一种蜕皮激素受体基因USP dsRNA及其在控制蚜虫危害中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种蜕皮激素受体相关基因USP?dsRNA在控制蚜虫危害中的应用。本发明提供的dsRNA，为由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。本发明的实验证明，本发明得到麦长管蚜蜕皮激素受体相关基因USP?cDNA的dsRNA，采用体外饲喂dsRNA方法，可抑制麦长管蚜体内USP基因的表达，导致麦蚜生长发育受阻并产生致死效应。
【专利说明】-种蜕皮激素受体基因 USP dsRNA及其在控制蚜虫危害中 的应用 【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种蜕皮激素受体基因 USP dsRNA及其在控 制蚜虫危害中的应用。 【背景技术】
[0002] 麦蚜是危害中国小麦生产的主要害虫之一，据统计，中国每年小麦蚜虫危害面积 可高达0. 17亿公顷，占小麦总种植面积的62%，造成减产15% -30%，严重时可高达50%。 近年来，由于全球气候变暖、耕作制度变化等因素，使蚜虫的繁殖能力和适应性显著增强， 其危害日趋严重。目前，蚜虫防治以喷洒农药为主，但大量使用农药，不仅对人畜有害，而且 造成了严重的环境污染。培育抗蚜虫小麦和蔬菜品种是防止蚜虫危害的最有效途径，但由 于现有种质资源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效。挖掘和利 用新型抗蚜基因并通过基因工程培育小麦抗蚜新种质具有重要意义。
[0003] 植物介导的RNAi技术已成为农作物抗虫基因工程的热点之一，通过寄主植物表 达相应昆虫特异基因的dsRNA，昆虫取食植物后沉默其相应的基因从而达到控制害虫危 害的目的。RNAi现象其作用过程是双链RNA(dsRNA)进入生物体内，被Dicer酶切割成 21-23nt的siRNA，siRNA与RNA诱导沉默复合物结合，与互补序列的靶mRNA结合，被Dicer 识别，造成靶基因表达量的下降。近年来，利用dsRNA体外饲喂或注射来筛选RNA靶标基 因，导致靶标基因表达和沉默，已经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析。 孟山都公司通过植物介导的昆虫肠道特异基因 RNAi技术成功获得了抗玉米根螟的转基因 玉米，有效缓解了长期应用Bt转基因玉米诱发昆虫产生抗性等问题，目前已完成生产性试 验。棉铃虫肠道中特异P450基因可提高棉铃虫幼虫对棉花次生代谢物质和棉酚的耐受性， 试验表明，利用表达棉铃虫P450基因 dsRNA的转基因烟草和棉花叶片饲喂棉铃虫幼虫，可 导致幼虫体内P450基因的表达量下降，同时幼虫发育受阻，表现出抗棉铃虫性能；Zha等从 褐飞虱中肠中克隆了 3个高度表达的基因：NlHTl、Nlcar和Nltry，构建载体，转化水稻，褐 飞虱取食转基因水稻后，体内3种基因的mRNA表达水平下降了 40%到70%，并且在水稻的 筛管部发现了 dsRNA和siRNA的存在。Pitino等将桃蚜的MpC002 (主要在唾液腺中表达） 和Rack-Ι (主要在肠道中表达）2个基因分别导入烟草和拟南芥中，用转基因植物饲喂桃 蚜，导致桃蚜体内的MPC002或Rack-Ι的表达量降低了高达60%，蚜虫的产仔数目减少。
[0004] 小麦抗蚜虫种质资源缺乏，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效，每年给农业生 产造成巨大经济损失。迫切需要挖掘和鉴定新型抗蚜基因并通过基因工程育种提高小麦抗 蚜特性。
[0005] 蚜虫是不完全变态发育，发育过程中要经历蜕皮。已知蜕皮激素与它的核受 体EcR和异源二聚体配体USP在细胞核内形成转录复合体，调控EcR和USP激素接受子 3 (HR3)，E75, Broad Complex (BR-C)，E93, bFTZ-Fl和E74等转录因子的表达，这些转录因子 再进一步调控下游效应基因如蛋白酶的表达，进而调控蚜虫的蜕皮、生长发育和繁殖。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供了 dsRNA。
[0007] 本发明提供的dsRNA，为由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互补序列所示 的核苷酸组成的双链RNA。
[0008] 上述dsRNA的编码基因或含有该编码基因的DNA片段也是本发明保护的范围，上 述dsRNA的编码基因具体为序列表中序列1所示的核苷酸。
[0009] 上述dsRNA或上述的编码基因在如下1)_4)中至少一种中的应用也是本发明保护 的范围：
[〇〇1〇] 1)防治蚜虫或制备防治蚜虫产品；
[0011] 2)促进蚜虫死亡或制备促进蚜虫死亡产品；
[0012] 3)抑制蚜虫生长中或制备抑制蚜虫生长产品；
[0013] 4)抑制蚜虫体内生长发育相关基因 USP的表达或在制备抑制蚜虫体内生长发育 相关基因 USP的表达广品。
[0014] 上述应用为将上述dsRNA导入蚜虫，实现防治蚜虫、促进蚜虫死亡、抑制蚜虫生长 和/或抑制蚜虫体内生长发育相关基因 USP的表达；所述导入具体为饲喂；
[0015] 所述蚜虫具体为麦长管蚜。
[〇〇16] 本发明的另一个目的是提供具有功能的产品，其活性成分为上述dsRNA或其编码 基因；
[0017] 所述功能为如下1)-4)中任意一种：1)防治蚜虫；2)促进蚜虫死亡；3)抑制蚜虫 生长；4)抑制蚜虫体内生长发育相关基因 USP(序列1)表达。
[0018] 所述蚜虫具体为麦长管蚜。
[0019] 本发明的实验证明，本发明得到麦长管蚜蜕皮相关基因 USP的dsRNA，采用体外饲 喂dsRNA方法，进行了利用RNAi技术沉默麦长管蚜体内USP基因，导致麦长管蚜产生致死 效应，并且随着dsRNA浓度增大和饲喂时间延长，麦长管蚜的死亡率均逐渐增加。结果表明 蚜虫生长发育相关基因 USP的保守序列可应用于通过植物介导的RNAi技术提高小麦抗蚜 性的研究。 【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为基因 USP和GFP的PCR扩增情况
[0021] 图2为目的基因和对照基因的dsRNA 【具体实施方式】
[0022] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0023] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0024] 下述实施例中麦长管蚜（钱幼亭，周广和，张淑香，张向才.麦长管蚜有性世代的 研究.植物保护，1982, 1:14-15。公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得）由中国 农业科学院植物保护研究所提供，饲养蚜虫的小麦品种为科农199,将蚜虫接种到小麦幼苗 上，放入人工气候箱中（温度（20±2)°C，湿度60%-80%，光周期L : D = 16 : 8)进行 繁殖。
[0025] 质粒提取试剂盒购自Biomega公司，内切酶BamH I、EcoR V及Hiscribe T7体外 转录试剂盒购自NEB公司，大肠杆菌菌株DH5 α、反转录试剂盒购自北京全式金公司，rTaq DNA 聚合酶购自 TaKaRa 公司，MinElute PCR Cleaning Kit、MinElute Gel Extraction Kit、RNA Cleaning Kit购自Qiagen公司，各种氨基酸及其它试剂均购自北京拜尔迪公司。
[0026] 实施例1、生长发育相关基因 USP dsRNA的获得
[0027] 1、麦长管蚜总RNA的提取和cDNA的合成
[0028] 分别取约20头麦长管蚜，按照北京全式金公司的Trizol试剂盒说明书提取总 RNA，用RNA Cleaning Kit进行纯化，反转录合成cDNA第一链，操作步骤均参考试剂盒说明 书。
[0029] 2、引物设计与基因克隆
[0030] 根据豌豆蚜和桃蚜USP基因保守序列（genbank登录号分别为NM_001161668和 EF174335,提交时间分别为2011年3月10日和2007年4月17日），利用Primer Primer5.0 软件设计引物P1 (表1)，由北京华大基因公司合成，以麦长管蚜cDNA为模板扩增并测序得 到麦长管蚜蜕皮相关基因 USP。绿色荧光蛋白基因（GFP)片段从国家小麦改良中心实验室 保存的GFP质粒上扩增，利用Primer Primer5. 0软件设计引物P2 (表1)。
[0031] PCR 反应体系为 10 X PCR Buffer5 μ L、dNTP (2. 5mmol · Γ1) 4 μ L、rTaqO. 5 μ L， Forward primer (20 μ mol · I71) 1 μ L、Reverse primer (20 μ mol · I71) 1 μ L、cDNA/GFP 质粒 lyL，用 ddH20 补足至 50yL。PCR 的反应条件为 94°C 4min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s， 39 个循环；72°C lOmin ;4°C保存。
[0032] 以麦长管蚜的cDNA为模板，用PI作为引物进行扩增，得到402bp PCR产物（含 40bp的T7启动子序列），经过测序，该402bp PCR产物具有序列表中的序列1 (可人工合 成）所示的核苷酸。
[0033] 以GFP质粒为模板，用P2作为引物进行扩增，得到360bp PCR产物（含40bp的T7 启动子序列），其具有序列表中的序列3 (可人工合成）所示的核苷酸。
[0034] 将上述PCR电泳结果如图1所示，M :Trans2K DNA marker ;1 :USP基因；2 :GFP，可 以看出得到目的片段。
[0035] 表1为PCR扩增引物
[0036]
【权利要求】
1. dsRNA，为由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的 双链RNA。
2. 权利要求1中所述dsRNA的编码基因或含有该编码基因的DNA片段。
3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述dsRNA的编码基因的核苷酸序 列含有序列表中的序列1。
4. 权利要求1所述dsRNA或权利要求2所述的编码基因在如下1)-4)中至少一种中的 应用： 1) 防治蚜虫或制备防治蚜虫产品； 2) 促进蚜虫死亡或制备促进蚜虫死亡产品； 3) 抑制!牙虫生长中或制备抑制!牙虫生长广品； 4) 抑制蚜虫体内生长发育相关基因 USP的表达或在制备抑制蚜虫体内生长发育相关 基因 USP的表达产品。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用为将权利要求1或2所述dsRNA 导入蚜虫，实现防治蚜虫、促进蚜虫死亡、抑制蚜虫生长和/或抑制蚜虫体内生长发育相关 基因 USP的表达。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于： 所述导入为饲喂。
7. 根据权利要求4-6中任一所述的应用，其特征在于： 所述蚜虫为麦长管蚜。
8. -种具有功能的产品，其活性成分为权利要求1所述dsRNA或权利要求2所述的编 码基因，所述功能为如下1)_4)中任意一种：1)防治蚜虫；2)促进蚜虫死亡；3)抑制蚜虫生 长；4)抑制蚜虫体内生长发育相关基因 USP表达。
【文档编号】C12N15/11GK104109673SQ201410328484
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】夏兰琴, 陈红梅, 孙永伟 申请人:中国农业科学院作物科学研究所