放射性配基N₂S₂-Memantine和脑受体显像剂^99mTc-Memantine的油水分配系数测定方法

专利名称：：放射性配基N₂S₂-Memantine和脑受体显像剂^99mTc-Memantine的油水分配系数测定方法
技术领域：
：放射性配基N2S2-Memantine和脑受体显像剂99mTc-Memantine的油水分配系数测定方法，属于核医学分析检测
技术领域：
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背景技术：
：病理学研究证实，许多精神疾病包括痴呆、精神分裂、帕金森疾病等与脑内NMDA(N-甲基天冬氨酸)受体异常有关。研究和开发能够有效量化局部脑组织NMDA受体和该受体活性状态改变的显像剂,从分子水平上展现脑的生理、病理状态，对与受体有关的疾病作出诊断，并用于指导合理用药以及疗效评价和预后判断，是至关重要的。目前国外有用["F]、[UC]或[^I]标记不同类型的N-甲基天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂的报道[6—1Q]，但""Tc标记的NMDA受体显像剂国内外均无报道。美金刚胺(Memantine)是一种具有中等亲和力的NMDA受体拮抗剂，可以抑制兴奋性氨基酸的神经毒性而不干扰学习、记忆所需的短暂的谷氨酸生理性释放，具有神经元保护作用，我们以美金刚胺为原料，经过结构改造，引入N2S2基团，得到一种全新的双功能化合物N-[2-(N-(2-巯基乙基))氨基甲酰甲基]-N-(2-巯基乙基)-3，5-二甲基金刚烷胺基乙酰胺(N2S2-Memantine)，与锝络合得到新的锝标记化合物99mTc-Memantine(结构式见图1)。经改造后的拮抗剂与NMDA受体结合情况也会相应的改变，能否成为一种更有效的NMDA受体拮抗剂，99mTc-Memantine能否成为一种新的SPECT显像药物，必须对其性质进行深入研究，其中油水分配系数的测定极为重要。
发明内容本发明的目的是提供一种放射性配基N2S2-Memantine和脑受体显像剂99mTc-Memantine的油水分配系数测定方法，99mTc-Memantine的油水分配系数与药物在体内的溶解、吸收、分布、转运有关，是决定药物能否进脑的一个重要因素之一，通过油水分配系数测定，可推测新药的一些药理作用，因此通过体外测定N2S2-Memantine及99mTc-Memantine的油水分配系数，可以模拟生物体内药物在水相和生物相之间的分配情况。本发明的技术方案一种放射性配基N2S2-Memantine的油水分配系数测定方法，放射性配基99mTc标记前体N-[2-(N-(2-巯基乙萄)氨基甲酰甲基]-N-(2-巯基乙基)-3，5-二甲基金刚烷胺基乙酰胺，简称N2S2-Mernantine，采用N2S2-Memantine在正辛醇-水或正辛醇-磷酸盐缓冲液体系中，用HPLC法测定N2S2-Memantine的油水分配系数，25。C时，N2S2-Memantine的油水分配系数lgP为1.70，步骤为(1)溶液配制精密称取N2S2-Memantinel.0g，置于100mL量瓶中，加入适量甲醇溶解，加甲醇至刻度，摇匀，得浓度为10mg/mL的贮备液；(2)线性关系确定精密量取贮备液适量，置于10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的系列标准溶液，分别精密吸取各系列标准溶液20pL注入高效液相色谱仪，记录峰面积J;以N2S2-Memantine质量浓度mg/mL计/为横坐标，峰面积^为纵坐标进行线性回归，得N2S2画Memantine的线性回归方程为」=4><106/>+3173.1，r2=0.9996,结果表明N2S2-Memantine在0.1~1.0mg/mL内呈良好线性关系；另取0.1mg/mL的N2S2-Memantine溶液加流动相稀释配成0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的系列标准溶液，分别精密吸取各系列标准溶液20pL注入高效液相色谱仪，记录峰面积乂，得到N2S2-Memantine的回归方程为」=4xl06/—1855.7，r2=0.9989，表明N2S2-Memantine在0.005~0.1mg/mL内也呈良好的线性关系；色谱条件色谱柱LichospherC18(4.6x250mm)，流动相为乙腈、水和三氟乙酸，其中乙腈水体积比为2:1，三氟乙酸为流动相总体积的2%;紫外检测波长230nm，流速1.00mL/min，柱温25°C;(3)油水分配系数的测定精密称取N2S2-Memantine适量溶于水饱和的正辛醇中配成质量浓度为l.Omg/mL的溶液，取该溶液2mL于10mL具塞管中，加入2mL正辛醇饱和的水、氮气保护25'C摇床振摇72h，离心，分別取油相和水相各20mL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，代入标准曲线计算N2S2-Memantine的浓度，油相浓度为AV水相浓度为Av，由公式P，n/z)w得25"C时N2S2-Memantine的正辛醇-水油水分配系数P为50.51，即lgP-I.70;或以正辛醇-磷酸盐缓冲液体系代替正辛醇-水作为N2S2-Memantine的溶液配制液进行油水分配系数的测定。一种脑受体显像剂99mTC-Memantine的油水分配系数测定方法，步骤为(1)99fflTc标记精密称取N2S2-Memantine适量用70%乙醇配成N2S2-Memantine质量浓度为5mg/mL的溶液，精密量取20pL，依次加入20pLlmg/mL用O.lmol/LHC1新鲜配制的SnF2，50!iL100mg/mL葡庚糖酸钠，50pL10mg/mLEDTA和800pLpH二6.0的PBS，混匀，加入放射性强度约为lmCi"mTc淋洗液，沸水煮30min;(2)量取上述溶液O.lmL，加入3mL正辛醇和3mLO.lmol/LpH=7.4的PBS,涡旋5min，静置分层，4000rpm离心10min，取有机相、水相各lmL，分别测y计数；(3)取步骤(2)的有机相lmL，加入2mL正辛醇和3mLO.lmol/LpH=7.4的PBS，涡旋5min，静置分层，4000rpm离心10min，取油相、水相各lmL，分别测Y计数为Y油、^每次取油相进行倍比稀释，至少进行5次，每次对倍比稀释后的油相、水相进行测Y计数Y油、Y水，测定分配系数P=y油/y水，至样品在两相中的分配比趋于稳定，lgP趋于1.9。本发明的有益效果本发明采用HPLC法测定N2S2-Memantine的油水分配系数和99mTc标记测定99mTc-Memantine的油水分配系数。结果25'C时，N2S2-Memantine的油水分配系数lgP为1.70，99mTc-Memantine的油水分配系数为lgP为1.9，结论N2S2-Memantine和99mTc-Memantine呈脂溶性。图1,Tc-Memantine的结构式。图2N2S2-Memantine色谱图。图3乙腈-水体系的油相色谱图。图4乙腈-水体系的水相色谱图。具体实施例方式材料600型高效液相色谱仪及色谱工作站(美国Waters公司)，pH300型pH计(上海天达仪器有限公司)，AC-2105型分析天平(德国sartorius)，80-2型离心机(上海手术机械厂)，1470型自动，计数仪(美国PerkinElmer)，N2S2-Memantine(卫生部核医学重点实验室合成，纯度大于95%)，甲醇、乙醇、乙腈(色谱纯),正辛醇、磷酸二氢钠(分析纯)，水为二次蒸馏水。色谱条件色谱柱LichospherC18(4.6x250mm)，流动相为乙腈、水和三氟乙酸，其中乙腈水体积比为2:1，三氟乙酸为流动相总体积的2%;紫外检测波长230nm，流速1.00mL/min，柱温25°C。实施例1N2S2-Memantine的油水分配系数测定(1)溶液配制精密称取N2S2-Memantinel.0g，置于100mL量瓶中，加入适量甲醇溶解，加甲醇至刻度，摇匀，得浓度为10mg/mL的贮备液。(2)线性关系精密量取贮备液适量，置于10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为O.l、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的系列标准溶液，分别精密吸取各系列标准溶液20nL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以N2S2-Memantine质量浓度p(mg/mL)为横坐标，峰面积^为纵坐标进行线性回归，得N2S2-Memantine的线性回归方程为J=4xl06p+3173.1，r2=0.9996，结果表明N2S2-Memantine在0.1-1.Omg/mL内呈良好线性关系；另取O.lmg/mL的N2S2-Memantine溶液配成0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、O.lOmg/mL的系列标准溶液，分别精密吸取各系列标准溶液20|iL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，得到N2S2-Memantine的回归方程为/4=4xl0>—1855.7，r2=0.9989，表明N2S2-Memantine在0.005-0.lmg/mL内也呈良好的线性。(3)精密度实验取N2S2-Memantine质量浓度分别为0.5mg/mL和0.04mg/mL的甲醇溶液按所述色谱条件连续进样6次，计算相对标准偏差(RSD)。结果RSD分别为0.62%和1.08%，均小于2%，表明该方法的精密度良好。(4)回收率实验配制O.l、0.5、1.0mg/mL低、中、高3种质量浓度的N2S2-Memantine样品溶液，进行色谱测定，每种质量浓度测定5次，由标准曲线方程计算测定值，测定值(/>D)与真实值(/>T)的比值为回收率。结果见表l。表l回收率的测定<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(5)油水分配系数的测定精密称取N2S2-Memantine适量溶于水饱和的正辛醇中配成质量浓度约为1.0mg/mL的溶液，取该溶液2mL于lOmL具塞管中，加入2mL正辛醇饱和的水、25"C摇床振摇72h，离心，取油相和水相20|iL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。代入标准曲线计算N2S2-Memantine的浓度分别为pn和/ow，由公式P=/V>w得25'C时N2S2-Memantine的正辛醇/水油水分配系数P为50.51(lgP=1.70)。N2S2-Memantine由于含巯基，不稳定，需充氮气保护。经氮气保护的试样稳定性较好，日间标准偏差仍小于2%。实施例2流动相的选择考察不同的流动相对水相和油相分离条件的影响。选用不同比例的甲醇-水体系，主峰的保留时间在6.5min左右，但油相的主成分受杂质峰干扰较严重，无法有效分开；改用乙腈-水体系，分离效果得到较大的改观，选择乙腈和水的比例为2:1时,分离度大于1.5;加入一定比例的三氟乙酸，峰形较好并有合适的保留时间，油相和水相的色谱图见图3、图4。实施例3pH对分配系数的影响将实施例1中步骤(5)方法中所用的水改成0.1mol/LpH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.4、8.0和9.0的磷酸盐缓冲液，同法测定在不同的pH缓冲液中N2S2-Memantine的分配系数，见表2。结果正辛醇-磷酸盐缓冲液体系分配系数受缓冲液的pH值影响不大。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例499mTc标记的"，c-Memantine测定油水分配系数精密称取N2S2-Memantine适量用70%乙醇配成质量浓度为5mg/mL的溶液，精密量取20mL，依次加入20nLlmg/mL的SnF2(用O.lmol/LHC1配制)、50|iL100mg/mLGH(葡庚糖酸钠)，50jiL10mg/mLEDTA和800nLPBS(pH-6.0)，混匀，加入放射性强度约为lmCi"mTc淋洗液，沸水煮30min。量取上述溶液O.lmL，加入3mL正辛醇和3mLO.lmol/LPBS(pH=7.4)，涡旋5min，静置分层，4000rpm离心10min，取有机相、水相各lmL测Y计数。取上述有机相lmL，分别加入2mL正辛醇和3mLO.lmol/LPBS(pH=7.4)，涡旋5min，静置分层，4000rpm离心10min，取油相、水相各lmL测y计数为Y油、Y水。开始时，样品中含有未反应的过量游离""Tc，加入两相后，游离9^Tc几乎全溶于水中，使第一次水相的测量值过高，而标记后的样品主要溶于有机相中，因此，对有机相多次进行倍比稀释，就可以逐步消除游离"mTc影响，从而得到比较准确的油水分配系数。每次取油相进行倍比稀释，至少进行5次，每次对倍比稀释后的油相、水相进行测Y计数Y油、Y水，测分配系数P，油/y水，至样品在两相中的分配比趋于稳定，lgP趋于1.9。表399mTC-Memantine的分配系数测定<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>N2S2-Memantine和"mTc-Memantine的分配系数相近，均呈脂溶性，容易进脑。权利要求1、一种放射性配基N2S2-Memantine的油水分配系数测定方法，其特征在于放射性配基99mTc标记前体N-[2-(N-(2-巯基乙基))氨基甲酰甲基]N-(2-巯基乙基)-3，5-二甲基金刚烷胺基乙酰胺，简称N2S2-Memantine，采用N2S2-Memantine在正辛醇-水或正辛醇-磷酸盐缓冲液体系中，用HPLC法测定N2S2-Memantine的油水分配系数，25℃时，N2S2-Memantine的油水分配系数lgP为1.70，步骤为(1)溶液配制精密称取N2S2-Memantine1.0g，置于100mL量瓶中，加入适量甲醇溶解，加甲醇至刻度，摇匀，得浓度为10mg/mL的贮备液；(2)线性关系确定精密量取贮备液适量，置于10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的系列标准溶液，分别精密吸取各系列标准溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积A；以N2S2-Memantine质量浓度mg/mL计ρ为横坐标，峰面积A为纵坐标进行线性回归，得N2S2-Memantine的线性回归方程为A＝4×106ρ+3173.1，r2＝0.9996，结果表明N2S2-Memantine在0.1～1.0mg/mL内呈良好线性关系；另取0.1mg/mL的N2S2-Memantine溶液加流动相稀释配成0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的系列标准溶液，分别精密吸取各系列标准溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积A，得到N2S2-Memantine的回归方程为A＝4×106ρ-1855.7，r2＝0.9989，表明N2S2-Memantine在0.005～0.1mg/mL内也呈良好的线性关系；色谱条件色谱柱LichospherC18，4.6×250mm，流动相为乙腈、水和三氟乙酸，其中乙腈∶水体积比为2∶1，三氟乙酸为流动相总体积的2％；紫外检测波长230nm，流速1.00mL/min，柱温25℃；(3)油水分配系数的测定精密称取N2S2-Memantine适量溶于水饱和的正辛醇中配成质量浓度为1.0mg/mL的溶液，取该溶液2mL于10mL具塞管中，加入2mL正辛醇饱和的水、氮气保护25℃摇床振摇72h，离心，分别取油相和水相各20μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，代入标准曲线计算N2S2-Memantine的浓度，油相浓度为ρn，水相浓度为ρw，由公式P＝ρn/ρw得25℃时N2S2-Memantine的正辛醇-水油水分配系数P为50.51，即lgP＝1.70；或以正辛醇-磷酸盐缓冲液体系代替正辛醇-水作为N2S2-Memantine的溶液配制液进行油水分配系数的测定。2、一种脑受体显像剂99mTc-Memantine的油水分配系数测定方法，其特征是，步骤为(1)"，c标记精密称取N2S2-Memantine适量用70%乙醇配成N2S2-Memantine质量浓度为5mg/mL的溶液，精密量取20pL，依次加入20pLlmg/mL用0.1mol/LHC1新鲜配制的SnF2，50(xLlOOmg/mL葡庚糖酸钠，50jiLlOmg/mLEDTA和800(xLpH=6.0的PBS，混匀，加入放射性强度为lmCi"""Tc淋洗液，沸水煮30min;(2)量取上述溶液0.1mL，加入3mL正辛醇和3mL0.lmol/LpH=7.4的PBS，涡旋5min，静置分层，4000rpm离心10min，取有机相、水相各lmL，分别测y计数；(3)取步骤(2)的有机相lmL，加入2mL正辛醇和3mL0.1mol/LpH=7.4的PBS，涡旋5min，静置分层，4000rpm离心10min，取油相、水相各lmL，分别测y计数为y油、y水；每次取油相进行倍比稀释，至少进行5次，每次对倍比稀释后的油相、水相进行测y计数y油、y水，测定分配系数P，油/y水，至样品在两相中的分配比趋于稳定，lgP趋于1.9。全文摘要放射性配基N₂S₂-Memantine和脑受体显像剂^99mTc-Memantine的油水分配系数测定方法，属于核医学分析检测
技术领域：
。放射性配基^99mTc标记前体N-[2-(N-(2-巯基乙基))氨基甲酰甲基]-N-(2-巯基乙基)-3，5-二甲基金刚烷胺基乙酰胺，简称N₂S₂-Memantine。本发明方法采用在正辛醇-水或正辛醇-磷酸盐缓冲液体系中，用HPLC法测定N₂S₂-Memantine的油水分配系数，25℃时，N₂S₂-Memantine的油水分配系数lgP约为1.70，及脑受体显像剂^99mTc-Memantine的油水分配系数测定方法，采用N₂S₂-Memantine先进行^99mTc标记，再在正辛醇-水体系中用γ计数仪测定^99mTc-Memantine的油水分配系数，lgP趋于1.9。结论N₂S₂-Memantine和^99mTc-Memantine均呈脂溶性。文档编号G01N30/02GK101339169SQ20081002176公开日2009年1月7日申请日期2008年8月12日优先权日2008年8月12日发明者周杏琴,张建康,徐希杰,曹国宪,邹美芬,钦晓峰,颜成龙申请人:江苏省原子医学研究所