至少一个植物表达盒的多核苷酸转化所述外植体所包含的细胞， (iii)将所述外植体转移到枝条诱导培养基中，并在所述枝条诱导培养基上培养所述外植体，所述枝条诱导培养基包含针对所述选择标记基因的至少一种选择化合物，由此允许包含植物细胞的至少一个从头形成的枝条的形成，所述植物细胞包含所述选择标记基因的所述至少一个植物表达盒， (iv)分离包含所述至少一个从头形成的枝条的所述初生叶节或更高叶节的分生组织，并将所述分生组织区转移到水培培养基上，所述水培培养基包含针对所述选择标记基因的至少一种选择化合物，并允许所述至少一个从头形成的枝条伸长，和 (v)从所述如此来源的小植株再生转基因植物。
15.通过权利要求9的方法获得的植物，特别是通过权利要求9的方法获得的已经开花的植物。
【文档编号】C12N15/82GK103826439SQ201280036070
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年7月20日 优先权日:2011年7月22日
【发明者】Y-F·常, A·S·万古丽, L·格里斯特, H·图特勒, H·P·洪, P·奥尔霍夫特 申请人:巴斯夫植物科学有限公司