专利名称：IFN-γ受体基因(B8R)缺失的天坛株重组痘苗病毒及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及IFN-y受体基因(B8R)缺失的天坛株重组痘苗病毒减毒载 体以及基于此载体构建的表达HIV-1各种抗原(单价及多价)的IFN-y受体 基因(B8R)缺失的天坛株重组痘苗病毒艾滋病疫苗。本发明的天坛株重 组痘苗病毒减毒载体能够显著降低痘苗病毒载体的毒力，可以用于构建表 达同一病原多种抗原、不同病原多种抗原的多价重组痘苗病毒。本发明的 重组痘苗病毒艾滋病疫苗能够诱导高水平的抗人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)的体液和细胞免疫应答，并有效提高重组痘 苗病毒艾滋病疫苗的安全性及免疫原性。
背景技术：
痘苗病毒天坛株(vaccine virus TianTan strain，VTT)为我国消灭天花 作出巨大贡献，在活载体疫苗研究应用也十分活跃，重组痘苗病毒疫苗具 有效果好、对热稳定性好，接种方便，不需佐剂等优点，然而痘苗病毒接 种人体后产生较重的局部反应，特别是在一定比例的免疫缺陷患者中可引 起严重的并发症。表达某些免疫原的重组痘苗病毒未能达到理想的免疫效 果，如何能在增强重组痘苗病毒的免疫原性同时进一步提高痘苗病毒载体 的安全性，学者们作出很多深入的研究。随着新的病毒疾病不断出现，对 宿主抗病毒免疫机理的深入了解，构建表达同一病原多种抗原、不同病原 多种抗原的多价重组痘苗病毒载体，寻找更多稳定有效的外源基因插入区 意义重大。
痘苗病毒基因组编码一些特殊蛋白抑制宿主免疫系统，据文献报道和
基因分析，可知痘苗病毒天坛株B8R基因与IFN-y受体膜外区域具有高度同 源性[1]。 IFN-y在抗病毒及免疫调节方面具有重要的作用。本发明构建缺失 IFN-y受体基因的天坛株重组痘苗病毒载体，研究其毒力改变及B8R缺失区 插入外源基因表达的稳定性。进一步提高天坛株痘苗病毒载体安全性、研制表达多价抗原重组痘苗病毒载体。
HIV—1全球流行导致了极高的致病率和病死率，为防治HIV—1的感
染，传统的化学药物治疗、免疫治疗以及新的方法得以不断研究、发展，
对多数HIV感染者进行HAART，虽可有效抑制病毒血症，延缓病程，但不 能清除潜伏的病毒。保护性的疫苗接种是解决防治HIV-1感染全球性问题 的最佳途径。科学家们开展了减毒活疫苗、灭活疫苗、重组亚单位疫苗、 各种活载体疫苗(腺病毒、金丝雀痘病毒、流感病毒、痘苗病毒、狂犬病 毒、VSV、伤寒杆菌、链球菌等载体)的研究，传统的减毒活疫苗及灭活 疫苗在HIV防治中存在一些问题。虽然减毒活疫苗在SIV模型证实有效， 但在初免疫成年猕猴中存在一定致死率。被HIV-1感染的猩猩仍可被第二 种不相关的HIV-1感染。由于活减毒株风险性以及有证据表明无广泛保护 性，减毒活疫苗应用的争议尚待进一步研究。在猩猩模型有研究表明，灭 活疫苗不能保护HIV-1攻击，不能诱导CTL反应。病毒活载体疫苗和DNA 疫苗都既可以诱导细胞免疫，又可以诱导体液免疫反应，表达HIV-1抗原 重组痘苗病毒和HIV-1DNA疫苗的联合免疫成为新的疫苗研究策略。
发明内容
为了进一步提高重组痘苗病毒疫苗的安全性及有效性，本发明目的在 于提供一种同源重组构建B8R基因缺失区插入外源基因的的IFN-Y受体基 因(B8R)缺失的天坛株重组痘苗病毒VTTAB8RlacZ及其在制备重组痘 苗病毒疫苗中的应用。
具体涉及一种B8R基因缺失、表达HIV-l抗原的VTKgpeAB8R (B8R基 因缺失不带lacZ选择标记，TK区插入B7C型CN54株HIV-1 gagpol env 基因)的天土云株重组痘苗病毒 com6/"贈vacc/m'a vzWms VTKgpe的艾滋病 疫苗，该重组痘苗病毒recom6,"赠vacc/"/a vzWws VTKgpe于2004年2月24 日在北京保藏，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，其保藏号为CGMCC No.l099;涉及一种B8R基因缺失表达HIV-1抗原 的VTKgpeAB8RlacZ (B8R基因缺失为lacZ所取代，TK区插入BVC型 CN54株HIV-1 gagpol env基因)的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病疫苗； 还涉及一种B8R基因缺失、表达乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的(B8R基因缺失插入HBSAg抗原，TK区插入IL-2基因)的天坛株重组痘苗病毒 的乙型肝炎病疫苗。
本发明的目的在于提供用于以痘苗病毒VTT为母本病毒，构建B8R区缺 失，同时在该区插入各种外源基因的重组痘苗病毒转移质粒pSKB8R、 pSKB8RLacZ 、 pSKB8RNeo、 pSKB8RPNeo和它们的构建方法。
本发明提供了一种用于转移质粒pSKB8RLacZ构建的质粒pSC65，含有 该质粒的大肠埃希氏菌￡^^士/^"//已于2004年2月24日在北京保藏,保藏 单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为 CGMCC No. 1097。
本发明提供了一种用于转移质粒pSKB8Rneo构建的质粒pVI75，含有该 质粒的大肠埃希氏菌^/^n'c/n'a co/z'已于2004年2月24日在北京保藏，保藏 单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为 CGMCC No. 1098。
本发明所涉及的一种B8R基因缺失为kcZ所取代的重组病毒 VTTAB8RlacZ可以作为同源重组构建B8R基因缺失区插入外源基因的疫 苗株的亲本毒株。VTTAB8RlacZ构建方法即将痘苗病毒天坛株VTT (北 京生物制品所保藏，Tiantan株752-1 )与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF 细胞进行同源重组,经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为 lacZ所取代的重组病毒VTTAB8RlacZ。提取DNA，进行PCR扩增及DOT BLOT鉴定、检测重组病毒B8R基因缺失的稳定性，表明VTTAB8RlacZ 在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因缺失稳定。VTTAB8RlacZ在CEF 细胞连续培养传代15代插入外源基因lacZ稳定表达。重组缺失病毒 VTTAB8RlacZ在CEF、 TKH43、 CV-1细胞中的繁殖生长曲线测定，结果 表明VTTAB8RlacZ的生长曲线与VTT生长曲线相似。B8R基因缺失对重 组缺失病毒在细胞中的繁殖复制没有影响。兔皮内毒力实验表明 VTT752-l形成红肿痘疱面积显著大于VTTAB8RlacZ形成痘疱，VTT752-l 形成红肿痘疱而后出现溃破接痂，VTT厶B8RlacZ形成痘疱无溃破接痂， VTTAB8RlacZ形成痘疱消褪较VTT752-l形成痘疱消褪早。B8R基因缺失 显著降低痘苗病毒天坛株病毒毒力。
本发明涉及的一种B8R基因缺失、表达HIV-l抗原的VTKgpeAB8R (B8R基因缺失不带lacZ选择标记，TK区插入B7C型CN54株HIV-1 gagpolenv基因)的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病疫苗及一种B8R基因缺失表达HIV-l抗原的VTKgpeAB8RlacZ (B8R基因缺失为IacZ所取代，亲 本毒株VTTAB8RlacZ的TK区插入B7C型CN54株HIV-1 gagpol env基 因)的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病疫苗。即将VTKgpe (TK区插入B7C 型CN54株HIV-1 gagpol env基因的天坛株重组痘苗病毒)与转移质粒 pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组,经蓝白筛选、连续单斑纯化、 鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTKgpeAB8RlacZ，再以 VTKgpeAB8RlacZ为亲本株与pSKB8RNeo共转染CEF细胞进行同源重组, 经G418压力筛选、蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失不 带lacZ选择标记的重组病毒VTKgpeAB8R 。裸鼠毒力实验表明 VTKgpeAB8R毒力较VTKgpe显著降低，腹腔接种VTT (104pfo)及VTKgpe (10ifli)15天裸鼠死亡，接种VTKgpeAB8R(107 pfo)裸鼠存活。胞内IFN-y. 染色流式细胞仪分析、T淋巴细胞增殖、CTL检测显示B8R基因缺失显著 提高表达HIV-1基因的天坛株重组痘苗病毒特异性细胞免疫。本发明上述 所涉及的TK区
是指Tiantan株Genebank,gi6969640基因组的79799bp-81271 bp的 一 段核苷
酸序列。
本发明涉及B8R基因缺失、表达HIV-1和乙型肝炎病毒各种单价或多 价抗原的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病及乙型肝炎病疫苗。
本发明涉及B8R基因缺失、表达外源基因单价或多价抗原的天坛株重 组痘苗病毒包括重组疫苗、表达外源基因重组痘苗病毒以及它们在制 备治疗病毒病的重组痘苗病毒疫苗药物中的应用。
以上本发明所描述的技术特征目前国内外未见任何报道，所以本发明 具有创造性、新颖性和实用性。对人类病毒病的重组痘苗病毒疫苗药物治 疗将带来十分重要的意义。
图l显示转移质粒pSKB8R、 pSKB8RLacZ 、 pSKB8RNeo的构建路线 图2显示pSKB8R酶切确认分析结果，图中泳道2，3:分子量标记DL2000， DL15000 (购自大连宝生物工程有限公司)，泳道l:pSKB8R (Ndel禾口 BgLII)。图3显示pSKB8RlacZ酶切确认分析结果，图中泳道l:分子量标记 DL15000，泳道2:pSKB8RLacZ(Spel)，泳道3: pSKB8RLacZ (Sacl), 泳道4: pSKB8RLacZ(Ndel)。
图4显示pSKB8RNeo酶切确认分析结果，图中泳道l:分子量标记 DL15000，泳道2: pSKB8RNeo (BamHI和BgLII)。
图5显示pSKB8RPNeo酶切确认分析结果，图中泳道l 2:分子量标记 DL2000，15000，泳道3: pSKB8RPNeo (SaLI/SmaLI)。 图6显示重组病毒VTTAB8RlacZ、 VTKgpeAB8RlacZ、 VTKgpeAB8R构
建示意图。
图7显示PCR扩增检测重组病毒VTTAB8RlacZ B8R基因缺失
1,6: DNA标准 2 : VTTDNAPCR扩增产物(引物B8RLF、 B8RRR)
3: VTTDNA扩增产物(弓I物B8RF、 B8RRR)
图8 Dot Blot检测病毒基因组中B8R基因
提取痘苗病毒VTT752-lDNA及重组病毒VTTAB8RlacZ传代15代DNA，以 B8R基因地高辛标记探针进行Dot Blot检测。VTT752-lDot Blot结果显示 杂交印迹斑点，VTTAB8RlacZ传代15代Dot Blot结果未显示杂交印迹斑 点，表明VTTAB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因稳定缺失 图9显示重组缺失病毒VTTAB8RlacZ细胞中的繁殖曲线测定 以VTTAB8RlacZ重组病毒在CEF中增殖，其不同时间收获的病毒PFU值， 绘制病毒繁殖曲线(与TK一143、 Wish、 CV-1细胞上繁殖曲线相似)。结果 表明VTTAB8RlacZ的繁殖曲线与对照VTT繁殖曲线相似。B8R基因缺失对 重组缺失病毒在细胞中的繁殖复制没有影响。48h病毒繁殖高峰达 107PFU/ml。(生长曲线纵轴为PFU对数值)
图10 显示兔皮内毒力实验结果兔背皮内左侧接种1X10卞FU的 VTT厶B8RlacZ，右侧接种lXl()6pFlJ/ml的VTT752-l ，将0.1ml lX107pfu/ml VTTAB8RlacZ重组病毒,对兔背皮内注射后，逐日观察皮肤红肿面积，第5 天可见红肿痘疱，明显小于对照痘苗病毒，且无溃破，消褪较早。表明重 组病毒VTTAB8RlaeZ毒力比对照VTT7S2-1显著减弱。 图ll显示PCR扩增检测重组病毒VTKgpeAB8R B8R基因缺失 提取重组病毒DNA为模板，以引物B8RLF、 B8RRR进行PCR扩增。重组病毒VTKgpeAB8R由于B8R基因缺失，PCR扩增出1244 bp片段，包括B8R基 因外左侧同源序列B8RL片段583 bp、右侧同源序列B8RR片段661 bp。而 对照VTTDNA为模板扩增出2Kb片段，包括B8R基因外左侧同源序列BSRL 片段583 bp、 B8R基因818bp、右侧同源序列B8RR片段661 bp。结果表明 VTKgpeAB8R在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因稳定缺失。
图12、 Dot Blot检测病毒VTKgpeAB8R基因组中B8R基因 1、 VTT752-1 2、 VTKgpeAB8R
提取痘苗病毒VTT752-lDNA及重组病毒VTKgpeAB8R传代15代DNA，以 B8R基因地高辛标记探针进行Dot Blot检测。VTT752-lDot Blot结果显示 杂交印迹斑点，VTKgpeAB8R传代15代Dot Blot结果未显示杂交印迹斑点， 表明VTKgpeAB8R在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因稳定缺失 图13显示胞内IFN-Y.染色流式细胞仪分析结果。DNA + VTKgpeAB8R免疫 组小鼠脾细胞T淋巴细胞，在体外经表位肽刺激后，分泌正1^丫的008+T淋 巴细胞占脾脏总CD8+T淋巴细胞的百分比数显著高于DNA +VTKgpe免疫 组。VTKgpeAB8R免疫组小鼠脾细胞分泌IFN-y.CD8百分比数显著高于 VTKgpe免疫组。
图14显示T淋巴细胞增殖3H-TdR法检测结果。DNA + VTKgpeAB8R免疫 组小鼠脾细胞T淋巴细胞，在体外经表位肽刺激后，刺激指数(SI)显著 高于DNA + VTKgpe免疫组。
图15显示CTL乳酸脱氢酶法检测结果。DNA + VTKgpeAB8R免疫组小鼠
脾细胞T淋巴细胞，特异性杀伤显著高于DNA + VTKgpe免疫组。
VTKgpeAB8R免疫组高于VTKgpe免疫组
图16 Western Blot分析VTKgpeAB8R目的基因表达
1 VTT感染CEF细胞 2,3,4 VTKgpeAB8R感染CEF细胞 5预染蛋白
Marker
具体实施方案
实施例一、转移质粒的构建 1.质粒pBR-SK的构建5'PBR322画SACI画FOR
GGAGCTCCGACCGATGCCCTTGAGAGCC
3,PBR322-KPNI-RE
GGGGTACCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATG PCR扩增商业质粒pBR322包括全部功能元件的序列，记为pBR。 反应体系
反应条件94。C预变性2min; 94°C30s，68°C5 min,共35个循环；72°C7min; 4°C。
纯化并大连宝生物的KpnI和SacI共酶切PCR产物pBR，跑胶回收。
用大连宝生物的KpnI和SacI共酶切质粒pBS-SK，得到多克隆位点序列 (小片段)，记为SK，跑1.5%琼脂糖胶回收。
连接酶切回收产物pBR和SK，转化ToplO大肠杆菌感受态，并筛选出 正确克隆子，记为pBR-SK。
2.转移质粒pSKB8R的构建
在载体质粒pBR-SK插入痘苗病毒天坛株B8R基因外左侧同源序列B8RL 片段、右侧同源序列B8RR片段。见图l。采用PCR技术分别以痘苗病毒
10xPyrobest Buffer dNTPMisture (各2.5mM) 3，PBR322-KPNI-RE (50,) 5'PBR322-SACI-FOR (50, pBR322
Pyrobest DNA Polymerase(5U/ml)
5^1 0，
0，
0，
ddH20
10DNA扩增痘苗病毒天坛株B8R基因外左侧同源序列B8RL片段(引物 B8RLF、 B8RLR)右侧同、源序列B8RR片段(引物B8RRF、 B8RRR)， B8RL 片段、B8RR片段分别用BgLI彻连接，以连接产物为模板PCR扩增(引物 B8RLF、 B8RRR) B8R基因外左右侧同源序列连接大片段B8RLR。大片段 B8RLR、 pBRSK质粒分别以Kpnl/BamHI酶切、T4DNALigase连接构建带 有天坛株B8R基因外左右侧同源臂的转移质粒pSKB8R。引物序列 B8RLF : gtaataggtaccgtagcatcctattcg B8RLR : tataatagatcttatggtgttgtttg B8RRF: aactaaagatctcggtagcac B8RRR: attcgtggatccattgtaacaagatatc
B8RL片段(引物B8RLF、B8RLR) ,B8RR片段(引物B8RRF、B8RRR)，， 连接大片段B8RLR (引物B8RLF、 B8RRR) PCR扩增反应采用大连宝生物 工程有限公司的试剂盒，反应体系如下
模板DNA lpl
正、反向引物 各lpl
10xPyrobest缓冲液 5;al dNTP混合物(各2.5mM) 5(il
Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5pl ddH20 37,5pl
PCR反应条件94。C预变性2 min; 94。C30s,58。C30s,72。C30s，共20个 循环;72。C7min; 4'C。
大片段B8RLR延伸产物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯 化回收，回收产物Kpnl/BamHI共酶切(Takara公司产)。。pBRSK质粒载体 Kpnl/BamHI共酶切(Takara公司产)。用Omega公司E.Z.N.A. Gel Extraction Kit进行电泳纯化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司产)连接构建带有天 坛株B8R基因外左右侧同源臂的转移质粒pSKB8R。连接产物分别转化感 受态大肠杆菌T叩IO，涂含氨苄青霉素的LB平板，37'C培养12-16小时。提 取质粒，用相应限制性内切酶酶切分析鉴定，酶切鉴定结果分别参见图2。
3.转移质粒pSKB8RLacZ的构建
在pSKB8R左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段间插入痘苗 病毒启动子序列pE/L、 p7.5及下游LacZ序列。以质粒pSC65为模板扩增痘苗病毒启动子序列pE/L、 p7.5及下游LacZ序歹(J(引物pSC65F、 pSC65R)。 pE/L、 p7.5及下游LacZPCR扩增片段(引物pSC65F、 pSC65R)以BamHI酶 切、转移质粒pSKB8R以BgLII酶切，二者T4DNALigase连接构建转移质粒 pSKB8RLacZ。 pSKB8RLacZ带有痘苗病毒启动子序歹UpE/L、 p7,5和p7.5下 游的LacZ序列以及两侧的B8R基因夕卜同源臂。pSC65F : tctttcggatccttgttgaattagatcg pSC65R: gtttgccatacgctcacagaag
pE/L、 p7.5及下游LacZPCR扩增片段PCR扩增反应采用大连宝生物工 程有限公司的试剂盒，反应体系如下
质粒pSC65 1^1 正、反向引物(pSC65F、 pSC65R) 各1|^1
10xPyrobest缓冲液 5pl dNTP混合物(各2.5mM) 5^1
Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0，
ddH20 37，
PCR反应条件94。C预变性2 min; 94。C30s，58。C30s,72。C30s，共20个 循环；72。C7min; 4°C。
pE/L、 p7.5及下游LacZPCR扩增片段延伸产物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收，回收产物BamHI酶切(Takara公司产)。转移质 粒pSKB8R载体BgLII酶切(Takara公司产)。用Omega公司E.Z.N.A. Gel Extraction Kit进行电泳纯化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司产)连接构 建pSKB8RlacZ。连接产物分别转化感受态大肠杆菌ToplO，涂含氨节青霉 素的LB平板，37'C培养12-16小时。提取质粒，用相应限制性内切酶酶切 分析鉴定，酶切鉴定结果分别参见图3。
4转移质粒pSKB8Rneo的构建
即在pSKB8R左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段外侧插入 痘苗病毒启动子序列pH6及下游Neo序列。以质粒pVI75为模板扩增痘苗病 毒启动子序歹UpH6及下游Neo序歹!j(引物NeoF， NeoR)， BamHI、 SacII酶切 pH6+Neo片段、转移质粒pSKB8RBamHI、 SacII酶切，二者T4DNALigase 连接构建转移质粒pSKB8RNeo 。 弓|物NeoF :cgcggatcctcgatccccagattacaaacaactagg ， 弓l 物 NeoR :
tccccgcggacagatttctccgtgatagggatcg
pH6及下游Neo序列PCR扩增反应采用大连宝生物工程有限公司的试 剂盒，反应体系如下
质粒 lpl 正、反向引物(NeoF， NeoR) 各lpl 10xPyrobest缓冲液 5^1 dNTP混合物(各2.5mM) 5^1 Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5^1 ddH20 37，
PCR反应条件94。C预变性2 min; 94°C30s,58°C30s,72°C60s，共20个 循环；72。C7min; 4°C。
pH6及下游Neo序列PCR扩增片段延伸产物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收，回收产物SacII/BamHI酶切(Takam公司产)。 转移质粒pSKB8R载体SacII/BamHI酶切(Takara公司产)。用Omega公司 E.Z.N.A. Gel Extraction Kit进行电泳纯化回收.。二者T4DNALigase(Takara 公司产)连接构建转移质粒pSKB8RNeo。连接产物分别转化感受态大肠杆 菌ToplO，涂含氨苄青霉素的LB平板，37'C培养12-16小时。提取质粒，用 相应限制性内切酶酶切分析鉴定，酶切鉴定结果分别参见图4。
5转移质粒pSKB8RPNeo的构建
即在pSKB8RNeo左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段间插 入两个互为反向的痘苗病毒启动子序列pE/L、 p7.5。以质粒pSC65为模板 扩增痘苗病毒启动子序列pE/L、 p7.5及多克隆位点。pE/L、 p7.5及多克隆 位点扩增片段(引物PMF， PMR)以BamHI酶切、转移质粒pSKB8R以BgLH 酶切，二者T4DNALigase连接构建pSKB8RP。质粒pSKB8RPSacII/BamHI 酶切，pH6及下游Neo序列PCR扩增片段延伸产物用SacII/BamHI酶切 (Takara公司产)，二者T4DNALigase连接构建转移质粒pSKB8RPNeo。 PMF: cgggatccgtcgacttcgaacttattt PMR: cgggatcccccgggctcgagttatgatctt pE/L、 p7.5及多克隆位点扩增片段PCR扩增反应采用大连宝生物工程有限公司的试剂盒，反应体系如下: 质粒pSC65
正、反向引物(PMF， PMR) 10xPyrobest缓冲液 dNTP混合物(各2.5mM) Pyrobest DNA聚合酶(5U/ml)
1|J 5^1
5^1 37，
ddH20
PCR反应条件94。C预变性2 min; 94°C30s,58°C30s，72°C30s，共20个 循环；72。C7min; 4°C。
pE/L 、 p7.5及多克隆位点扩增片段延伸产物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit进行纯化回收，回收产物BamHI酶切(Takara公司产)。转移质 粒pSKB8R载体BglII酶切(Takara公司产)。用Omega公司E.Z.N.A. Gel Extraction Kit进行电泳纯化回收.。二者T4DNALigase(Takara公司产)连接构 建pSKB8RP。
质粒pSKB8RP SacII/BamHI酶切，pH6及下游Neo序列PCR扩增片段(如前) 用SacII/BamHI酶切(Takara公司产)，二者T4DNALigase连接构建转移质粒 pSKB8RPNeo。图5。
实施例二 B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTTAB8RlacZ的构建。 图6。
将痘苗病毒天坛株VTT与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源 重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的 重组病毒VTT厶B8RlacZ。以0.1 0.01PFU/cell病毒量VTT752-l感染80。/。成 片CEF细胞吸附l 1.5h后，采用脂质体转染技术(参照美国INVITROGEN 公司Lipofectin试剂盒)将重组质粒pSKB8RLacZ转染CEF细胞中。48小时 后收获重组病毒液，用含200 )ig/mlX-gal营养琼脂铺斑，随机挑取孤立蓝 斑病毒，连续单斑纯化5代，以待鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重 组病毒VTTAB8RlacZ。
提取DNA，进行PCR扩增及DOTBLOT鉴定、检测重组病毒B8R基因缺失 的稳定性，表明VTTAB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因缺失稳定。VTTAB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代插入外源基因lacZ稳 定表达。VTTAB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代，VTTAB8RlacZ传 代第5、 15代分别感染CEF细胞，检测其样品中(3-半乳糖苷酶活性，同时设 立VTT感染细胞对照。第5代J3-半乳糖苷酶活测定OD420nJl为3.027，第15 代0042。肌值为2.819。 VTT感染细胞对照OD42Q肌值为0.04。结果表明 VTTAB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代插入外源基即acZ稳定表达.(图 7，图8)和表l。
表l
5passegeVTTAB8尺lacZ15passegeVTT厶B8RlacZVTT
0.D420nm3.0272.8190.04
重组缺失病毒VTTAB8RlacZ在CEF、 TK'143、 CV-1细胞中的繁殖生长曲 线测定，结果表明VTTAB8RlacZ的生长曲线与VTT生长曲线相似(图90。 B8R基因缺失对重组缺失病毒在细胞中的繁殖复制没有影响。兔皮内毒力 实验表明VTT752-l形成红肿痘疱面积显著大于VTTAB8RlacZ形成痘疱， VTT752-1形成红肿痘疱而后出现溃破接痂，VTTAB8RlacZ形成痘疱无溃 破接痂，VTTAB8RlacZ形成痘疱消褪较VTT752-l形成痘疱消褪早。B8R 基因缺失显著降低痘苗病毒天坛株病毒毒力。见图IO。
实施例三B8R基因缺失表达HIV-l抗原的VTKgpe厶B8RlacZ (B8R基因 缺失为lacZ所取代，TK区插入B，/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)
的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病疫苗。
即将VTKgpe (TK区插入B7C型CN54株HIV-1 gagpol env基因的天坛株 重组痘苗病毒)与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组,经 蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为IacZ所取代的重组病 毒VTKgpeAB8RlacZ 。以0.1 ~0.01 PFU/cel1病毒量VTKgpe感染80%成片 CEF细胞吸附l 1.5h后，采用脂质体转染技术(参照美国INVITROGEN公 司Lipofectin试剂盒)将重组质粒pSKB8RLacZ转染CEF细胞中。48小时后收获重组病毒液，用含200吗/ml X-gal营养琼脂铺斑，随机挑取孤立蓝斑 病毒，连续单斑纯化5代，以待鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重组 病毒VTKgpeAB8RlacZ
提取DNA，进行PCR扩增及DOTBLOT鉴定、检测重组病毒B8R基因缺失 的稳定性，表明VTKgpeAB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因 缺失稳定。VTKgpeAB8RlacZ在CEF细胞连续培养传代15代插入外源基 因gagpol env禾急定表达。
实施例四B8R基因缺失、表达HIV-l抗原的VTKgpeAB8R (B8R基因缺 失不带lacZ选择标记，TK区插入B，/C型CN54株HIV-1 gagpol env基因)
的天坛株重组痘苗病毒的艾滋病疫苗。
再以VTKgpeAB8RlacZ为亲本株与pSKB8RNeo共转染CEF细胞进行同源 重组,经G418压力筛选、蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺 失不带lacZ选择标记的重组病毒VTKgpeAB8R。以0.1 0.01PFU/cell病毒量 VTKgpeAB8RlacZ感染8(P/。成片CEF细胞吸附l 1.5h后，采用脂质体转染 技术(参照美国INVITROGEN公司Lipofectin试剂盒)将重组质粒 pSKB8RNeo转染CEF细胞中。48小时后收获重组病毒液，以400ug/mlG418 压传三代。用含200昭/mlX-gal营养琼脂铺斑，随机挑取孤立白斑病毒， 连续单斑纯化5代，以待鉴定获得B8R基因缺失不带lacZ选择标记的重组病 毒VTKgpeAB8R。
提取DNA，进行PCR扩增及DOTBLOT鉴定、检测重组病毒B8R基因缺失 的稳定性，表明VTKgpe厶B8R在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因缺失 稳定。VTKgpeAB8R在CEF细胞连续培养传代15代插入外源基因gagpo1 env禾急定表达。
裸鼠毒力实验表明VTKgpeAB8R毒力较VTKgpe显著降低，腹腔接种VTT (104pfii)及VTKgpe (1()6pfii)15天裸鼠死亡，接种VTKgpeAB8R(l()7pfij)裸 鼠存活(表2)。胞内IFN-Y.染色流式细胞仪分析、T淋巴细胞增殖、CTL 检测显示B8R基因缺失显著提高表达HIV-1基因的天坛株重组痘苗病毒特 异性细胞免疫(图n， 14， 15)。表2
VirusDose (pfu>Number of death
VTT1020/4
1031/4
1044/4
VTKgpe1040/4
1050/4
1063/4
VTKgpe厶B服1050/4
1060/4
1070/4
实施例五PCR扩增检测重组病毒VTKgpeAB8R B8R基因缺失。Western blot检测VTKgpeAB8R传代15代插入外源基因gagpo1 env稳定表达
提取重组病毒DNA为模板,以引物B8RLF、 B8RRR进行PCR扩增。重组病 毒VTKgpeAB8R由于B8R基因缺失，PCR扩增出1244 bp片段，包括B8R基 因外左侧同源序列B8RL片段583bp、右侧同源序列B8RR片段661 bp。而 对照VTTDNA为模板扩增出2Kb片段，包括B8R基因外左侧同源序列B8RL 片段583 bp、 B8R基因818bp、右侧同源序列B8RR片段661 bp (图ll)。 结果表明VTKgpeAB8R在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因稳定缺失。 Dot Blot检测病毒VTKgpeAB8R基因组中B8R基因，提取痘苗病毒 VTT752-lDNA及重组病毒VTKgpeAB8R传代15代DNA，以B8R基因地高 辛标记探针进行Dot Blot检测。VTT752-lDot Blot结果显示杂交印迹斑 点，VTKgpeAB8R传代15代Dot Blot结果未显示杂交印迹斑点，表明 VTKgpeAB8R在CEF细胞连续培养传代15代B8R基因稳定缺失。见图12。 VTKgpeAB8R感染CEF细胞，48小时后收获细胞和上清，以人多抗血清 (美国国立卫生研究院艾滋病研究和参比试剂项目提供)进行Westem
17Blot分析，出现了特异的反应条带(gpl40,p55)说明所构建的疫苗可以正确 的表达目的基因(图16)。
实施例六、重组痘苗病毒艾滋病疫苗的效果实验
本例中使用无菌饲养的6 —8周龄BALB/c(H-2d)雌性小鼠(体重19一25 克，购自中国药品生物制品检定所)检测本发明疫苗的效力。各DNA疫苗 用lxPBS制备成lmg/ml的注射液。每种免疫组含10只小鼠。免疫前24小时 每只小鼠左右后肢胫骨前肌各注射50ul 25% (w/v)蔗糖高渗溶液以增加 肌肉细胞的通透性，提高摄取质粒效率，同时，蔗糖还有一定的佐剂的作 用。蔗糖处理24小时后，胫骨前肌注射DNA 100ug/只(每后肢50ug)。每 间隔2周以同样剂量加强免疫3次。第6周时1， 2组分别用VTKgpeAB8R 、 VTKgpe重组痘苗病毒加强，1(^pfti/鼠。第4,6周时3，4组分别用 VTKgpeAB8R 、 VTKgpe重组痘苗病毒免疫，1(fpfU/鼠。在第9周时取血 清及脾淋巴细胞检测抗体以及细胞因子。对照使用pCDN A空载体、不插 入目的基因的痘苗病毒天坛株(天花疫苗，由北京生物制品所惠赠)以及 空白鼠对照(表3)。
表3
0 week2 week4 week6 week
DNA+ VTKgpeAB8RpcDNA-syngag, pcDNA-ngp120pcDNA陽syngag, pcDNA-ngp120pcDNA-syngag, pcDNA-ngp120VTKgpe厶B8R
VTKgpeAB服VTKgpeAB8RVTKgpe厶B8R
DNA+ VTKgpepcDNA-syngag, pcDNA，120pcDNA-syngag, pcDNA-ngp120pcDNA-syngag, pcDNA-ngp120VTKgpe
VTKgpeVTKgpeVTKgpe
VTTVTTVTT
DNA+VTTpcDNApcDNApcDNAVTT
18相关实验及结果如下-
1、血清Gag特异性抗体IgG水平的检测
为检测不同重组痘苗病毒单独免疫和加强免疫所诱导的特异性体液
免疫水平，在第四次免疫后两周及取小鼠血清，用GagP55抗原(美国国立 卫生研究院艾滋病研究和参比试剂项目惠赠)包被酶标板，间接ELISA法进 行Gag特异性IgG抗体水平的检测。各免疫组Gag特异性IgG抗体滴度列于 表4。
表4
DNA + VTKgpeDNA + VTKgpAB8RVTKgAB8RVTKgpe
3 week35481316222560021134
4 week31622512002560025600
2、流式细胞仪检测体外抗原表位肽剌激后分泌1 1^1的€08+ T淋巴细胞 CD8+T淋巴细胞是一种最重要的抗病毒效应细胞，所以检测了免疫后 脾淋巴细胞中分泌IFN-Y的HIV-1特异性CD8+ T淋巴细胞。脾淋巴细胞用 MHC-I限制性HIV (gag p24(AMQILKDTI), V3(SIRIGPGQTF YATGD ) and pol (NPDIVIYQYMDDLYVGSDL， YMDDLYVGSDLEIGQHRTK, KEPPFLWMGY ELHPDKWTV )刺激12小时后，对细胞内IFN-Y和CD8， CD3分子进行染色，流式细胞仪(贝克曼库尔特公司产品)进行分析。 DNA + VTKgpeAB8R免疫组小鼠脾细胞T淋巴细胞，分泌圧^丫的€08+ T 淋巴细胞占脾脏总CD8+T淋巴细胞的百分比数显著高于DNA +VTKgpe免 疫组。VTKgpeAB服免疫组小鼠脾细胞分泌IFNi.CD8百分比数显著高于 VTKgpe免疫组。
实施例七、B8R基因缺失、表达乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的(B8R 基因缺失插入HBSAg抗原，TK区插入IL-2基因)的天坛株重组痘苗病毒 的乙型肝炎病疫苗的构建。
构建过程将重组痘苗病毒VTKIL-2 ( TK区插入IL-2基因)与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失为lacZ所取代的重组病毒VTKIL-2AB8RlacZ。将HBSAg基因插入转移质粒PSKB8RPNeo中(PSKB8RPNeoSaLI酶切补平，T4DNA连接酶连接HBSAg基因与PSKB8RPNeo)构建质粒PSKB8RPSNeo，HBSAg基因置于转移质粒痘苗病毒启动子下。将VTKIL-2AB8RlacZ与PSKB8RPSNeo共转染CEF细胞进行同源重组,经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因，缺失lacZ为HBSAg基因所取代的重组病毒VTKIL-2AB8RS。具体方法参见前述的方法。
权利要求
1.一种天坛株重组痘苗病毒减毒载体，其是B8R基因缺失的天坛株重组痘苗病毒。
2. 根据权利要求1所述的载体，其中缺失的B8R基因为lacZ所取代。
3. 根据权利要求2所述的载体，其为天坛株重组痘苗病毒 VTTAB8RlacZ，其构建方法包括以下步骤构建转移质粒pSKB8RLacZ; 将痘苗病毒天坛株VTT与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同 源重组，经蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因缺失且为lacZ 所取代的天坛株重组痘苗病毒减毒载体VTTAB8RlacZ。
4. 根据权利要求3所述的载体，其中转移质粒pSKB8RLacZ是在质粒 pBR-SK中插入B8R基因左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR 片段、痘苗病毒启动子序列pE/L、 p7.5以及LacZ基因序列得到的。
5. 根据权利要求4所述的载体，其中转移质粒pSKB8RLacZ中的痘苗 病毒启动子序列pE/L、 p7.5及下游LacZ序列来源于pSC65， pSC65的保 藏号是CGMCCNo.1097。
6. 根据权利要求1所述的载体，其为VTTAB8R。
7. 根据权利要求1至6任一项所述的载体在制备重组痘苗病毒疫苗中 的应用。
8. —种天坛株重组痘苗病毒艾滋病疫苗，其是通过在根据权利要求1 至6任一项所述的载体中表达HIV-1抗原而获得的。
9. 根据权利要求8所述的艾滋病疫苗，其中所述HIV-1抗原是单价或 多价的。
10. 根据权利要求8所述的艾滋病疫苗，其中所述HIV-1抗原是HIV-1 gagpol禾口 env基因。
11. 根据权利要求8至io任一项所述的艾滋病疫苗，其中所述mv-i抗原是插入TK区。
12. 根据权利要求11所述的艾滋病疫苗，其为重组痘苗病毒 VTKgpeAB8RlacZ，其构建方法包括以下步骤转移质粒pSKB8RLacZ 与TK区插入HIV-1 CN54株gagpol和env基因的天坛株重组痘苗病毒VTKgpe进行同源重组，经蓝白筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因 缺失为lacZ所取代的重组痘苗病毒VTKgpeAB8RlacZ。
13. 根据权利要求11所述的艾滋病疫苗，其为重组痘苗病毒 VTKgpeAB8R，其构建方法包括以下步骤转移质粒pSKB8RNeo与权利 要求12所述的重组病毒VTKgpeAB8RlacZ再次同源重组，获得B8R基 因缺失不带lacZ选择标记，TK区插入HIV-1CN54株gagpol和env基因 的天坛株重组痘苗病毒艾滋病疫苗VTKgpeAB8R。
14. 根据权利要求13所述的艾滋病疫苗，其中转移质粒pSKB8RNeo 是在pBR-SK中插入左侧同源序列B8RL片段、右侧同源序列B8RR片段, 并在同源序列外侧插入痘苗病毒启动子序列pH6及Neo基因序列的一种 转移质粒。
15. 根据权利要求12至14中任一项所述的艾滋病疫苗，其中VTKgpe 的保藏号为CGMCCNo. 1099。
16. —种天坛株重组痘苗病毒疫苗，其是通过在根据权利要求1至6 任一项所述的载体中表达外源基因而获得的。
17. 根据权利要求16所述的疫苗，其中所述外源基因是病毒抗原基因。
18. 根据权利要求16所述的疫苗，其中在B8R基因缺失区插入外源 基因。
19. 根据权利要求16至18中任一项所述的疫苗，其中所述病毒抗原 是单价或多价的。
20. —种天坛株重组痘苗病毒乙型肝炎病疫苗，其是通过在根据权利 要求1至6任一项所述的载体中表达乙型肝炎病毒抗原而获得的。
21. 根据权利要求20所述的乙型肝炎病疫苗，其中所述乙型肝炎病毒 抗原是HBSAg。
22. 根据权利要求20或21所述的乙型肝炎病疫苗，其中缺失的B8R 基因为HBSAg基因所取代。
23. 根据权利要求22所述的乙型肝炎病疫苗，其中在TK区插入IL-2基因。
全文摘要
本发明涉及IFN-γ受体基因(B8R)缺失的天坛株重组痘苗病毒减毒载体以及基于此载体构建的表达HIV-1各种抗原(单价及多价)的IFN-γ受体基因(B8R)缺失的天坛株重组痘苗病毒艾滋病疫苗，一种天坛株重组痘苗病毒recombinant vaccinia virius VTKgpe毒recombinant vacciniavirus VTKgpe CGMCC.NO.1099和另外一种乙型肝炎病毒HBSAg抗原，IL-2的天坛株重组痘苗病毒的乙型肝炎病疫苗。本发明在制备治疗病毒病的重组痘苗病毒疫苗药物中的应用有着重要的意义。
文档编号A61K39/275GK101671695SQ20091015778
公开日2010年3月17日 申请日期2004年3月10日 优先权日2004年3月10日
发明者颖 刘, 邵一鸣, 薇 黄 申请人:中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心