人源化il-6和il-6受体的制作方法
【专利摘要】本发明描述了一种内源性小鼠IL-6和/或IL-6受体基因被取代的小鼠，及建立和使用所述所述小鼠的方法。本发明提供了在内源性IL-6Rα基因座用人源胞外域编码序列取代小鼠胞外域编码序列的小鼠。本发明还提供了包含受小鼠IL-6调控元件的调控的人源IL-6基因的小鼠，其中包括在内源性小鼠IL-6基因座用人源IL-6编码序列取代小鼠IL-6编码序列的小鼠。
【专利说明】人源化IL-6和IL-6受体
发明领域
[0001]本发明提供了内源性IL-6和/或IL-6受体基因被取代的非人动物。所述非人动物的IL-6和/或IL-6受体基因在内源性非人基因座被含有人源序列的人源IL-6和/或人源化IL-6受体基因取代。带有人源IL-6和/或人源化IL-6受体基因的非人动物，其中所述非人动物不表现转入了人源IL-6基因后的非人动物表征的一种或多种病理症状。
【背景技术】
[0002]在本领域中包含人源IL-6基因的转基因小鼠是已知存在的。然而，人源IL-6转基因在小鼠基因组中的随机插入导致了所述人源IL-6的蛋白表达调控性较差，表现在这类转基因小鼠的很多病理症状，包括但不限于，浆细胞增生和肾小球肾炎。因此，这些小鼠的应用有局限性。
[0003]人们需要表达人源或人源化IL-6和/或人源或人源化IL-6受体的非人动物，如小鼠和大鼠。人们需要这类不表现hIL-6转基因小鼠中存在的一种或多种病理症状的人源化小鼠。
[0004]发明简沭
[0005]一方面，本发明提供了基因修饰的非人动物，其包含在内源性IL-6和/或IL-6受体基因座用编码人源或人源化IL-6和/或IL-6受体的基因取代编码内源性IL-6和/或IL-6受体的基因。本发明提供了鼠类动物，其包含在内源性鼠类IL-6基因座用人源IL-6基因取代内源性IL-6基因；和/或包含用人源IL-6受体基因(或编码所述受体基因胞外域的核苷酸序列)取代内源性IL-6受体基因(或编码所述受体基因胞外域的核苷酸序列)。
[0006]一方面，本发明提供了基因修饰的鼠类动物，其在内源性鼠类IL-6基因座受内源性鼠类启动子和/或内源性鼠类调控元件的调控表达人源IL-6基因。
[0007]—方面，本发明提供了基因修饰的鼠类动物，其在内源性鼠类IL-6受体基因座受内源性鼠类启动子和/或内源性鼠类调控元件的调控表达人源IL-6受体基因(或编码人源胞外域及小鼠跨膜和胞内域的基因)。
[0008]一方面，本发明提供了一种基因修饰的动物(如:鼠类动物，如小鼠或大鼠)，其表达人源IL-6蛋白，其中所述非人动物不表现选自以下组的病理症状:浆细胞增生、肾小球肾炎、肾小球硬化症、系膜增生性肾小球肾炎、肠道淋巴瘤、肾淋巴瘤、脾肿大、淋巴结肿大、肝肿大、骨髓巨核细胞、致密异常性浆细胞、浆细胞浸润到肺或肝或肾、肾系膜细胞增生、大脑过量表达IL-6、白质分枝状小胶质细胞、大脑反应性星形胶质细胞增生、肾衰竭、脾巨核细胞升高、肌肉萎缩(如:腓肠肌萎缩)、肌肉组织蛋白酶B和B+L升高(如:约20倍和6倍)以及这些病理症状的组合。
[0009]在一个实施方式中，所述非人动物包含正常的B细胞种群。在一个实施方式中，所述正常B细胞种群在数量和免疫分型上与野生型动物，如野生型小鼠，大致相同，。
[0010]在一个实施方式中，所述非人动物是鼠类(如:小鼠或大鼠)，且在血清中以低于约 800pg/mL、低于约 700、600、500、400、300、*200pg/mL 的水平表达人源 IL-6 (hIL-6)。在一个【具体实施方式】中，所述鼠类动物在血清中以约为50到约不多于200pg/mL，在另一个实施方式中以约为75-125pg/mL，在另一实施方式中以约为100pg/mL的水平表达hIL_6。
[0011]—方面,本发明提供了一种非人的动物,其表达hIL-6和/或hIL_6R,其中所述非人动物在内源性非人IL-6基因座和/或内源性非人hIL-6R基因座表达hIL-6和/或hIL-6R。在一个【具体实施方式】中，所述非人动物是鼠类(如:小鼠或大鼠)。
[0012]一方面，本发明提供了一种基因修饰的小鼠，其在内源性小鼠IL-6基因座表达hIL-6，其中所述内源性小鼠IL-6基因已被hIL-6基因取代。
[0013]在一个实施方式中，所述小鼠含有表达IL-6受体(IL-6R)的细胞,所述受体包含在细胞表面的人源胞外域。在一个实施方式中，所述细胞为淋巴细胞。在一个实施方式中，所述淋巴细胞为B细胞。
[0014]在一个实施方式中，在内源性小鼠IL-6基因座约6.8kb长的，包括外显子I到5和3’末端非翻译序列被删除并被约4.Skb长的人源IL-6基因中包括外显子I到5的人源IL-6基因序列取代。在一个【具体实施方式】中，所述人源IL-6基因包含人源BAC CTD-2369M23上人源IL-6基因的外显子I到5。
[0015]一方面，本发明提供了一种基因修饰的小鼠，其表达来自人源IL-6基因的IL-6，其中所述小鼠在血清中表达人源IL-6。
[0016]在一个实施方式中，所述小鼠血清中人源IL-6的血清浓度达到从约25到约300pg/mL、从 50 到约 250pg/mL、从 75 到约 200pg/mL、或从 100 到约 150pg/mL。在一个【具体实施方式】中，所述小鼠血清中人源IL-6水平约为100pg/mL。
[0017]在一个实施方式中，所述小鼠骨髓中泛B细胞特异性标记物水平与野生型小鼠大致相同。在一个实施方式中，所述小鼠脾脏中泛B细胞特异性标记物水平与野生型小鼠大致相同。在一个实施方式中，所述泛B细胞特异性标记物选自B220，⑶19，⑶20，⑶22，CD79a, CD79b, L26，和 Pax-5 (BSAP)。
[0018]一方面，本发明提供了一种基因修饰的小鼠，其表达hIL-6，其中所述小鼠不具有选自下组的特征之一:浆细胞增生、脾肿大、淋巴结肿大、致密异常性浆细胞及这些特征的组合。
[0019]在一个实施方式中，所述小鼠包含与野生型小鼠脾脏重量大致相同(单位体重)的脾脏。在一个实施方式中，所述小鼠的淋巴结与野生型小鼠淋巴结重量大致相同(单位体重)。在一个实施方式中，所述小鼠的浆细胞不具有过量表达人源IL-6的小鼠所具有的浆细胞增多的表征。
[0020]在一个实施方式中，所述小鼠不具有肾小球肾炎。
[0021]在一个实施方式中，所述小鼠的系膜细胞水平与野生型小鼠的系膜细胞水平相当。
[0022] 一方面，本发明提供了一种基因修饰的小鼠，其在内源性小鼠IL-6基因座表达hIL-6，其中内源性小鼠IL-6基因被取代为hIL-6基因，其中所述小鼠不具有选自下组的特征之一:形态学上可检出的神经病态、反应性星形胶质细胞增生及这些特征的组合。在一个实施方式中，所述小鼠包含与野生型小鼠大脑无形态学明显差异的大脑。在一个实施方式中，所述小鼠包含反应性星形胶质细胞增生水平不高于野生型小鼠大脑组织中反应性星形胶质细胞增生水平的大脑组织。[0023]在一个实施方式中,所述小鼠在神经兀中不表达人源IL-6。在一个实施方式中,所述小鼠中包含与野生型小鼠中活化星形胶质细胞水平相当的活化星形胶质细胞水平。
[0024]在一个实施方式中，所述小鼠在其白质中包含分枝状小胶质细胞，其中所述分枝状小胶质细胞数量与野生型小鼠分支状小胶质细胞数量相等。
[0025]在一个实施方式中，所述小鼠不具有反应性星形胶质细胞增生。在一个实施方式中，所述小鼠白质在形态学上与野生型小鼠白质无明显差异。在一个实施方式中，所述小鼠白质在反应性星形胶质细胞组织化学染色上与野生型小鼠白质无明显组织学差异。
[0026]在一个实施方式中，所述小鼠大脑与野生型小鼠大脑无明显形态学差异。在一个实施方式中，所述小鼠脑组织中反应性星形胶质细胞增生水平不高于野生型小鼠脑组织中反应性星形胶质细胞增生水平。
[0027]—方面，本发明提供了一种基因修饰的小鼠，其特征在于，所述小鼠在内源性小鼠IL-6基因座表达hIL-6，其中 所述内源性小鼠IL-6基因被hIL_6基因取代，其中所述小鼠不具有选自下组的特征之一:寿命降低约50%或更多、肾衰竭、高丙种球蛋白血症、脾巨核细胞升高、骨髓巨核细胞升高、脾浆细胞增生、胸腺浆细胞增生、淋巴结浆细胞增生、肾小球肾炎、肾小球硬化症及这些特征的组合。
[0028]在一个实施方式中，所述小鼠的寿命超过了 20周。在一个实施方式中，所述小鼠的寿命超过了 30周、40周或50周。在一个实施方式中，所述小鼠的寿命与同品系野生型小鼠的寿命大致相同。
[0029]在一个实施方式中，所述小鼠脾脏巨核细胞水平不高于野生型小鼠皮巨核细胞水平。
[0030]在一个实施方式中，所述小鼠的淋巴器官基本没有异常和致密排列的类浆细胞。
[0031]在一个实施方式中，所述小鼠血清中丙种球蛋白水平与野生型小鼠血清中丙种球蛋白水平持平。在一个实施例中，所述小鼠血清α?-和β_球蛋白水平与同品系野生型小鼠血清α 1-和β_球蛋白水平持平。
[0032]一方面，本发明提供了一种基因修饰的小鼠，其在内源性小鼠IL-6基因座表达人源IL-6，其中内源性小鼠IL-6基因被hIL-6基因取代，其中所述小鼠不具有选自下组的特征之一:肌肉萎缩、与同品系野生型小鼠相比有升高的组织蛋白酶B水平、与同品系野生型小鼠相比有升高的组织蛋白酶A+B水平、与同品系野生型小鼠相比有增加的肝脏重量及这些特征的组合。
[0033]在一个实施方式中，所述小鼠肝脏重量在12周大时约为800_900mg。
[0034]在一个实施方式中，所述小鼠在整个生命周期中表现出不高于野生型小鼠观察水平的组织蛋白酶B水平。在一个实施方式中，所述小鼠具有在整个生命周期中不高于野生型小鼠观察的水平的组织蛋白酶A+B水平。
[0035]在一个实施方式中，所述小鼠成年时表现出同品系野生型小鼠腓肠肌重量10 %的腓肠肌重量。在一个实施方式中，所述小鼠成年时表现出与同品系野生型小鼠腓肠肌重量大致相同的腓肠肌重量。
[0036]一方面，本发明提供了一种小鼠，其包含编码人源IL-6蛋白的核苷酸序列，其中所述编码人源IL-6蛋白的核苷酸序列取代了整个或部分编码内源性小鼠IL-6蛋白的内源性核苷酸序列。[0037]—方面，本发明提供了一种小鼠，其在内源性小鼠IL-6受体基因座用人源IL-6RQ的胞外域序列取代小鼠IL-6Ra胞外域序列以形成人源/小鼠IL_6R α嵌合体基因。
[0038]在一个实施方式中，所述嵌合体IL-6Ra基因在内源性小鼠IL-6Rα基因座受小鼠启动子和/或小鼠调控元件的调控。
[0039]在一个实施方式中，约35.4kb的小鼠IL_6Ra胞外域编码序列被约45.5kb的人源IL-6R胞外域编码序列取代。
[0040]在一个实施方式中，所述人源IL-6R胞外域编码序列是从外显子I的第一个密码子(ATG)到外显子8。
[0041]在一个实施方式中，所述被取代的小鼠IL-6Ra序列包含连续的序列，所述连续序列包含外显子I到8。在一个【具体实施方式】中，外显子I到8及部分第8内含子被删除。
[0042]一方面，本发明提供了一种基因修饰的小鼠，其在内源性小鼠IL-6基因座用编码人源IL-6的人源基因取代编码IL-6的小鼠基因，其中所述编码人源IL-6的人源基因在内源性小鼠IL-6基因座受内源性小鼠调控元件的调控。
[0043]在一个实施方式中，所述编码人源IL-6的人源基因是BAC ID为CTD-2369M23的人源IL-6基因。
[0044]在一个实施 方式中,所述小鼠表达小鼠IL_6Ra。在一个实施方式中,所述小鼠表达人源IL-6Ra。在一个实施方式中，所述人源化的IL-6Ra含有人源胞外域。在一个实施方式中，人源化的IL-6Ra含有小鼠跨膜域和小鼠胞质域。在一个实施方式中，所述小鼠表达的人源化的IL-6Rci包含胞外域的人源化，但不包含跨膜域和/或胞质域的人源化。
[0045]在一个实施方式中，所述小鼠不具有选自下组的特征之一:浆细胞增生、肾小球硬化症、肾小球肾炎、肾衰竭、高丙种球蛋白血症、脾巨核细胞升高、骨髓巨核细胞升高、脾肿大、淋巴结肿大、致密异常性浆细胞及这些特征的组合。
[0046]—方面，本发明提供了一种基因修饰的小鼠，其包含内源性小鼠IL-6Ra基因的人源化，其中所述人源化是用人源IL-6Ra胞外域编码序列取代内源性小鼠IL-6Ra基因座的小鼠IL-6Ra胞外域编码序列。
[0047]在一个实施方式中，用编码人源IL-6Ra胞外域的人源IL_6Ra序列的连续基因组片段取代包含小鼠外显子I到8的连续小鼠序列。在一个实施方式中，所述编码胞外域的人源IL-6Ra序列的连续基因组片段来自BACCTD-2192J23。
[0048]在一个实施方式中，所述小鼠进一步包含人源化的IL-6基因。在一个实施方式中，所述小鼠包含在内源性小鼠IL-6基因座用人源IL-6基因取代小鼠IL-6基因。在一个实施方式中，所述人源化IL-6基因受内源性小鼠调控元件的调控。
[0049]一方面，本发明提供了一种建立人源化小鼠的方法，包括用编码人源IL-6的人源基因取代编码小鼠IL-6的小鼠基因序列。
[0050]在一个实施方式中，所述取代发生在内源性小鼠IL-6基因座，且编码人源IL-6的人源基因与内源性小鼠调控序列被可操作的连接。
[0051]一方面，本发明提供了一种建立人源化小鼠的方法，包括用编码人源IL-6Ra胞外域序列的人源基因组片段取代编码小鼠IL-6Ra胞外域序列的小鼠外显子，以形成人源化的IL_6Ra基因。[0052]在一个实施方式中，所述取代发生在内源性小鼠IL-6Rci基因座，且人源化的IL-6Ra基因与内源性小鼠调控序列被可操作的连接。
[0053]一方面，本发明提供了一种基因修饰的小鼠，其包含的人源化IL-6RCI基因是用人源胞外域序列取代小鼠胞外域编码序列，其中人源化的IL-6Ra基因含有小鼠跨膜序列和小鼠胞质序列；其中所述小鼠还包含编码人源IL-6的基因，其中所述编码人源IL-6的基因受内源性小鼠IL-6调控元件的调控。
[0054]在一个实施方式中，所述小鼠无法表达完整的小鼠IL-6Rci，且无法表达小鼠IL-6。
[0055]在很多方面，本发明所述的基因修饰的小鼠在所述小鼠品系中包含基因修饰。
[0056]一方面，本发明提供了如前所述的小鼠的组织、细胞或细胞膜片段。
[0057]在一个实施方式中，所述的组织或细胞来自于表达人源IL-6蛋白的小鼠，但所述小鼠不表达小鼠IL-6蛋白。在一个实施方式中，所述的组织或细胞来自于表达人源化IL-6Ra蛋白的小鼠，但所述小鼠不表达小鼠IL-6Ra蛋白。在一个实施方式中，所述人源化IL-6Ra蛋白包含人源胞外域及小鼠跨膜域和小鼠胞质域。在一个实施方式中，所述的组织或细胞来自表达人源IL-6、人源化IL-6R α的小鼠，但所述小鼠不表达小鼠IL-6，也不表达含有小鼠胞外域的IL-6Ra。
[0058]一方面，本发明提供了一种小鼠细胞的体外复合物，其包含人源化IL-6Ra (人源胞外域和小鼠跨膜域及小鼠胞质域)和人源IL-6。
[0059]一方面，本发明提供了一种包含如前所述的基因修饰的小鼠胚胎。
[0060]一方面，本发明提供了一种小鼠宿主胚胎，其特征在于，所述胚胎包含如前所述的带有基因修饰的供体细胞。
[0061]一方面，本发明提供了一种包含所述基因修饰的多能性或全能性的非人动物细胞。在一个实施方式中，所述细胞为鼠类细胞。在一个实施方式中，所述细胞是胚胎干细胞。
[0062]一方面，本发明提供了一种小鼠卵子，其中所述小鼠卵子包含异位小鼠染色体，其中所述异位小鼠染色体含有如前所述的基因修饰。
[0063]一方面，所述包含人源IL-6基因或人源或人源化IL-6Rci基因的基因修饰小鼠、胚胎、卵子或细胞来自C57BL品系小鼠，所述品系选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/01a。在另一实施方式中，所述小鼠是129品系，所述品系选自组成所述群体的品系:129P1、129P2、129P3、129X1、129S1 (如 129S1/SV、129Sl/Svlm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(见如:Festing et al.(1999)Revised nomenclature for strainl29mice, Mammalian GenomelO:836,以及 Auerbach et al (2000)Establishment and Chimera Analysis of 129/ScEv-andC57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines)。在一个【具体实施方式】中，所述基因修饰小鼠是以上提到的129品系和以上提到的C57BL/6品系的混合。在另一【具体实施方式】中，所述小鼠是以上提到的129品系内的混合，或以上提到的BL/6品系内的混合。在一个【具体实施方式】中，所述混合的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一实施方式中，所述小鼠是BALB品系，如BALB/c品系。又在另一实施方式中，所述小鼠是BALB品系和另一个以上提到的品系的混合。在一个实施方式中，所述小鼠是Swiss或Swiss Webster小鼠。
[0064]本发明所述的各个方面和实施方式能够一起使用，除非明确或清楚地排除在所述实施例或方面的内容以外。
[0065]附图简沭
[0066]图1提供了人(上)和小鼠(下)IL-6基因组基因座的未按比例缩放的示意图，。图中右侧闭合方块表示外显子1、I1、II1、IV和V(在人和小鼠中都有)。图中左侧开放式方块表示选定的推断的调控区域。
[0067]图2显示了野生型小鼠、人源化胞外域IL-6R小鼠和具有人源化IL-6和IL-6R基因的小鼠中在含有和不含有松节油的情况下的急性时相反应(mSAA水平)。
[0068]图3显示了在不含有或含有抗小鼠IL-6R抗体的情况下野生型小鼠的松节油依赖性急性时相反应(SAA)(左图)；及不含有或含有抗人源IL-6R抗体的人源化IL-6/IL-6R小鼠中松节油依赖性急性时相反应(右图)。
[0069]图4显示了野生型和人源化IL-6小鼠脾脏B细胞流式细胞分析；泛B细胞标记物。
[0070]图5显示了野生型和人源化IL-6小鼠脾脏T细胞流式细胞分析；辅助性T细胞和细胞毒性T细胞。
[0071]图6显示了野生型和人源化IL-6小鼠脾脏细胞流式细胞分析；Ly6G/C (Grl)。
[0072]图7显示了野生型和人源化IL-6小鼠脾脏细胞流式细胞分析；自然杀伤(NK)细胞和粒性白血球(Ly6Ghi+/CDllbhi+)。
[0073]图8显示了野生型和人源化IL-6小鼠血液B细胞流式细胞分析；泛B细胞标记物。
[0074]图9显示了野生型和人源化IL-6小鼠血液T细胞流式细胞分析；辅助性T细胞和细胞毒性T细胞。
[0075]图10显示了野生型和人源化IL-6小鼠血液髓样细胞流式细胞分析；Grl+细胞。
[0076]图11显示了野生型和人源化IL-6小鼠血液髓样细胞流式细胞分析ADllb对Ly6G/C(Grl)。
[0077]图12表示野生型和人源化IL-6小鼠血液髓样细胞流式细胞分析；0乂5对^1113细胞。
[0078]图13显示了野生型和人源化IL-6小鼠骨髓IgM/⑶24/B220流式细胞分析。上:骨髓正常进程。下:野生型、hIL-6杂合子、和hIL-6纯合子(IgM染色)流式细胞分析。
[0079]图14显示了野生型和人源化IL-6小鼠骨髓IgM/⑶24/B220流式细胞分析。上:骨髓正常进程。下:野生型、hIL-6杂合子、和hIL-6纯合子(⑶24染色)流式细胞分析。
[0080]图15显示了野生型和人源化IL-6小鼠骨髓⑶43和B220流式细胞分析。上:骨髓正常进程。下:野生型、hIL-6杂合子、和hIL-6纯合子(⑶43染色)流式细胞分析。
[0081]发明详描
[0082]IL-6 和 IL-6R
[0083] IL-6受体(IL-6R)很长时间以来被表征为B细胞刺激因子(BSF-2，或B细胞刺激因子2 ;及BCDF，或B细胞分化因子)受体，负责诱导B细胞以合成免疫球蛋白(Yamasakiet al.(1998)Cloning and Express1n of the Human Interleukin-6 (BSF-2/IFN β 2)Receptor, Science241:825-828)。IL-6最早被描述为干扰素-β 2，这是由于IL-6是在通过用双链RNA聚肌胞苷酸(dSRNAp0ly(I)p0ly(C))处理人成纤维细胞诱导抗病毒性的反应，以寻找被称为干扰素-β的病毒诱导的蛋白的过程中发现的(Weissenbach et al.(1980)Two interferon mRNAs in human fibroblasts:In vitro translat1n and Escherichiacoli cloning studies，Proc.Natl Acad.Sc1.USA77 (12):7152-7156 ；Keller et al.(1996)Molecular and Cellular B1logy of Interleukin_6and Its Receptor， Frontiers inB1sciencel:d340_357)。
[0084]人cDNA编码一种468个氨基酸的蛋白质，所述蛋白质包含一段19肽的信号序列和约82个氨基酸的缺少酪氨酸激酶结构域的胞质域(见同上)。所述蛋白质的N末端(胞外域)含有约90个氨基酸的免疫球蛋白(Ig)超家族结构域，250个氨基酸的在免疫球蛋白超家族结构域和细胞膜之间的结构域，和约28个氨基酸的跨膜区(见同上)。所述受体的胞外域与所述受体配体IL-6结合，IL-6触发了所述受体与细胞膜上的人糖蛋白130(gpl30)的结合且由这个复合物进行信号转导；据报道所述胞质域不转导信号(Tagaet al.(1989) Interleukin-6Triggers the Associat1n of Its Receptor with a PossibleSignal Transducer，gpl30，Cell58:573-581)。的确，缺少胞质域的IL-6R的可溶性形式可以在细胞表面上与IL-6相关联并结合gpl30且有效地转导信号(同上)。
[0085]hIL-6R和mIL-6R在蛋白水平的同源性仅有约54% ;跨膜域同源性约79%，而胞质域同源性约 54% (Sugito et al.(1990))。
[0086]所述IL-6R的天然配体IL-6，最早是从培养的HTLV-1-转化T细胞中分离得到的(见 Hirano et al.(1985) Purificat1n to homogeneity and characterizat1n ofhuman B cell differentiat1n factor (BCDF or BSFp-2)，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:5490-5494)。编码IL -6基因的人cDNA被至少克隆过两次，一次作为BSF_2(见Hiranoet al.(1086)Complemetary DNA fro a novel human interleukin (BSF-2)that induces Blymphocytes to produce immunoglobulin, Nature324:73-76)，一次作为干扰素(IFN)β 2 (见Zilberstein et al.(1986) Structure and express1n of cDNA and genes for humaninterferon-beta—2，a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines,EMB05:2529-2537)，尽管从那之后重组人源IL-6被证明不具有可检出的干扰素活性。
[0087]人源IL-6是一种包含184个氨基酸的蛋白质，其与小鼠IL-6仅有约42%的同源性，尽管人和小鼠基因的基因组结构基本相同，且人和小鼠基因的启动子区域都有一段 400bp 高度保守的片段(见 Tanabe et al.(1988)Genomic Structure of the MurineIL_6Gene:High Degree Conservat1n of Potential Regulatory Sequences between Mouseand Human，J.1mmunol.141 (11):3875-3881)。
[0088]所述人源IL-6 基因约 5kb 长(Yasukawa et al.(1987) Structure and express1nofhuman B cell stimulatory factor-2(BSC-2/IL-6)gene, EMBO J.6(10):2939-2945)，而所述小鼠 IL-6 基因约 7 kb 长(Tanabe et al.(1988) Genomic Structure of the MurineIL_6Gene:High Degree Conservat1n of Potential Regulatory Sequences between Mouseand Human，J.1mmunol.141 (11):3875-3881)。据报道小鼠和人源IL-6基因都有对调控很重要的高度保守的5’端侧翼序列。图1为人源和小鼠IL-6基因组基因座的示意图(未按比例缩放)。外显子1、I1、II1、IV和V(在人和小鼠中都有)在图中右侧显示为闭合方块。选定的推断调控区域在图中左侧显示为开放性方块。人类的推断调控区域从左到右为-557到-552的糖皮质激素元件；_472到-468的干扰素增强子核心序列；_466到-461的糖皮质激素元件；_395到-334的AT富集区；_383到-277的共有的转录激活因子(AP)-1结合位点；-253到-248的IFN增强子核心序列「205到-192的含有GGAAA的二级结构「169到-82的c-fos血清反应元件(SRE)同源序列，所述序列含有干扰素(IFN)增强子核心序列、环磷酸腺苷(cAMP)反应元件、GGAAA 二级结构、CCAAT盒和GC富集区；_61到-55的转录激活因子(AP)-1结合位点以及-34到-30的CCAAT盒。小鼠的推断调控区域从左到右为-553到-536的GC富集区、-521到-516和-500到-495的糖皮质激素元件；_447到-396的Z-DNA片段；-227到-288的与干扰素(IFN)增强子核心序列重叠的转录激活因子(AP)-1结合位点、-210到-195的与干扰素(IFN)增强子核心序列重叠的GGAAA 二级结构；_171到-82的c-fos血清反应元件(SRE)同源区，含有环磷酸腺苷(cAMP)反应元件、与干扰素(IFN)增强子核心序列重叠的GGAAA 二级结构和GC富集区；以及-61到-55的转录激活因子(AP)-1结合位点。小鼠密码子I到V长度分别为:19、185、114、150和165。小鼠内含子长度为:1到II之间162bp ；II到III之间1253bp ；III到IV之间2981bp ；IV到V之间1281bp。人类密码子I到V长度为:19、191、114、147和165。人类内含子长度为:1到II之间154 ；11到III之间1047 ；111到IV之间706 ；IV到V之间1737。基因组结构数据来自 Tanabe et al.(1988),和 Yasukawa et al.(1987) Structure and express1n ofhuman Bcell stimulatory factor-2 (BSC-2/IL-6) ge ne, EMBO J.9 (10):2939_2945。
[0089]以下的假设也许是合理的:基于小鼠和人源IL-6基因5’端侧翼序列的相似性，对小鼠和人源IL-6基因的调控作用似乎是相似的。多种细胞类型在对白介素(IL)-l、肿瘤坏死因子(TNF)、血小板衍生生长因子(TOGF)、干扰素(IFN) β、血清、聚肌胞苷酸(poly (I)poly (C))和放线菌酮发生应答的情况下表现出升高的IL-6表达(见Tanabe et al.(1988)。人体中IL-6介导急性时相反应、造血、B细胞分化、T细胞活化、生长和/或分化和/或活化多种细胞类型(如肝细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞、垂体细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、乳腺癌细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、破骨细胞等等)(见综述，如Heinrichet al.(1990), Kishimoto et al.(1989)和 Keller et al.(1996) ；Sugita et al.(1990)Funct1nal Murine Interleukin Receptor with Intracisternal A Particle Gene Productat its Cytoplasmic Domain, J.Exp.Med.171:2001-2009)。
[0090]然而在实践中，人源IL-6转基因小鼠具有诸多的严重并致弱的(a panoply ofsubstantial and debilitating)病理症状，反映出显著的IL_6基因多效性。含有包含所述人源IL-6基因和μ增强子(Εμ)的6.6kb片段的转基因小鼠，所述小鼠产生高浓度hIL-6和极高水平的IgGl (高出野生型小鼠120到400倍)，反映出伴有浆细胞增生、系膜增生性肾小球肾炎以及高水平骨髓巨核细胞的IL-6的异常(Suematsu et al.(1989)IgGlplasmacytosis in interIeukin6transgenic mice, Proc.Natl Acad.Sc1.USA86:7547-7551)。IL_6和/或IL-6R的异常调控作用是与骨髓瘤、浆细胞瘤、风湿性关节炎、卡斯特莱曼病(Castleman' s disease)、系膜增生性肾小球肾炎、心脏粘液瘤、楽;细胞瘤(plams cell neoplasias)、银屑病以及其他病症相关联的(见Kishimoto, T.(1989)The B1logy of Interleukin-6, Blood74 (I):1-10 ；Sugita et al.(1990);还有 Hirano etal.(1990)B1logical and clinical aspects of interleukin6, Immunology Todayll (12):443-449))。IL-6还牵涉到维持通过旁分泌和/或自分泌机制进行的雄激素剥夺治疗的前列腺癌病人的内前列腺雄激素水平，IL-6潜在地为去势难治性前列腺肿瘤的生长提供支持(Chun et al.(2009) Interleukin-6 Regulates Androgen Synthesis in Prostate CancerCells, Clin.Cancer Res.15:4815-4822)。
[0091 ] 所述人源蛋白是含212个氨基酸的蛋白质，成熟的形式是剪切掉28个氨基酸信号序列而形成的含184个氨基酸的蛋白质。所述蛋白质含有两个N-糖基化位点和两个O-糖基化位点，在一些细胞中人源IL-6被磷酸化。所述小鼠蛋白是含211个氨基酸的蛋白质，成熟的形式是剪切掉23个氨基酸信号序列而形成的含187个氨基酸的蛋白质。小鼠蛋白含有O-糖基化位点，而不含N-糖基化位点(见关于IL-6的综述，如Heinrich et al.(1990)Interleukin_6and the acute phase response, B1chem.J.265:621-636)。
[0092]IL-6功能是多效性的。在活化的B细胞上含有IL-6受体，而据报道休眠B细胞上不含有IL-6受体。相比之下，IL-6R存在于休眠T细胞上且据报道可以促进T细胞分化、活化和增殖，包括T细胞在有IL-2的情况下分化成细胞毒性T淋巴细胞。
[0093]人源化IL-6/IL-6R胞外域小鼠和IL_6介导的急性时相反应
[0094]在人体中，IL-6诱导了急性时相反应。早期对人肝细胞的研究发现IL-6诱导的急性时相蛋白包括:如剂量和时间依赖性的C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)(综述 Heinrich et al.(1990) Interleukin_6and the acute phase response, B1chem.J.265:621-636)。由此含有人源化IL-6和IL-6R基因的非人动物如小鼠和大鼠对检测人源IL-6介导的急性时相反应是很有用处的系统。这些动物还对判断一种物质是否诱导了由IL-6介导的急性时相反应有帮助，通过将本发明所述的人源化IL-6/IL-6R动物暴露于所述物质，检测一种或多种急性时相反应蛋白(或RNA)水平。在一个实施方式中，将人源化动物在含有人源IL-6R的阻断剂情况下暴露于所述物质，并测量一种或多种急性时相反应蛋白(或RNA)水平，其中在含有人源IL-6R阻断剂情况下急性时相反应蛋白(或RNA)水平的下降说明了人源IL-6R介导的急性时相反应。
[0095]人源IL-6与人源IL-6R和小鼠IL-6R都可以结合；小鼠IL-6与小鼠IL-6R结合但不能与人源IL-6R结合(检测不到mIL-6与hIL_6R的结合，而hIL_6可与mIL_6竞争性结合到 mIL_6R 上；Coulie et al.(1989)High-and low-affinity receptors for murineinterleukin6.Distinct distribut1n on B and T cells, Eur.J.Tmmunol.19:2107-211)；又见如 Peters et al.(1996) The Funct1n of the Soluble Interleukin6 (IL-6) ReceptorIn Vivo:Sensitizat1n of Human Soluble IL-6Receptor Transgenic Mice TowardsIL-6and Prolongat1n of the Plasma Half-life of IL-6, J.Exp.Med.183:1399-1406)。因此，小鼠体内带有hIL-6R的人源细胞(如在异种移植中)不可以依靠内源性mIL-6发挥IL-6介导的功能，所述功能包括但不限于IL-6对血细胞或淋巴细胞发育的作用(如造血功能、B细胞活化、T细胞活化等)。
[0096]在含有野生型小鼠IL-6基因和人源IL-6R基因(但无小鼠IL-6R基因)的混合的活体内，急性时相反应诱导因子不一定会诱导出可测得的显示急性时相反应的急性时相蛋白水平。然而，本发明所述的包含人源化IL-6基因和包含带人源化胞外域序列的IL-6R基因的人源化小鼠却能够对急性时相反应诱导因子做出反应并在血清中表达急性时相反应蛋白。针对IL-6/IL-6R为野生型的小鼠被用来测试在含有或不含有急性期诱导因子松节油的情况下的急性时相蛋白的表达，所述小鼠显示了松节油依赖性的急性时相蛋白升高。带有人源化IL-6而非IL-6R基因的小鼠，在含有松节油情况下不表现急性时相反应。但是同时带有人源IL-6基因和人源化胞外域的IL-6R基因的小鼠，则表现出强烈的急性时相反应(图2)。由IL-6介导的急性时相反应在野生型小鼠(图3，上)和人源化IL-6/IL-6R胞外域小鼠(图3，下)中都是IL-6依赖性的，这从合适的抗IL-6R抗体在有足够高的抗体剂量时能消除急性时相反应的能力中可以看出。因此，IL-6和IL-6R的双重人源化重演了针对血清急性时相反应蛋白的野生型IL-6介导的急性时相反应。
[0097]基因修饰的小鼠
[0098]本发明提供了基因修饰的小鼠，其特征在于，所述小鼠在内源性小鼠基因座表达人源IL-6和/或人源化IL-6受体，其中内源性小鼠IL-6基因和/或内源性小鼠IL-6受体基因被带有编码人源IL-6受体胞外域序列的人源IL-6基因和/或人源序列取代。所述基因修饰小鼠表达的人源IL-6和/或人源化IL-6受体来自人源化内源性基因座，所述基因座受小鼠启动子和/或小鼠调控元件的调控。在内源性小鼠基因座上发生的取代使得表达有人源IL-6和人源化IL-6受体的非人动物不具有在现有已知的IL-6转基因小鼠中观察到的繁多的实质性病理症状。
[0099]在本领域中表达人源IL-6的转基因小鼠是已知存在的。然而，所述小鼠通常带有显著的病理症状，使得所述小鼠用途严重受限。本发明所述的人源化小鼠在内源性小鼠IL-6和IL-6R α基因座表达受内源性小鼠调控元件调控的人源IL-6和/或人源化IL-6受体。这些小鼠中这些基因的表达模式反而不同于已知的转基因小鼠。
[0100]在内源性非人的基因座用同源或直系同源的人源基因或人源序列取代非人动物中的非人基因，并受内源性启动子和/或调控元件的调控，可以得到也许非常不同于典型的敲除加转基因的动物的品质和特征的非人动物。在典型的敲除加转基因的动物中，内源性基因座被移除或破坏后一整段人源转基因被插入到动物的基因组中，所述人源转基因可能随机整合到动物基因组中。通常，整合过的转基因的位置是未知的；人源蛋白质的表达是通过对人源基因的转录和/或蛋白质检测和/或功能性检测来测定。将人源基因上游和/或下游包含进人源序列显然是假定无论所述转基因插入动物基因组的什么位置都足以给转基因的表达和/或调控提供适宜的支持。但是在很多情况下，带有人源调控元件的转基因的表达模式是生理上不健全的或不能令人满意的，且可以对动物造成伤害。相比之下，
【发明者】证明了在受内源性调控元件调控的内源性基因座用人源序列进行取代后得到了生理上健全的表达模式和水平，从而获得了有用处的人源化动物，该动物的生理机能就被取代的基因而言是对人源化动物的生理环境有意义并健全的。
[0101]据报道将一种含有主要组织相容性复合物(MHC)I类启动子H2和β-球蛋白内含子并驱动695bp的小鼠IL-6基因的表达的载体结构注射进入小鼠受精卵中，由此产生的小鼠可持续性地表达相对高水平的小鼠IL-6 (与野生型小鼠比较)(见Woodrofeet al.(1992)Long-Term Consequences of Interleukin_60verexpress1n in TransgenicMice, DNA and Cell B1logyll (8):587-592)。但这些小鼠更容易发展出与肠道、淋巴结、肾以及脾淀粉样蛋白沉积相关联的淋巴瘤。这些小鼠也会表现出异常的B细胞成熟(见Woodrofe et al., Id.),由此对B细胞功能的研究也受到影响。相比之下,本发明所述的在小鼠IL-6基因座用人源IL-6基因取代小鼠IL-6基因的小鼠不易发展出这类淋巴瘤，且所述小鼠表现出明显正常的B细胞种群。
[0102]据报道hIL-6转基因小鼠(C57BL/6)的产生是由于6.6kb (BamHl-Pvu II片段)长的含有与IgM增强子相连的hIL-6基因的人源DNA的随机插入(见Suematsu et al.(1989)IgGl plasmocytosis in interIeukin6transgenic mice.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:7547-7551)。所述小鼠在血清中表达的hIL_6在800pg/mL和20，000pg/mL之间，而野生型小鼠一般仅表达约100pg/mL的IL-6。所述小鼠随着衰老表现出升高的血清免疫球蛋白(高出野生型小鼠120-400倍)和降低的白蛋白。所述小鼠患有大规模的浆细胞增生，表现出脾肿大和淋巴结肿大，以及骨髓中出现浆细胞和增多的巨核细胞。据检测，疑似肿大的淋巴结实际上是大量致密异常性浆细胞。所述小鼠脾脏和胸腺都表现出浆细胞大量增生，并浸润入部分肺、肝脏和肾脏。这些小鼠的肾脏也表现出IL-6刺激产生的系膜增生性肾小球肾炎中典型的系膜细胞增生。类似地，由小鼠H-2Ld启动子驱动的修整过的hIL-6cDNA被随机地插入基因组而获得的转基因小鼠(BALB/c)也表现出严重的浆细胞增生(见Suematsu etal.(1992) Generat1n of plasmacytomas with the chromosomal translocat1n t (12 ； 15)in interleukin6transgenic mice, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:232-235)。尽管过量表达hIL-6的C57BL/6小鼠不发展出移植性浆细胞瘤(所述小鼠具有浆细胞增生)，但是据报道回交成BALB/c小鼠的转基因BL/6小鼠却发展出了移植性浆细胞瘤。
[0103]据报道由神经胶质酸性蛋白(GFAP)基因启动子驱动的hIL_6cDNA的随机转基因导致了小鼠中枢神经系统中hIL-6的过量表达，这种随机转基因也引起了很多显著的病理症状(见 Campbell et al.(1993)Neurologic disease induced in transgenic mice bycerebral overexpress1n of interleukin6，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:10061-10065)。这些小鼠具有在中枢神经系统中表达IL-6所引起的广泛的神经病理和反应性星形胶质细胞增生，这是由IL-6转基因随机整合到明显是中枢神经系统允许的转录基因座而导致的失控引起的。尽管将hIL-6cDNA连接到β球蛋白3’非翻译区，用神经元特异的烯醇酶启动子驱动并将所述hIL-6cDNA显微注射进小鼠受精卵(FlC57BL/6x BALB/c)中，所述hIL-6cDNA表达产生的小鼠拥有正常的寿命，也没有由于仅在神经元中而非其他地方表达hIL_6 而导致的明显的神经性缺陷(见 Fattor et al.(1994) IL_6Express1n in Neuronsof Transgenic Mice Causes Reactive Astrocytosis and Increase in Ramified MicroglialCells But No Neuronal Damage, Eur.J.Neuroscience7:2441-2449)，但是所述小鼠具有在整个大脑中伴随增加的高水平的(高于野生型20到30倍)活化和增大的星形胶质细胞，且白质中的分枝状小胶质细胞增加了 10到15倍。因此，报道的脑部IL-6的表达引起的症状范围从反应性星形胶质细胞增生到明显且严重的(frank and profound)神经病理。
[0104] 据报道将一段与β球蛋白3’非翻译区和小鼠金属硫蛋白(MT)-1启动子连接的639bp的hIL-6cDNA显微注射进入C57BL/6x"DBAII”的Fl杂交小鼠的受精卵中而获得的转基因小鼠，所述小鼠由于hIL-6基因的随机整合而呈虚弱状和病态，且所述小鼠因肾衰竭而早死(见 Fattori et al.(1994) Blood, Development of Progressive Kidney Damage andMyeloma Kidney in Interleukin-6Transgenic Mice, Blood63 (9):2570-2579)。转基因小鼠在12-20周死亡并表现出升高的浆细胞α I和β-球蛋白水平、高丙种球蛋白血症、升高的脾(高出野生型3倍)和骨髓巨核细胞、以异常和致密排列的类浆细胞为特征的淋巴器官(脾、胸腺和淋巴结)浆细胞增生症以及导致类似多发性骨髓瘤的肾小球硬化症的肾小球肾炎。
[0105]将H-2Ld驱动的hIL-6cDNA显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中引起了小鼠IL-6依赖性的肌肉萎缩，其部分特征是与同等体重对照组相比的转基因小鼠中腓肠肌重量显著偏低，这种差异在用IL-6阻断剂处理后有所改善(见Tsuiinaka et al.(1996)Interleukin6Receptor Antibody Inhibits Muscle Atrophy and Modulates ProteolyticSystem in Interleukin6Transgenic Mice, J.Clin.1nvest.97 (I):244-249)。这些小鼠在12周大时表现出血清hIL-6水平高于600000pg/mL。转基因小鼠肝脏重量约为1242mg，相比之下对照组肝脏约862mg。用IL-6阻断剂处理的转基因小鼠肝脏重量约888mg。转基因小鼠肌肉组织蛋白酶B和B+L显著高于(20倍和6.2倍)对照组，而这种现象在用IL-6阻断剂处理后的转基因小鼠中消失了。组织蛋白酶B和L mRNA估计分别约为野生型小鼠的277%和257% ;所述差异在用IL-6拮抗剂处理后显著降低。
[0106]包含由小鼠MHC I类H_2Ld启动子驱动的hIL-6迷你基因和由鸡β肌动蛋白启动子驱动的hIL-6R迷你基因以及一个gpl30基因的小鼠具有hIL_6转基因小鼠典型的病理症状(如高丙种球蛋白血症、脾肿大、细胞增生性肾小球肾炎、肺部淋巴细胞浸润)和心室肥厚(Hirota et al.(1995) Continuous activat1n of gpl30, asignal-transducing receptor component for interleukin6-related cytokines, causesmyocardial hypertrophy in mice, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA92:4862-4866)。心室肥大被认为是由gpl30连续活化介导的(Id.)。据报道IL-6的作用是帮助加强细胞因子受体复合物并诱导gpl30的二聚化作用，其中gpl30是负责转导IL-6信号的信号转导组成成分(Panoessa et al.(1995)Two distinct and independent sites on IL_6triggergpl30dimer format1n and signaling, EMBO J.14(9):1942-1951)。活化的复合物被认为是六聚体，由两个IL-6，每个IL-6联结一个IL-6Ra和两个gpl30(每个IL-6含有两个独立的gpl30联结 位点)而组成，形成2:2:2的化学计量关系，其中gpl30的二聚化引起JAK-Tyk酪氨酸激酶的活化、gpl30和信号转导与转录激活因子(STAT)家族转录因子以及其他胞内物质的磷酸化(Id.；Stahl, N.(1994)Associat1n and Activat1nofJak-Tyk Kinases by CNTF-LIF-0SM-1L-6 β Receptor Component, Science263:92-95),所述过程与细胞因子受体复合物形成的通用模型一致(见Stahl, N.和Yancopoulos,G.(1993)The Alphas, Betas, and Kinases of Cytokine Receptor Complexes, Cell74:587-590 ；Davis et al.(1993) LIFRβ and gpl30as Heterodimerizing Signal Transducersof the Tripartite CNTF Receptor, Science260: 1805-1808 ；Murakami et al.(1993)IL-6-1nduced Homodimerizat1n of gpl30and Associated Activat1n ofa TyrosineKinase, Science260:1808-1810)。
[0107]据报道包含由大鼠磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧激酶启动子驱动的人SIL-6R和由小鼠金属硫蛋白-1启动子驱动的人源IL-6的转基因小鼠明显小于只包含人源IL-6或只包含人 sIL_6R 的转基因小鼠(Peters et al.(1997) Extramedullary Expans1n ofHematopoietic Progenitor Cells in Interleukin(IL_)-6_sIL_6R Double TransgenicMice, J.Exp.Med.185(4):755-766)，所述现象反映在减少的体脂肪和降低的体重(20_25g对40g)上。与报道的单转基因小鼠正常器官重量相比，报道的双转基因小鼠还具有脾肿大(5倍)和肝肿大(2倍)，这明显是源于脾和肝而非骨髓的造血细胞的髓外增殖，以及脾巨核细胞升高和浆细胞浸润到所有实质器官中(同上)。与单转基因小鼠相比，双转基因小鼠在肝脏中还具有升高约200到约300倍的粒细胞、巨噬细胞、祖细胞和B细胞；相比之下，IL-6单转基因小鼠具有少量的巨噬细胞(15倍)升高和B细胞(45倍)升高(同上)。这种不寻常的发现可能是由于激活gpl30信号转导导致的对造血祖细胞生长和分化的刺激(同上)。
[0108]进一步地，有报道双转基因小鼠(小鼠金属硫蛋白-1驱动的hIL-6/大鼠磷酸烯醇丙酮酸羧激酶启动子驱动的人hIL-6R)具有的肝细胞增生与伴有持续性肝细胞增殖的人结节性再生性增生完全相同，强烈提示IL-6可能导致肝细胞增殖和致病性肝细胞转化的发生(Ma1ne et al.(1998) Coexpress1n of IL_6and soluble IL-6R causes nodularregenerative hyperplasia and adenomas ofthe liver, EMBO J.17 (19):5588-5597)。据报道由于在hIL-6单转基因小鼠中没有观察到肝细胞增生，且hIL-6可以与mIL-6R结合，因此这个发现看似矛盾，直到考虑到双转基因小鼠可能产生更高水平的复合物状的hIL-6，对可溶性IL-6R(这里是可溶性hIL-6R)来说，所述复合物与单独的IL-6相比是更有效的拮抗剂(同上)。
[0109]与人源IL-6转基因小鼠相比，在内源性小鼠IL-6基因座存在保留有小鼠调控元件但却包含IL-6编码序列的人源化的取代的人源化IL-6小鼠，不具有已知小鼠的严重病理症状。杂合或纯合的hIL-6基因修饰小鼠都非常正常。
[0110]对在实施例中所述的带有人源化IL-6基因(MAID760)的小鼠进行免疫分型检测并在脾脏B细胞流式细胞分析(淋巴细胞门控)中通过使用泛B细胞标记物(⑶445R(B220))发现B细胞数量正常(图4)。在脾脏中，野生型小鼠具有63%的B细胞；杂合hIL-6小鼠具有63 %的B细胞；内源性小鼠基因座的纯合hIL-6小鼠具有63 %的B细胞。用TNP-KLH免疫过的纯合hIL-6小鼠中B细胞数量也正常(野生型小鼠有65%，hIL_6纯合子小鼠有61% )。
[0111]脾脏T细胞数量也与野生型小鼠大致相同(图5)。辅助性T细胞/细胞毒性T细胞的脾脏T细胞百分比为野生型20% /40% (比例为1.4:1);杂合hIL-6小鼠23%/14% (比例为1.6:1);纯合hIL-6小鼠21% /15% (比例为1.4:1)(标记物为CD8a_APC ；⑶4-FITC)。用TNP-KLH免疫过的纯合hIL_6小鼠具有与野生型小鼠类似的脾脏T细胞数量，如辅助性T细胞/细胞毒性T细胞为22% /20% (比例为1.1:1)，相比之下野生型小鼠为21% /19% (比例也是1.1:1)。
[0112]在细胞流式分析(⑶IIb和DX5)中人源化IL-6小鼠也具有大约正常水平的脾脏自然杀伤细胞(图7)。hIL-6杂合子具有2.2%的自然杀伤细胞，hIL-6纯合子具有1.8%的自然杀伤细胞，而野生型小鼠具有2.4%的自然杀伤细胞。用TNP-KLH免疫过后，纯合小鼠具有1.6%的脾脏自然杀伤细胞，而野生型小鼠具有2.1 %的脾脏自然杀伤细胞。
[0113]人源化IL-6小鼠也具有正常水平的脾Ly6G/C(Grl)细胞(图6)。hIL_6杂合子具有7.0%的GRl+细胞(1.3% Grlhi);纯合子具有6.8%的Grl+细胞(0.9% Grlhi)，而野生型小鼠具有8.0 %的Grl+细胞(1.8+Gr Ihi)。经免疫的IL-6纯合子(用TNP-KLH免疫)具有11%的Grl+细胞(4.0% Grlhi),而野生型小鼠具有10%的Grl+细胞(3.0% Grlhi)。
[0114]在流式细胞分析中人源化IL-6小鼠还具有正常的血液B细胞和T细胞数量(图8和图9)，使用泛B细胞标记物(CD445R(B220))的流式细胞分析显示了纯合hIL_6小鼠具有52%的B细胞，相比之下野生型具有53% ;杂合小鼠具有38% (29%和47%的两个不同染色的平均值)。用TNP-KLH免疫过的纯合hIL-6小鼠也给出类似的B细胞数量(43%，相比之下野生型小鼠为45%)。
[0115]在使用⑶8a和⑶4染色检测的细胞流式分析中人源化的IL_6小鼠具有正常的血液T细胞数量。杂合hIL-6小鼠具有的辅助性T细胞/细胞毒性T细胞数量为39% /26%(比例为1.5:1);纯合hIL-6小鼠具有的辅助性T细胞/细胞毒性T细胞数量为24% /20%(比例为1.2:1)，而野生型小鼠具有的辅助性T细胞/细胞毒性T细胞数量为26% /20%(比例为1.3:1)。用TNP-KLH免疫的纯合hIL-6小鼠的辅助性T细胞/细胞毒性T细胞数量为29% /21% (比例为1.4:1)，而野生型免疫小鼠的辅助性T细胞/细胞毒性T细胞数量为28% /23% (比例为1.2:1)。
[0116]对未经免疫和经免疫的小鼠使用Ly6G/C(Grl)和⑶11b，以及⑶Ilb和DX5进行血液染色的流式细胞分析测定人源化IL-6小鼠具有的血液骨髓细胞数量也与野生型小鼠类似(图10、图11和图12)。杂合hIL-6小鼠具有的Gr+细胞百分比为10.8%，纯合子为6.9%,而野生型小鼠为9.7%。经免疫的hIL-6纯合子具有的Ml (101-104的Ly6G/C (Gr)) /M2 (102-103的Ly6G/C (Gr)染色)数量为43%/34%，而野生型小鼠数量为45%/38%。经免疫的纯合hIL-6小鼠的CDllb(竖轴)对Ly6G/C(横轴)的流式细胞图表显示在各象限细胞百分比(左上/右上/右下)为16% /8% /3%，与经免疫的野生型小鼠象限数字相同。
[0117]纯合的用TNP-KLH免疫过的人源化IL-6小鼠具有的⑶Ilb对DX5(自然杀伤细胞)染色的流式细胞图表与经免疫的野生型小鼠类似。血液流式细胞图表象限分析(CDllb竖轴，DX5(自然杀伤细胞)横轴)显示左上/右上/右下数字为1111^-6纯合子9.5(% /17%/10%，野生型小鼠 6.5% /17.3% /14%。 [0118]人源化小鼠具有的同型反应与观察的野生型小鼠基本相同。早期和末期IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgE和IgM水平与在野生型小鼠中观察的大致相同。在一个实验中，末期IgM在人源化小鼠中稍高；末期IgG3在人源化小鼠中也有所升高。
[0119]基于对骨髓IgM/⑶24/B220染色的流式细胞分析，在未经免疫的hIL_6小鼠中B细胞发育与野生型小鼠中B细胞发育基本难以区别(图13)。经免疫的小鼠的免疫分型检测显示在B细胞发育进程中各种细胞类型的标记物种群在hIL-6小鼠中基本正常。造血干细胞、共同淋巴祖细胞、祖B细胞、B前体细胞、未成熟和成熟B细胞的细胞进程在hIL-6小鼠中都正常(图14和图15)。
实施例
[0120]实施例1:hIL_6基因取代内源性小鼠IL-6基因
[0121]含有人源IL-6基因外显子I到4的4.8kb的人源IL_6基因取代了鼠类IL_6基因的基因座上的6.8kb的片段。
[0122]在单一靶向步骤中的用人源IL-6的取代小鼠基因的靶向构建体是通过使用VELOC丨GENE? 遗传工程技术构建的(见 Valenzuela et al.(2003)High-throughputengineering of the mouse genome coupled with high-resolut1n express1n analysis,Natrue B1tech，21 (6):652-659)。小鼠和人源IL-6DNA分别来自细菌人工染色体(BAC)RPC1-23克隆368C3，和BAC CTD克隆2369M23。简言之，一个通过缺口修复克隆获得的NotI线性化靶向构建体通过电穿孔方法导入到F1H4小鼠胚胎干(ES)细胞中(C57BL/6xl29Fl杂交)，所述构建体含有小鼠IL-6上游和下游同源臂并在其两翼之间连接有4.8kb的从外显子I的ATG延伸到外显子5并带有3’端下游序列的16个核苷酸(基因组坐标:NCBIh37.1:ch7:22, 766，882到22，771，637)的人源IL-6序列和被1xP位点包围的新霉素磷酸转移酶(neo)选择标记盒。正确靶向的ES细胞(MAID790)通过电穿孔方法进一步导入一个瞬时Cre表达载体以移除药物选择标记盒。通过VELOOMOUSE+i)方法将不
含药物标记盒的靶向的ES细胞克隆(MAID1428)导入进8细胞期的小鼠胚胎(见美国专利号 7, 294, 754, 7, 576, 259, 7, 659, 442 和 Poueymirou et al.(2007)FOgenerat1n micethat are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowingimmediate phenotypic analyses, Nature B1tech.25(1):91-99)。带有人源化 IL-6 基因的VELOOMICE?小鼠(H)小鼠整体源自供体ES细胞)是通过使用改进的等位基因检测方法对小鼠等位基因的丢失和人源等位基因的获得进行基因型检测识别的。
[0123]正确靶向的ES细胞克隆通过天然等位基因的丢失(LONA)的检测方法(Valenzuela et al.2003)得以被识别,在所述检测方法中，对天然的未经修饰的IL_6基因拷贝数的测定是通过用两个特异性针对小鼠IL-6基因中被靶向敲除序列的TaqMan?定量聚合酶链式反应(qPCRs)来实现的。所述qPCR检测实验包含下组引物探针(5’到3’书写顺序):上游正向引物，TTGCCGGTTT TCCCTTTTCT C (SEQ ID NO:1);上游反向引物，AGGGAAGGCCGTGGTTGTC (SEQ ID NO:2);上游探针，FAM-CCAGCATCAG TCCCAAGAAG GCAACT-BHQ (SEQ ID NO:3);下游正向引物，TCAGAGTGTG GGCGAACAAA G(SEQ ID NO:4);下游反向引物，GTGGCAAAAGCAGCCTTAGC(SEQ ID NO:5);下游探针，FAM-TCATTCCAGG CCCTTCTTAT TGCATCTG-BHQ(SEQIDNO:6);其中FAM代表5-羧基荧光素荧光探针，BHQ代表黑洞淬灭剂类型的荧光淬灭剂(B1search Technologies)。从获得祀向载体并整合进该细胞基因组的ES细胞克隆中提纯的DNA与TaqMan?Ge ne Express1n Master Mix探针法基因表达预混液(LifeTechnologies)依照生产商说明在一个384-孔PCR板(MicroAmpTM光学384-孔反应板，Life Technologies)中混合并在一个 Applied B1system Prism7900HT 序列检测系统中循环反应，所述系统在PCR过程中收集荧光数据并设定一个阈值循环(Ct)，其为累积的荧光达到预设阈值时经历的PCR循环数。每个DNA样品都进行上下游IL-6特异性qPCR和两个非靶向的参考基因qPCR检测。将每个IL-6特异性qPCR与每个参考基因qPCR之间Ct值的差值(ACt)进行计算，然后将每个ACt与所有检测样品的中位数ACt之间的差值进行计算得到每个样品的△ ACt值。每个样品的IL-6基因拷贝数通过以下公式计算:拷贝数=2.丢失了一个天然拷贝的正确靶向的克隆的IL-6基因拷贝数将等于I。在人源化等位基因上人源IL-6基因序列对敲除的小鼠IL-6基因序列取代的确定是通过TaqMan?qPCR检测实验完成的，所述检测实验包含以下引物探针(5’到3’书写顺序):人正向引物，CCCCACTCCACTGGAATTTG(SEQ ID NO:7);人反向引物，GTTCAACCACAGCCAGGAAAG(SEQID NO:8);人源探针，FAM-AGCTACAACTCATTGGCATCCTGGCAA-BHQ(SEQ ID NO:9)。
[0124]同样的LONA检测实验还用于检测来自靶向的ES细胞生成的小鼠的鼠尾活组织提纯的DNA以确定其IL-6基因型并确认人源化IL-6等位基因已被传递进所述品系中。将两个带有杂合取代基因的幼鼠交配以获得由人源IL-6基因取代内源性小鼠IL-6基因的纯合小鼠。带有纯合取代基因的幼鼠被用来进行表型检测。
[0125]所述鼠类基因座的上游接头和含有hIL-6基因的序列被设计在以下序列之内:5’ -AATTAGAGAG TTGACTCCTA ATAAATATGA GACTGGGGAT GTCTGTAGCT CATTCTGCTC TGGAGCCCACCAAGAACGAT AGTCAATTCC AGAAACCGCT ATGAACTCCT TCTCCACAAG TAAGTGCAGG AAATCCTTAGCCCTGGAACT GCCAGCGGCG GTCGAGCCCT GTGTGAGGGA GGGGTGTGTG GCCCAGG (SEQ ID NO:10)，其中在所述人源基因第一个核苷酸之前的最后一个小鼠核苷酸是CCGCT中的”T”，人源序列第一个核苷酸是ATGAA中的第一个”A”。含有hIL-6基因和鼠类基因座序列的下游接头被设计在以下序列之内:5’ -TTTTAAAGAA ATATTTATAT TGTATTTATA TAATGTATAA ATGGTTTTTATACCAATAAA TGGCATTTTA AAAAATTCAG CAACTTTGAG TGTGTCACGC TCCCGGGCTC GATAACTATAACGGTCCTAA GGTAGCGACT CGAGATAACT T-3’ ( SEQ ID NO: 11)，其中所述人源序列最后一个核苷酸是TCACG中的”G”，小鼠序列的第一个核苷酸是CTCCC中的第一个”C” ;下游接头在3’末端还含有1xP位点(已显示所述3’末端起始序列)以用来敲除被所述1xP位点包围的泛素启动子驱动的新霉素磷酸转移酶(neo)标记盒。新霉素磷酸转移酶(neo)标记盒与小鼠IL-6基因座接头被设计在以下序列之内:5’ -TATACGAAGT TATCCTAGGT TGGAGCTCCTAAGTTACATC CAAACATCCT CCCCCAAATC AATAATTAAG CACTTTTTAT GACATGTAAA GTTAAATAAGAAGTGAAAGC TGCAGATGGT GAGTGAGA (SEQ ID NO:12)，AGCTC 中的最后一个” C” 是新霉素磷酸转移酶(neo)标记盒的最后一个核苷酸；在所述标记盒之后的小鼠基因组第一个核苷酸是CTAAG中的起始” C”。
[0126]实施例2:未经免疫和经免疫的hIL-6小鼠的免疫分型检测:B细胞
[0127]针对hIL-6基因取代为纯合的小鼠进行B细胞(DC445R(B220))分析。将来自未经免疫和经免疫(TNP-KLH)的hIL-6小鼠脾细胞制备液中的淋巴细胞门控组分染色并通过流式细胞检测免疫分型。流式细胞分析表明通过CD45R(B220)-FITC染色检测的脾细胞制备液中的B细胞百分比与在未经免疫的野生型、hIL-6杂合和hIL-6纯合小鼠制备液中大致相同(细胞数量的63%)。对于经免疫的小鼠，B细胞约达到野生型小鼠脾细胞制备液的细胞总量的65%、以及达到hIL-6纯合子中细胞总量的61%。hIL-6小鼠脾脏(包括未经免疫和经免疫的)含有的B细胞群体数量与野生型小鼠脾脏B细胞群体数量大致相同。
[0128]使用B细胞标记物(CD45R (B220) -APC、CD24 (HSA) -PE或CD43共轭结合到染料和/或IgM(IgM-FITC)上)对野生型、hIL-6杂合和hIL_6纯合小鼠的骨髓染色。正常小鼠骨髓中B细胞的发育随着细胞发育进程会反映在表面标记物上，细胞发育进程从干细胞到早期祖B细胞到晚期祖B细胞，从大的B前体细胞到小的B前体细胞到未成熟B细胞直到最后的成熟B细胞。共同淋巴细胞祖原B细胞会表达CD45R，在后期阶段的未成熟和之后成熟B细胞阶段会表达IgM。因此，⑶45R染色和抗IgM染色的B细胞应所述反映出B细胞发育特征性的模式。hIL-6杂合子和hIL-6纯合子的骨髓的⑶45R(B220)-APC和抗IgM-FITC染色的模式与野生型小鼠骨髓的基本无法区分，显示出了对CD45R(B220)和IgM染色，或对单独的⑶45R(B220)染色呈阳性的B细胞群体。流式细胞染色显示的hIL_6小鼠骨髓中B细胞亚群与野生型小鼠中的类似(表1 ;也见图13)。
[0129]
【权利要求】
1.一种基因修饰的小鼠，所述小鼠包含在内源性小鼠IL-6基因座用编码人源IL-6的人源基因取代编码IL-6的小鼠基因，其中所述编码人源IL-6的人源基因受内源性小鼠IL-6基因座的内源性小鼠调控元件的调控。
2.根据权利要求1所述的基因修饰的小鼠，其中所述编码人源IL-6的人源基因是BACID CTD-2369M23中的人源IL-6基因。
3.根据权利要求1所述的基因修饰的小鼠，其中所述小鼠表达小鼠IL-6Ra。
4.根据权利要求1所述的基因修饰的小鼠，其中所述小鼠表达人源化IL-6Ra。
5.根据权利要求1所述的基因修饰的小鼠，其中所述小鼠表达人源化IL-6Ra。
6.根据权利要求1所述的基因修饰的小鼠，其中所述小鼠不具有选自以下组的特征之一:浆细胞增生、肾小球硬化症、肾小球肾炎、肾衰竭、高丙种球蛋白血症、脾巨核细胞升高、骨髓巨核细胞升高、脾肿大、淋巴结肿大、致密异常性浆细胞以及这些特征的组合。
7.根据权利要求4所述的基因修饰的小鼠，其中所述人源化的IL-6Ra包含人源胞外域。
8.根据权利要求7所述的基因修饰的小鼠，其中所述人源化的IL-6Ra包含小鼠跨膜域和小鼠胞质域。
9.一种基因修 饰的小鼠，所述小鼠包含内源性小鼠IL-6Ra基因的人源化，其中所述人源化包含在内源性小鼠IL-6Rci基因座用人源IL-6Rci胞外域编码序列取代小鼠IL-6R α胞外域编码序列。
10.根据权利要求9所述的基因修饰的小鼠，其中用编码人源IL-6Ra胞外域的人源IL-6Ra序列的连续基因组片段取代包含小鼠外显子I到8的连续小鼠序列。
11.根据权利要求10所述的基因修饰的小鼠，其中所述编码胞外域的人源IL-6Ra序列的连续基因组片段来自BAC CTD-2192J23。
12.根据权利要求9所述的基因修饰的小鼠，进一步包含人源化的IL-6基因。
13.根据权利要求12所述的基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包含在内源性小鼠IL-6基因座用人源IL-6基因取代小鼠IL-6基因。
14.根据权利要求12所述的基因修饰的小鼠，其中所述人源化的IL-6基因受内源性小鼠调控元件的调控。
15.一种建立人源化小鼠的方法，所述方法包含用编码人源IL-6的人源基因取代编码小鼠IL-6的小鼠基因序列。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述取代发生在内源性小鼠IL-6基因座，并且编码人源IL-6的人源基因与内源性小鼠调控序列可操作的连接。
17.一种建立人源化小鼠的方法，所述方法包含用编码人源IL-6Ra胞外域序列的人源基因组片段取代编码小鼠IL-6Ra胞外域序列的小鼠外显子，以形成人源化的IL-6Ra基因。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述取代发生在内源性小鼠IL-6Ra基因座，且人源化的IL-6Ra基因与内源性小鼠调控序列可操作的连接。
19.一种包含人源化IL-6Ra基因的基因修饰的小鼠，其特征在于所述小鼠包含用人源胞外域编码序列取代小鼠胞外域编码序列，其中所述人源化的IL-6Ra基因包含小鼠跨膜序列和小鼠胞质序列；其中所述小鼠进一步包含编码人源IL-6的基因，其中所述编码人源IL-6的基因受内源性小鼠IL-6调控元件的调控。
20.根据权利要求19所述的基因修饰的小鼠，其中所述小鼠无法表达完整的小鼠IL-6Ra，且无法表 达小鼠IL-6。
【文档编号】C07K14/715GK104039821SQ201280065013
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年10月29日 优先权日:2011年10月28日
【发明者】L·王, A·T·多雷二世, S·史蒂文斯, A·J·莫菲 申请人:瑞泽恩制药公司