专利名称：人可溶性鸟苷酸环化酶的高效制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程和蛋白表达领域，涉及一种用生物工程高效制备人的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的方法。
背景技术：
生命体中内源性化学小分子N0、C0、H2S、H202等作为细胞信号转导分子在心血管系统和神经系统中有非常重要的生理功能。基于这些化学小分子的信号转导分子机制及其与疾病诊断治疗和创新药物开发研究是近几年来化学生物学和生物医学领域研究的一个前沿热点。可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)作为信使分子NO的受体，是由a和|3两个亚基组成的含有血红素的异源二聚体。当NO与sGC的heme结合后可以激活sGC催化GTP转化为二级信使分子cGMP，进而介导一系列的生物级联反应。 对于NO如何激活sGC提出了较多的模型，但是其确切机理仍然不清楚，原因主要是由于不能得到足量的高纯度的sGC蛋白，另一方面sGC全蛋白比较大(a约80kDa和P约70kDa)，从而阻止了人们对于其结构_功能_性质_反应的深入研究。
目前sGC蛋白的获得途径主要有两种一是从组织当中提取，但是这种方法提取得到的量很少( 2mg/kg牛肺)，对于人的sGC蛋白来说更是由于组织来源的限制而变得几乎不可能。第二种途径是从真核细胞中表达这种方法蛋白产率低( 130ii g/25ml细胞提取液)，成本相当高。虽然有细菌体的sGC血红素结构域在大肠杆菌中表达的报道，但是它们与真核生物的血红素结构域同源性很低。对于真核生物的sGC蛋白，只有Marietta等人在大肠杆菌中表达了小鼠的13 1亚基的血红素结构域和催化结构域，但是他们所得到的可溶性蛋白的产量相当低。到目前为止还没有人的sGC蛋白在大肠杆菌中表达的报道。
发明内容
本发明的目的是建立一种操作简单，成本低，产率高，纯度高的人的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的制备方法。 本发明提供了一种人可溶性鸟苷酸环化酶的高效制备方法，该方法包括以下步骤 (1)将人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸编码序列装入表达载体，并转化表达用大肠杆菌菌株； (2)将(1)所得菌株接种于改进后的TB培养液，IPTG诱导表达过夜； (3)将(2)所得菌体破菌，离心，过Ni-NTA柱，tev酶酶切，过Ni-NTA柱，heme重
组即可。本发明的方法中，(1)中所述表达载体可以是pMAL-c2x、pET28b或者pET22b。
本发明的方法中，所述表达载体可以为MBraT-mCherry2质粒。
本发明的方法中，(1)中所述大肠杆菌菌株可以是BL21 (DE3)pLysS、Rosetta(DE3)pLysS或者Rosetta(DE3)。
本发明的方法中，(3)中破菌方法可以是超声、反复冻融或者溶菌酶酶解。
本发明的方法中，"人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸编码序列"是指编码具有人可溶性鸟苷酸环化酶的核苷酸序列(GENBANK登陆号NM_000857)，如序列中开放阅读框位置核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于NM_000857序列的编码框开放阅读框位置核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与NM_000857序列的编码框开放阅读框位置核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出NM_000857所述的序列。 在本发明中，术语"人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸编码序列"指具有人可溶性鸟苷酸环化酶活性的如上述序列对应的多肽。该术语还包括具有与上述蛋白具有相同功能的变异形式。这些变异形式包括若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人可溶性鸟苷酸环化酶的活性片段和活性衍生物。 该多肽的变异形式还包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸的融合蛋白、以及利用抗人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸血清获得的多肽或蛋白。 本发明的方法中采用的表达载体和菌株可以采用该领域常用的表达载体和宿主菌，例如MBPHT-mCherry2载体和大肠杆菌Rosetta (DE3) pLysS， pMAL-c2x和BL21 (DE3)pLysS， pET28b禾口 Rosetta(DE3)pLysS， pET22b禾口 Rosetta(DE3)。 把人可溶性鸟苷酸环化酶编码序列装入载体并转化菌株可以采用常规的方法。例如，先将人可溶性鸟苷酸环化酶编码序列装入pBluescriptR等载体中扩增，然后再构建表达载体；再如，在人可溶性鸟苷酸环化酶编码序列5 '和3'加入载体上已有的酶切位点，从而将编码序列插入载体的多克隆位点处。转化采用热激转化。 改进后的TB培养基包括5-10g/L蛋白胨，5-10g/L酵母提取物，2_10ml/L甘油，O. 01-0. 02mol/L KH2P04，0. 1-0. 2mol/L K2HP04， l_2g/L MgS04， l_4g/LNaN03， 10_30mMGlucose (葡萄糖)。 IPTG诱导可以采用市售的IPTG和常规的诱导条件。诱导过夜是指诱导时间在10-16小时。 本发明的方法中，步骤(3)主要是分离纯化蛋白。可以采用常规方法分离纯化，本发明还采用效果较好的Ni-NTA柱等技术分离纯化。由于表达的融合蛋白是带有麦芽糖融合蛋白(MBP)标签和组氨酸(His)标签的，本发明用Ni-NTA柱来纯化，Ni-NTA柱是组氨酸(His)标签的亲和柱，其亲和性和特异性都比较高，所以纯化效果比较好。而Amylose(淀粉多糖)柱是麦芽糖融合蛋白(MBP)标签的亲和柱，可以用它来纯化蛋白，但是它的亲和力相对比较差，柱效比较低。本发明所用的tev酶是特异识别ENLYFQG肽段的一种酶，在构建质粒时我们把这个七肽序列加在了MBP和目的蛋白序列之间，所以可以用tev酶来酶切。可以用Factor-Xa来切割，但是比较贵。 本发明中，使用了 heme重组。这是因为sGC是一种血红素蛋白，血红素蛋白是指由
4血红素(heme)辅基和脱辅基蛋白(即o-protein)组成的一大类蛋白。 一般血红素辅基是其活性中心。sGC在人体内是以heme结合的形式存在的，但是由于我们是将质粒在大肠杆菌中表达，所以经常会出现只表达脱辅基蛋白，而heme不能在大肠杆菌中重组上去，另外，在蛋白纯化过程中也容易出现heme从蛋白的血红素腔中脱离出来，变成脱辅基蛋白。所以需要在得到纯的即o-protein后再将heme重组至血红素腔内。 本发明的一个实施例中，采用下述方法具体制备了人sGC。首先，将人sGC-P 1基因(可以从复能基因公司购得，可从genbank搜索到)。克隆至MBraT-mCherry2载体，并抽提得到含有目的基因的表达质粒。然后，将质粒转化到表达用基因工程菌，接种于改进的TB (含50 g/mL氨苄青霉素)培养液，37"培养至0D6。。 0. 6后加IPTG并降温至20°C诱导表达 12h后收菌。上述菌体超声破菌离心，过Ni-NTA柱，tev酶酶切，过Ni-NTA柱，heme重组即可得到90%以上纯度的目的蛋白。 本发明的表达载体是MBraT-mCherry2质粒；表达用基因工程菌是大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS。 本发明用的培养液为改进后的TB培养液，具体为在TB培养液中加入1. 25g/LMgS04，2g/L NaN03，20mM Glucose。本改进可以大幅度提高蛋白产量。 本发明首次从大肠杆菌中表达了人的13 l亚基的sGC蛋白，并且蛋白可溶性很好。取破菌后的上清和沉淀样品，用SDS-PAGE凝胶电泳检测，其结果显示目的蛋白基本都在上清中。利用本发明得到的人sGC蛋白产量高达20mg/L以上，纯度达90%以上的人可溶性鸟苷酸环化酶蛋白，是目前产量最高的低成本表达方法。本发明在生物医药领域具有重大应用价值。
具体实施例方式
首先，我们从广州复能基因公司买来人sGC-P 1基因，然后通过基因工程手段将其成功克隆至MBraT-mCherry2载体内。基因测序结果表明我们成功构建了 human sGC-P 1表达质粒。 以Rosetta(DE3)pLysS为宿主菌转化，挑斑于LB培养基培养过夜，然后按照
1 : 100比例将菌液转接至250ml modified TB培养基(TB中加入1. 25g/LMgS04， 2g/L
NaN03，20mM Glucose) ， 37 °C ， 250rpm培养至0D6。。 0. 6，然后加IPTG(终浓度O. ImM)，同
时温度降至20。C表达 12h后收菌。将菌体按5ml/g湿菌重悬于buffer A(50mM Na-Pi，
500mM NaCl，5mM P -巯基乙醇，20X甘油，PH8. 0)，加入少量的溶菌酶、DNase和PMSF(终浓
度lmM)，4。C搅拌均匀后超声破菌，然后14， 000rpm，4。C离心15min，取出上清过Ni-NTA柱，
用buffer B(bufferA中加入10mM咪唑)洗涤，然后用buffer C (buffer A中加入200mM
咪唑)洗脱，收集洗脱液，蛋白洗脱液透析除去咪唑后加tev酶及终浓度5mM的DTT，于室温
酶切过夜。酶切产物超滤浓縮后过G-25柱除去DTT，然后再过一次Ni-NTA柱，收集蛋白流
出液，这样就可以得到90%以上纯度的human sGC-P 1脱辅基蛋白。 然后通过heme重组，成功得到了高纯度，高产率的含有heme的全蛋白。 本发明中使用的试剂和生物材料来源如下 MBraT-mCherry2载体由复旦大学生命科学学院丁滪博士赠予 human sGC-P 1基因购自广州复能基因公司
宿主菌Rosetta (DE3) pLysS购自Novagen公司
Hemin :购自sigma公司 Ni-NTA树脂，质粒抽提试剂盒和凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司溶菌酶(lysozyme) ，DNaseI，氨节西林(Ampicillin)，苯甲基磺酰氟(PMSF)，异丙
基-13 -D硫代半乳糖苷(IPTG) ， |3 -巯基乙醇，DTT购自上海生工公司(Sangon， Shanghai,
China) Pfu DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，dNTPs与限制性内切酶BamHI， EcoRI， HindIII， Xhol购自New England Biolabs公司； S印hadex G—25葡聚糖凑走月交柱购自Pharmacia Biotech公司(Uppsala, Sweden)。
蛋白胨，酵母提取物购自0X0ID公司。
权利要求
人可溶性鸟苷酸环化酶的高效制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤(1)将人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸编码序列装入表达载体，并转化表达用大肠杆菌菌株；(2)将(1)所得菌株接种于改进后的TB培养液，IPTG诱导表达过夜；(3)将(2)所得菌体破菌，离心，过Ni-NTA柱，tev酶酶切，过Ni-NTA柱，heme重组即可。
2. 根据权利要求l所述的制备方法，其特征是，(1)中所述表达载体是pMAL-c2x、 pET28b或者pET22b。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述表达载体为MBraT-mCherry2质粒。
4. 根据权利要求l所述的制备方法，其特征是，(l)中所述大肠杆菌菌株是BL21(DE3) pLysS、 Rosetta (DE3) pLysS或者Rosetta (DE3)。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，(2)中改进后的TB培养液含有5-10g/ L蛋白胨，5-10g/L酵母提取物，2-10ml/L甘油，O. 01-0. 02mol/L KH2P04，0. 1-0. 2mol/L K2HP04， l-2g/L MgS04， l-4g/LNaN03， 10_30mM葡萄糖。
6. 根据权利要求l所述的制备方法，其特征是，(3)中破菌方法是超声、反复冻融或者 溶菌酶酶解。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种人可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的高效制备方法。本发明方法通过如下步骤(1)将人可溶性鸟苷酸环化酶核苷酸编码序列装入表达载体，并转化表达用大肠杆菌菌株；(2)将(1)所得菌株接种于改进后的TB培养液，IPTG诱导表达过夜；(3)将(2)所得菌体破菌，离心，过Ni-NTA柱，tev酶酶切，过Ni-NTA柱，heme重组。制得纯度达90％以上的人可溶性鸟苷酸环化酶蛋白，产量达20mg/L以上，本方法能克服目前人可溶性鸟苷酸环化酶产量较低，成本较高，不能满足对sGC的应用需求的缺陷，是目前产量最高的低成本表达方法。
文档编号C12N15/70GK101736022SQ20081020292
公开日2010年6月16日 申请日期2008年11月18日 优先权日2008年11月18日
发明者王红艳, 谭相石, 钟方芳, 黄仲贤 申请人:复旦大学