制备鸟苷酸环化酶c激动剂的方法
【专利摘要】本发明提供了制备包含选自本文所述的SEQ?ID?NOs:1-249的GCC激动剂序列的肽的方法。
【专利说明】制备鸟苷酸环化酶C激动剂的方法
[0001]相关申请
本申请要求2011年3月I日提交的美国临时申请号61/447,891(其内容整体通过引用并入)的权益和优先权。
发明领域
[0002]本发明涉及制备可用于治疗和预防各种疾病和病症的鸟苷酸环化酶C肽激动剂的方法。
[0003]发明背景
鸟苷酸环化酶C是鸟苷酸环化酶的跨膜形式，其表达在各种细胞包括胃肠道上皮细胞上(综述于 Vaandrager 2002 Cell.Biochem.230:73-83)。其最初作为由肠道细菌分泌且引起腹泻的热稳定毒素(ST)肽的肠道受体而被发现。ST肽与从肠粘膜和尿液中分离的两种肽鸟苷肽和尿鸟苷素(uroguanylin)共有相似的氨基酸一级结构
【权利要求】
1.制备包含GCC激动剂序列的肽的方法，所述GCC激动剂序列选自SEQID NOs: 1-249,其中所述GCC激动剂序列是个氨基酸单元长度，N-末端单元在位置I且C-末端单元在位置/?，所述方法包括: 提供第一片段，所述第一片段具有所述GCC激动剂序列的从位置J到位置A的氨基酸单元的第一序列，其中J是I和/7-1之间的整数泌是2和/7之间的整数且大于^且所述第一片段除了位置J的氨基酸单元的氨基或者位置A的氨基酸单元的羧基之外受保护， 提供第二片段，所述第二片段具有所述GCC激动剂序列的从位置A到位置J-1的氨基酸单元的第二序列或具有所述GCC激动剂序列的从位置A+1到位置《的氨基酸单元的第三序列，其中A是I和/7-2之间的整数且小于^ ?是左+2和之间的整数，且所述第二片段除了位置J'-l的氨基酸单元的羧基或者位置A+1的氨基酸单元的氨基之外受保护，和 经由溶液相合成将所述第一片段和所述第二片段偶联以得到具有所述GCC激动剂序列的从位置A到位置A的氨基酸单元序列的受保护的肽，或具有所述GCC激动剂序列的从位置J'到位置》的氨基酸单元序列的受保护的肽。
2.权利要求1的方法，其中所述GCC激动剂序列选自SEQID NOs: 1、8、9、55、56、58、和59。
3.权利要求1的方法，其中所述GCC激动剂序列选自SEQID NOs:1和9。
4.权利要求3的方法，其中经由固相肽合成提供所述第一片段和第二片段中的至少一个。
5.权利要求4的方法，其中所述固相肽合成是Fmoc固相合成。
6.权利要求5的方法，其中所述Fmoc固相合成在2-氯三苯甲基树脂上进行。
7.权利要求3的方法，其中A是l，j.是7，且々是16。
8.权利要求3的方法，其中A是7，j.是15，且々是16。
9.权利要求8的方法，进一步包括将具有所述GCC激动剂序列的从位置7到位置16的氨基酸单元序列的受保护的肽的位置7的氨基酸单元的氨基脱保护，以得到位置-7反应性肽。
10.权利要求9的方法，进一步包括提供具有所述GCC激动剂序列的从位置I到位置6的氨基酸单元序列的第三片段，其中所述第三片段除了位置6的氨基酸的羧基之外受保护。
11.权利要求10的方法，其中经由固相肽合成提供所述第三片段。
12.权利要求11的方法，其中所述固相肽合成是Fmoc固相合成。
13.权利要求10的方法，进一步包括经由溶液相合成将所述第三片段和所述位置-7反应性肽偶联，以得到具有所述GCC激动剂序列的从位置I到位置16的氨基酸单元序列的受保护的线性肽。
14.权利要求13的方法，进一步包括将受保护的线性肽脱保护，以得到脱保护的线性肽。
15.权利要求14的方法，进一步包括氧化所述脱保护的线性肽，以得到包含选自SEQID NOsil和9的GCC激动剂序列的肽。
16.权利要求1的方法，其中经由固相肽合成提供所述第一片段和第二片段中的至少一个。
17.权利要求16的方法，其中所述固相肽合成是Fmoc固相合成。
18.权利要求1的方法，其中所述第一片段和第二片段中的至少一个不超过10个氨基酸单元长度。
19.权利要求18的方法，其中所述第二片段具有所述GCC激动剂序列的位置A到位置J-1的氨基酸单元的第二序列，且所述第二片段的位置J'-l的氨基酸单元和所述第一片段的位置A的氨基酸单元中的任一个或两个选自甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸和精氨酸。
20.权利要求18的方法，其中所述第二片段具有所述GCC激动剂序列的位置A到位置J-1的氨基酸单元的第二序列，且所述第二片段的位置J'-l的氨基酸单元和所述第一片段的位置A的氨基酸单元中的任一个或两个选自甘氨酸和脯氨酸。
21.权利要求18的方法，其中所述第二片段具有所述GCC激动剂序列的位置A+1到位置?的氨基酸单元的第三序列，且所述第二片段的位置?的氨基酸单元和所述第一片段的位置k的氨基酸单元中的任一个或两个选自甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸和精氨酸。
22.权利要求18的方法，其中所述第二片段具有所述GCC激动剂序列的位置A+1到位置?的氨基酸单元的第三序列，且所述第二片段的位置?的氨基酸单元和所述第一片段的位置A的氨基酸单元中的任一个或两个选自甘氨酸和脯氨酸。
23.权利要求1的方法，其中A是/?，所述第二片段具有所述GCC激动剂序列的位置力到位置J'-l的氨基酸单元的第二序列，且位置J'-l的氨基酸单元选自甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸和精氨酸。
24.权利要求23的方法，进一步包括将具有所述GCC激动剂序列的从位置A到位置左的氨基酸单元序列的受保护的肽的位置A的氨基酸单元的氨基脱保护，以得到位置-A反应性肽。`
25.权利要求24的方法，进一步包括提供具有所述GCC激动剂序列的从位置I到位置h~\的氨基酸单元序列的第四片段，其中所述第四片段除了位置A-1的氨基酸单元的羧基之外受保护。
26.权利要求25的方法，其中经由固相肽合成提供所述第四片段。
27.权利要求26的方法，其中所述固相肽合成是Fmoc固相合成。
28.权利要求25的方法，其中所述第四片段不超过10个氨基酸单元长度。
29.权利要求25的方法，进一步包括经由溶液相合成将所述第四片段和所述位置-A反应性肽偶联，以得到具有所述GCC激动剂序列的从位置I到位置的氨基酸单元序列的受保护的线性肽。
30.权利要求29的方法，进一步包括将所述受保护的线性肽脱保护，以得到具有所述GCC激动剂序列的从位置I到位置的氨基酸单元序列的受保护的线性肽。
31.权利要求30的方法，进一步包括氧化所述脱保护的线性肽，以得到包含选自SEQID NOs:1-249的GCC激动剂序列的肽。
32.权利要求31的方法，进一步包括纯化包含选自SEQID NOs:1-249的GCC激动剂序列的肽，其中所述纯化包括将所述肽吸附到聚合吸附柱上，任选地用去离子水冲洗所述肽，用醇水溶液从所述聚合吸附柱将任选冲洗的肽洗脱下来以形成肽溶液，从所述肽溶液去除水和醇以沉淀所述肽，和任选地将醚添加至脱水肽以促进所述肽的沉淀。
33.权利要求32的方法，其中所述醇水溶液包含异丙醇。
34.权利要求32的方法，其中所述醚包含二乙醚。
35.权利要求32的方法，进一步包括在所述纯化之前通过用包含铵盐的水溶液洗涤所述肽而将所述肽进行盐交换。
36.权利要求35的方法，进一步包括在所述盐交换步骤之后所述纯化之前冻干所述肽。
37.纯化包含选自SEQID NOs:1-249的所述GCC激动剂序列的肽的方法，所述方法包括将所述肽吸附到聚合吸附柱上，将所述肽脱盐，用醇水溶液从所述聚合吸附柱将所述脱盐的肽洗脱下来以形成肽溶液，从所述肽溶液去除水，和将醚添加至脱水肽以沉淀所述肽。
38.权利要求37的方法，其中所述醇水溶液包含异丙醇。
39.权利要求37的方法，其中所述醚包含二乙醚。
40.权利要求37的方法，进一步包括在所述纯化之前通过用包含铵盐的水溶液洗涤所述肽而将所述肽进行盐交换。
41.权利要求40的方法，进一步包括在所述盐交换步骤之后所述纯化之前冻干所述肽。
42.纯化的肽，其包含选自SEQID NOs: 1-249的GCC激动剂序列，其中所述肽具有不小于0.1 g/mL、不小于0.2 g/mL、不小于0.3 g/mL、不小于0.4 g/mL、或不小于0.5 g/mL的堆积密度。
43.纯化的肽，其中所述肽通过权利要求37-41中任一项的方法进行纯化。
44.权利要求42的纯化的肽，其中所述肽通过权利要求37-41中任一项的方法进行纯化。
45.权利要求42-44中任一项的纯化的肽，其中所述肽具有不小于0.1 g/mL、不小于0.2 g/mL、不小于0.3 g/mL、不小于0.4 g/mL、不小于0.5 g/mL、或不小于0.6 g/mL的振实山/又ο
46.权利要求42-45中任一项的纯化的肽，其中所述肽具有不小于95%、不小于97%、或不小于98%的层析纯度。
47.权利要求42-46中任一项的纯化的肽，其中所述肽基本上不含水。
48.权利要求42-47中任一项的纯化的肽，其中所述肽基本上不含选自乙腈、乙酰胺、醇类、铵、和TFA的杂质。
49.权利要求42-48中任一项的纯化的肽，其中所述肽基本上不含拓扑异构体。
50.权利要求42-49中任一项的纯化的肽，其中所述肽包含SEQID NO:1的GCC激动剂序列。
51.权利要求42-49中任一项的纯化的肽，其中所述肽包含SEQID N0:9的GCC激动剂序列。
【文档编号】C07K14/47GK103764672SQ201280021221
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年3月1日 优先权日:2011年3月1日
【发明者】J.拜, R.张, J.贾, J.周, Q.赵, G.张, K.沙伊鲁布海, S.科米斯凯, R.冯 申请人:辛纳吉制药公司