一种环氧化物水解酶突变体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种热稳定性提高的环氧化物水解酶突变 体及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 环氧化物水解酶（epoxide hydrolase，Ε?，EC 3. 3. 2. 10)是催化水解环氧化物或 其盐生成相应邻二醇或其盐的一类酶的总称，催化反应无需任何辅酶、辅基或金属离子的 参与。环氧化物水解酶广泛分布于哺乳动物、植物和微生物中。近年来，由于具有立体专一 性好、酶促反应快、产物光学纯度和得率高，以及分离纯化产物较简单等优点，微生物来源 的环氧化物水解酶受到了广泛关注和具体应用。1977年Miura等人首次成功将环氧化物水 解酶应用于L(+)_酒石酸的工业化生产（US Patent4010072)。
[0003] L (+)-酒石酸，又名（2R，3R)-2, 3-二羟基-1，4- 丁二酸，是一种天然存在的有机 酸，在食品行业中可以用作酸味剂，酒石酸单（双）酐酯是重要的食品添加剂；在医药行业 中，它是最常用的手性药物和中间体的拆分剂；在印染业中作为防染剂、固色剂等；还可以 作为金属离子隐蔽剂，用于电镀、制革和制镜等行业。
[0004] 过去，生产L(+)_酒石酸的主要方法是提取并加工葡萄酒的副产物酒石，也可以 以葡萄糖为主要原料通过发酵、转化和提取制备。目前，以顺丁烯二酐为原料，利用含有环 氧化物水解酶的微生物转化是主要的生产方式。催化原理如下：先将顺丁烯二酐和过氧化 氢反应制得顺式环氧琥珀酸，再利用微生物环氧化物水解酶将顺式环氧琥珀酸或其盐水解 为L(+)_酒石酸或盐。
[0005] 目前报道过的能生产用于L(+)_酒石酸制备的环氧化物水解酶的微生物有根瘤 菌属、假单胞菌属、诺卡氏菌属、棒状杆菌属、红球菌属、无色杆菌属、醋酸杆菌属、土壤杆菌 属、产碱杆菌属和不动杆菌属。工业生产中常用的是具有较高催化效率的红球菌属。2007 年Liu等首次报道了红球菌Rhodococcus opacus ML-0004环氧化物水解酶基因，并将其在 原核细胞（E.coli)进行了表达。（Appl Microbiol Biotechnol 2007;74:99-106)然而该 酶热稳定性极差，对温度特别敏感，在45°C下保存30min则会失去60%活力，在50°C保存 30min后完全失活。弱热稳定性限制了生物催化剂的使用寿命，限制了其催化效率，也增加 了工业生产中的成本。因此，提高此酶的热稳定性是目前利用生物催化法生产L(+)-酒石 酸最重要的问题之一。
[0006] 目前，通过基因工程手段改造蛋白质一级结构，增强蛋白质三维结构刚性来提高 蛋白质热稳定性的手段已经成为主流。按照对蛋白质结构和功能关系的了解程度，蛋白质 改造手段主要分为"定向进化"，"理性设计"和"半理性设计"。从上世纪80年代开始，"定 向进化"已经成功地被应用到了蛋白质"体外改造"上。由于"定向进化"不需要了解特定 蛋白质的结构和其相应的功能，建立起合理的进化筛选机制之后就可以模拟自然进化对目 的蛋白质进行改造和筛选，因此大量结构刚性低而且结构信息少的蛋白质由此得到了改造 (FEBS Lett. 276(2009) 1750 - 1761)。虽然效果显著，"定向进化"还是有着改造方向盲目、 工作量大和筛选机制难以建立的缺点。
[0007] 为了使改造更加具有目的性并减少工作量，研究人员提出了"理性设计"的概念。 "理性设计"是指在已知目标蛋白质结构信息和其功能作用机理的前提下，应用计算机模拟 运算预测对蛋白质进行改造后可以产生的在结构和功能方面的影响，并通过定点突变的方 式将预测结果带到试验中（Appl. Microbiol. Biotechnol. 99(2014) 1205 - 1216)。"理性设 计"的特点是利用可信度高的由X-ray衍射蛋白质结晶体所得到的蛋白质晶体结构，准确地 预测蛋白质替代。尽管在预测蛋白质改造方面"理性设计"确实展现了高效和工作量小的 特点。但前期准备蛋白质晶体和解析蛋白质三维结构的过程往往非常复杂艰辛，而且成功 率得不到保障。没有现成蛋白质晶体结构的情况下利用"理性设计"改造蛋白质的研究很 容易演变成了对目标蛋白的结构研究，偏离了主要研究方向。
[0008] 因此研究人员又提出了一个将"定向进化"和"理性设计"两者相结合的概念"半 理性设计"。此概念涉及一系列的蛋白质工程手段，在允许较大量预测误差的情况下一方面 规定"定向进化"突变方向以减小筛选规模，另一方面规避"理性设计"中的蛋白质结构解 析过程，大大提高蛋白质工程改造的效率。"半理性设计"主要包括多重序列对比（MSAs)， 同源建模，虚拟突变和定点饱和突变（Curr. Opin. Biotechnol. 21 (2010) 734 - 743.)。
[0009] 目前，来源于红球菌Rhodococcus opacus ML-0004的环氧化物水解酶的蛋白质结 构信息和其功能作用机理尚不清晰。为了得到具有较强热稳定性的环氧化物水解酶突变 体，同时尽可能提高工作效率，本发明采用"定向进化"与"半理性设计"相结合的方法对其 进行一级结构改造。
【发明内容】
[0010] 针对环氧化物水解酶的热稳定性不高的技术问题，本发明提供了一种环氧化物水 解酶突变体及其制备方法。
[0011] -种环氧化物水解酶突变体，所述环氧化物水解酶突变体是将如SEQ ID NO. 1所 示氨基酸序列的第8位、第26位、第83位、第90位和第122位的氨基酸进行单点突变或多 点突变获得。
[0012] 进一步地，所述环氧化物水解酶突变体为下列之一：
[0013] (1)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸（D8K);
[0014] (2)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸 (酸 F26V/F26W);
[0015] (3)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第83位的异亮氨酸替换为精氨酸（I83R);
[0016] (4)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第90位的丝氨酸替换为精氨酸（S90R) ; (5) 如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的122位的谷氨酰胺替换为精氨酸（Q122R);
[0017] (6)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第 26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸（D8K&F26V/D8K&F26W);
[0018] (7)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第 83位的异亮氨酸替换为精氨酸（D8K&I83R);
[0019] (8)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第 90位的丝氨酸替换为精氨酸（D8K&S90R);
[0020] (9)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第 122位的谷氨酰胺替换为精氨酸（D8K&Q122R) ; (10)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第26 位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸（F26V&I83R/ F26W&I83R)；
[0021] (11)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨 酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸（F26V&S90R/F26W&S90R);
[0022] (12)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨 酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸（F26V&Q122R/F26W&Q122R);
[0023] (13)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第 90位的丝氨酸替换为精氨酸（I83R&S90R);
[0024] (14)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第 122位的谷氨酰胺替换为精氨酸（I83R&Q122R);
[0025] (15)第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸 (S90R&Q122R)；
[0026] (16)如SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同 时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸 (D8K&F26V&I83R/D8K&F26W&I83R)；
[0027] (17)如SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸， 同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸 (D8K&F26V&S90R/D8K&F26W&S90R)；
[0028] (18)如SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同 时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸 (D8K&F26V&Q122R/D8K&F26W&Q122R)；
[0029] (19)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第 83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸（酸D8K&I83R&S90R);
[0030] (20)如SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨 酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸 (D8K&I83R&Q122R)；
[0031] (21)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第 90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸（D8K&S90R&Q122R);
[0032] (22)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或 色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸 (S90R&F26V&I83R/S90R&F26W&I83R)；
[0033] (23)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或 色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸 (Q122R&F26V&I83R/Q122R&F26W&I83R)；
[0034] (24)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或 色氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸 (S90R&F26V&Q122R/S9