专利名称：鸭促性腺激素释放激素受体基因(gnrhr)的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鸭促性腺激素释放激素受体基因(GNRHR)核苷酸序列及基因编码的氨基酸序列，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
我国是世界上养鸭数量、产品消费和出口贸易的第一大国。根据FAO的数据统计2006年，我国鸭存栏量超过7. 25亿只，占世界总存栏量的69. 28%左右，养鸭业逐步成为我国经济结构中的特色产业和农村经济发展的支柱产业之一。但是，关于鸭分子生物学研究大大落后于鸭育种和生产的发展，这些成果取得仍然依靠传统的育种和生产技木。促性腺激素释放激素受体在动物生殖发育调控过程中起着关键作用。促性腺激素释放激素与垂体中的促性腺激素释放激素受体结合，能促进促黄体素(LH)和促卵泡素(FSH)的合成与释放，促进性腺的生长、成熟和调节动物的繁殖功能及行为。Ikemoto. T等(2004)报道，GNRH经过和它的特定受体(GNRHR)的交互作用在动物生殖功能活动中扮演ー个关键性的角色。Kim等(2003)研究表明，抑制动物GNRH及其受体基因的表达将极大抑制其生殖活动。目前，猪、山羊、鸡等动物的促性腺激素释放激素受体基因序列已陆续被报道，它与初产母猪黄体生成数(Jiang等，2001)、山羊产羔数(储明星等，2009)和母鸡产双黄蛋数(Dunn等，2004)相关显著，该基因是提高动物繁殖性能的重要侯选基因。但是鸭促性腺激素释放激素受体基因还未曾有报道，极大地制约了鸭分子遗传育种的研究和生物技术在鸭生产中的应用，影响了养鸭业地快速发展。
发明内容
本发明的目的是为了利用基因工程技术加快对鸭繁殖性能的改良，提供鸭促性腺激素释放激素受体基因(GNRHR)核苷酸序列、编码的氨基酸序列以及获得该基因序列的引物序列。本发明的目的是通过以下技术方案实现的。鸭促性腺激素释放激素受体基因(GNRHR)，它经由以下两对弓I物GF4 (SEQID No 14)与 GR4(SEQ ID No :15) ；GF5 (SEQID No :16)与 GR5 (SEQID No :17)克隆测序获得。鸭促性腺激素释放激素受体基因，在于核苷酸序列SEQ IDNo :1所示。所述的鸭促性腺激素释放激素受体基因及基因编码的氨基酸序列SEQ ID No:2所示。所述方法包括下列步骤(1)根据已知动物GNRHR基因的序列分析该基因结构和保守区域；(2)根据Genebank中鸡GNRHR基因的序列(nc_006096. 2)和鸡chromosome10(NW_001471429. I)的信息，设计ー对位于GNRHR基因第2外显子上的引物GFl和GR1，GFl的序列如SEQ ID No :3，GRl的序列如SEQ ID No 4 ； (3)以鸭基因组DNA为模板，利用引物GFl和GRl扩增并克隆测序得到DGl序列121bp，DGl的序列如SEQ ID No 5 ； (4)序列DGl与鸡G HR基因进行比对，发现同源性达92%，判定该段序列为GNRHR基因上的序列；(5)根据DGl与鸡GNRHR基因序列设计两对引物GF2、GR2和GF3、GR3，GF2位于GRHR基因的第一外显子位置，其序列如SEQ ID No :6，GR3位于GNRHR基因的第三外显子位置，其序列如SEQID No :7，GR2和GF3均位于GNRHR基因的第二外显子位置，序列分别如SEQ ID No :8和SEQID No 9 ； (6)以GF2、GR2和GF3、GR3两对引物扩增鸭基因组DNA，分别克隆测序得到DG2和DG3序列，DG2和DG3序列分别如SEQ ID No 10,SEQ ID No 11 ； (7)DG2和DG3序列分别与鸡GNRHR基因比对，同源性分别达到89%、88% ; (8)根据DG2序列设计上游引物GF4，其序列如SEQ ID No : 12，根据DG3序列设计一条下游引物GR4，其序列如SEQ ID No:13，用于扩增鸭GNRHR基因大部分全长序列；(9)利用引物GF4和GR4扩增鸭基因组DNA，克隆测序获得鸭GNRHR基因大部分全长序列DG4，其序列如SEQ ID No 14 ； (10)根据DG3序列设计ー条上游引物GF5，其序列如SEQ ID No :15，根据鸡GNRHR基因3’ UTR区设计一条下游引物GR5，其序列如SEQ ID No 16 ；(11)利用引物GF5和GR5扩增鸭基因组DNA，克隆测序获得ー条鸭 GNRHR 基因 3，UTR 区序列 DG5，其序列如 SEQ ID No 17 ； (12)通过 DNAstar、Bioedit等软件编辑和拼接，最终获得GNRHR全长序列。与以往相关技术比较，本发明的完成为进一歩深入分析GNRHR基因的功能和其对鸭繁殖性能的重要调节机制的掲示，为GNRHR基因的应用打下基础，为筛选和培育高产蛋 鸭品种提供分子技术支持。
具体实施例方式实施例I高邮鸭GNRHR基因的克隆和测序I.基因组DNA的提取本发明中所用的血样采集自高邮鸭国家资源保种场，利用DNA微量提取试剂盒提取血液中全基因组DNA,具体操作步骤如下I. I将血样摇匀，取约500至550L血样到5mL离心管中(折算为5mL离心管中含新鲜禽血约110 μ L，若为2mL离心管则折算后的禽血以40至50 μ L为宜)，6000r/min，离心4min,倒掉上清。I. 2加入约I. 8mL生理盐水(O. 9% Nacl)轻缓地上下颠倒摇匀，倘若急用，轻柔地摇10 15min ;若不急用，可室温下放置O. 5h Id,随后以6000r/min离心3 4min,倒
掉上清。I. 3将260 μ L生理盐水加入离心管中，摇ー摇，将血细胞充分悬浮起来，然后加入裂解液[IOOmmoI/L Tris · Cl (ρΗ8. O). 200mmol/L EDTA(pH8. O) ,2% SDS] 1800L，接着加入蛋白酶K至终浓度100ng/mL，盖紧管子后颠倒摇匀，最后于水浴锅中55°C消化过夜。I. 4加酚氯仿异戊醇(25 24 l)2mL于试管中，摇匀20min，然后12000r/min离心IOmin,取上清,如此抽提两遍,然后再用与上清等体积的氯仿异戍醇(24 I)抽提一遍，离心后取上清。I. 5用两倍体积的无水こ醇沉淀DNA，再用70 %こ醇洗两遍，晾干，加入适量超纯水溶解DNA。2.高邮鸭GNRHR基因的扩增和克隆测序2. I高邮鸭GNRHR基因第2外显子部分序列的的获得2. I. I引物设计根据Genebank 中鸡 GNRHR 基因的序列(NC_006096. 2)和鸡 chromosome10 (NW_001471429. I)的信息，设计ー对位于GNRHR基因第2外显子上的引物GFl和GRl，GFl的序列如SEQ ID No :3，GRl的序列如SEQ ID No :4。2. I. 2序列测定PCR反应体系鸭基因组DNA模板2 μ 1，引物GFl :1μ 1，引物GRl 1μ l,2mM dNTP 2 μ l,25mM MgS04 :0. 8 μ 1，10*K0D buffer :2 μ 1，KOD plus :1 μ 1，ddH20 :10. 2 μ 1，共计20ul ;反应程序94°C预变性2. 5min ;94°C变性，56°C退火30s ;68°C延伸30S ;25个循环，68°C延伸5min。扩增PCR产物克隆测序得到DGl序列121bp，DGl的序列如SEQ ID No 52. I. 3序列同源性比对 DGl序列与鸡GNRHR基因(GENE ID :427517)比对，同源性达到92%，确认该部分序列为GNRHR基因序列。2. 2鸭GNRHR基因第1、2、3外显子序列的获得2. 2. I引物设计根据DGl与鸡GNRHR基因序列设计两对引物GF2、GR2和GF3、GR3，GF2位于GNRHR基因的第一外显子位置，其序列如SEQ ID No :6，GR3位于GNRHR基因的第三外显子位置，其序列如SEQ ID No :7，GR2和GF3均位于GNRHR基因的第二外显子位置，序列分别如SEQ IDNo 8 和 SEQ ID No :9。2. 2. 2序列测定PCR反应体系鸭基因组DNA模板2 μ I ;上游引物GF2/GF3 :1 μ I，下游引物GR2/GR3 1μ I ；2mM dNTP :2μ 1，25mM MgS04 :0.8 μ 1，10*K0D buffer :2 μ 1，KOD plus :1 μ 1，ddH20 :10. 2μ 1，共计 20 μ I ;反应程序94°C 预变性 2. 5min ;94°C 变性，56°C 退火 30s ；68°C延伸Imin ；25个循环，68°C延伸5min。GF2、GR2和GF3、GR3两对引物扩增鸭基因组DNA，分别克隆测序得到DG2和DG3序列，DG2和DG3序列分别如SEQ ID No :10，SEQ ID No :11。2. 2. 3序列同源性比对 DG2和DG3序列分别与鸡GNRHR基因(GENE ID :427517)比对，同源性分别达到89*%、88*%，确认这两条序列为GNRHR基因序列。2. 3高邮鸭GNRHR基因大部分全长序列的获得2. 3. I引物设计根据DG2序列设计上游引物GF4，其序列如SEQ ID No : 12，根据DG3序列设计一条下游引物GR4，其序列如SEQ ID No : 13，用于扩增鸭GNRHR基因大部分全长序列。2. 3. 2序列测定鸭基因组DNA模板2 μ I ;上游引物GF4 :1 μ 1，下游引物GR4 :1 μ I ；2mMdNTP
2μ l,25mM MgS04 :0. 8 μ 1，10*K0D buffer :2 μ 1，KOD plus :1 μ 1，ddH20 :10. 2 μ 1，共计20 μ I ;反应程序:94°C预变性2. 5min ;94°C变性，56°C退火30s ;68°C延伸Imin ;25个循环，68°C延伸5min。利用引物GF4和GR4扩增鸭基因组DNA，克隆测序获得鸭GNRHR基因I大部分全长序列DG4，其序列如SEQ ID No :14。2. 3. 3序列同源性比对DG4序列与鸡GNRHR基因(GENEID :427517)比对，同源性达到90%，确认该部分序列为GNRHR基因序列。2. 4高邮鸭GNRHR基因3’端序列的获得
2.4.1引物设计根据DG3-1序列设计一条上游引物GF5，其序列如SEQ ID No : 15，根据鸡GNRHR基因3，UTR区设计一条下游引物GR5，其序列如SEQ ID No :16。2. 4. 2序列测定鸭基因组DNA模板2 μ I ;上游引物GF5 :1 μ 1，下游引物GR5 :1 μ I ；2mMdNTP 2 μ l,25mM MgS04 :0. 8 μ 1，10*K0D buffer :2 μ 1，KOD plus :1 μ 1，ddH20 :10. 2 μ 1，共计20 μ I ;反应程序:94°C预变性2. 5min ;94°C变性，56°C退火30s ;68°C延伸Imin ;25个循环，68°C延伸5min。利用引物GF5和GR5扩增鸭基因组DNA，克隆测序获得一条鸭GNRHR基因3，UTR区序列DG5，其序列如SEQ ID No :17。2. 4. 3序列同源性比对DG5序列前161bp序列与DG4序列1654bp 1814bp序列一致,通过NCBI在线Blast以及DNAstar、Bioedit等软件编辑和拼接，最终获得GNRHR全长序列SEQ ID No :1。实施例2(I)组织采集采集250日龄及330日龄高产双黄蛋的高邮鸭(双黄率3%以上)卵巢组织和单黄蛋高邮鸭卵巢组织各6个，剪取相同部位的卵巢组织置于冻存管中，-80超低温冰箱保存。(2)主要仪器和试剂荧光定量PCR仪器为Mx3000P (Stratagene公司)，RNA提取用Trizol试剂购自Invitrogen 公司，Sample Protector、AMV 反转录酶、DNase I (RNase free)、AMV 逆转录酶、SYBR Premix Ex Taq荧光定量试剂盒等购自宝生物工程大连有限公司。⑶引物的设计根据实施例I 中的 SEQ ID No : 10、SEQ ID No :11 和 SEQ ID No :1 序列，应用Primer Premier 5· O软件包设计GNRHR基因荧光定量引物，上游引物序列Fl (SEQ ID No:18)，下游引物序列Rl (SEQ ID No :19)，目标序列长度108bp，以鸭β-actin基因(登录号EF667345. I)作为内參基因并设计其上游引物和下游引物，引物序列为上游引物F2 (SEQ IDNo :20)，下游引物R2(SEQ ID No :21)，目标序列长度132bp。引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。(4) RNA的提取和cDNA合成将各组织样品按姆IOOmg组织加入ImL Trizol勻衆,采用trizol法提取RNA。为克服RNA溶液中痕量基因组DNA对RT-PCR的干扰，采用DNaseI (RNase free, 5U/ μ L)，按照使用说明处理后，采用酚-氯仿-异戊醇法抽提后，溶于DEPC水中。cDNA第一链的合成PCR 反应总体积为 20U/ μ L，包括总 RNA5 μ g, oligo (dT) 18 (O. 5ug/ μ I) I μ L，Random 6primer (0. 2ug/μ I) I μ L, buffer 4 μ L, dNTP(IOmM each)2 μ L, RNaseInhibitor(20U/yL)lyL，AMV(10U/yL)，加 DEPC H20 至 20U/yL。反转录反应条件为37°C 15min ;然后85°C 30s。得到第一链cDNA用于下步PCR反应。(5) GNRHR基因实时荧光定量
采用荧光定量PCR引物，以β-actin基因为管家基因，反应体系为模板2μ 1，SYBR Premix Ex taq(2X) 12. 5μ 1，ROX Dye ΙΙ(50Χ)0· 5μ 1，d ddH20 9. 5 μ 1，上下游引物(20pmol/ul)各O. 25 μ I,总体系为25ul。每个样品做3个重复。实时荧光定量95°C 30s变性，共进行40个循环扩增，每ー循环包括95°C 5s、60°C 20min,并在每次循环结束后检测荧光；以每ー个循环上升I°C，从60°C到95°C，全程采集荧光信号，获得熔解曲线。(6)统计处理相对定量分析以鸭β -actin基因为參照基因，利用Ct值计算各组织部位中mRNA 相对表达量，详见參考文献(Wong and Medrano，2005)，标准其计算公式为mRNA相对表达
且—0-Δ ACt
里一」，Δ Δ Ct = Δ Ct目的组织_ Δ Ct标職织
Δ Ct目眺织=Ct @腿H 参照編
Δ Ct麵组织=Ct @腿H 参照翻參照组织样品为每只鸭卵巢部组织混合后RNA池。利用EXCEL12. O软件进行统计分析。(7)结果与分析统计结果分析显示，250日龄高产双黄蛋高邮鸭的GNRHR基因mRNA表达量为
3.523，显著高于单黄蛋高邮鸭卵巢组织GNRHR基因mRNA表达量O. 788 (P < O. 05) ；330日龄高产双黄蛋高邮鸭的GNRHR基因mRNA表达量为5. 332，显著高于单黄蛋高邮鸭卵巢组织GNRHR基因mRNA表达量I. 829 (P < O. 05)，这ー结果提示，GNRHR基因mRNA表达量的增加能够有效促进高邮鸭卵子的排放，使其超排，产生双黄鸭蛋，因此根据我们克隆获得的GNRHR基因序列，能够人工合成GNRHR激素。
权利要求
1.一种鸭促性腺激素释放激素受体基因(GNRHR)，其特征在于它经由以下两对引物GF4 (SEQ ID No: 14)与 GR4(SEQID No :15) ；GF5 (SEQID No :16)与 GR5 (SEQ ID No :17)克隆测序获得。
2.根据权利要求I所述的鸭促性腺激素释放激素受体基因(GNRHR)，其特征在于其核苷酸序列SEQID No 1所示。
3.根据权利要求2所述的鸭促性腺激素释放激素受体基因(GNRHR)，其特征在于其氨基酸序列SEQID No 2所示。
全文摘要
本发明公布了鸭促性腺激素释放激素受体基因(GNRHR)核苷酸序列SEQ ID No1和该基因编码的氨基酸序列SEQ ID No2。以及提供了可用于克隆测序获得鸭促性腺激素释放激素受体基因(GNRHR)序列的两对引物GF4(SEQ ID No14)与GR4(SEQ ID No15)；GF5(SEQ ID No16)与GR5(SEQ ID No17)。本发明通过同源克隆测序的方法获得了鸭GNRHR基因，并成功应用于鸭多产双黄蛋技术的开发，该基因适用于鸭繁殖性能的分子生物技术的开发和遗传育种。
文档编号C12N15/11GK102660549SQ20121012318
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月25日 优先权日2012年4月25日
发明者朱文奇, 李慧芳, 束婧婷, 陈宽维, 陈文峰 申请人:江苏腾达源农牧有限公司