一种高温糖苷水解酶CoGH1A基因及其表达蛋白与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术、生物质利用和食品领域，具体设及一种高溫糖巧水解酶基 因及其表达蛋白与应用。
【背景技术】：
[0002] 糖巧水解酶是水解两个糖分子或糖分子与非糖分子之间糖巧键的一类酶。糖巧水 解酶广泛应用于生物和化学产业，如食品、饮料、饲料、医药、化工、服装和造纸等领域。其 中，纤维素酶由于生物质产业的迫切需求而受到最为广泛的重视。另外，有些糖巧水解酶具 有转糖巧作用，用于合成低聚糖和巧类物质，如一些半乳糖巧酶能利用乳糖合成低聚半乳 糖，有些β-葡萄糖巧酶能利用醇和糖合成烷基糖巧。低聚半乳糖具有保湿性良好、甜度低、 热能低(非消化）、对酸和热稳定等特性，它能促进肠道益生菌(双歧杆菌）的生长，促进脂类 代谢等，有重要保健作用和医用价值，在功能食品领域受到广泛的关注，被广泛应用在保健 品、乳品工业、糖果、饮料等领域。而烷基糖巧是一种重要的化工原料。总体而言，目前糖巧 水解酶存在催化效率低、稳定性不足、应用成本高等问题，限制了相关产业的发展，开发高 效、稳定的糖巧水解酶是生物、化工和食品等产业的迫切需求。极端高溫菌长期生活在高溫 环境，形成独特的酶体系，其分泌的酶有耐热性强、催化效率高、催化机理独特等特点，高溫 糖巧水解酶的开发将加快生物和化工相关产业的发展。本发明提供一种高效多功能高溫糖 巧水解酶基因及表达产物。该酶在75°C下水浴12h其酶活仍保持100%，表现出极强的热稳 定性，该酶同时具有β-葡萄糖巧酶、纤维素外切酶、β-木糖巧酶、β-半乳糖巧酶和低聚半乳 糖合成酶活性，其中β-葡萄糖巧酶和β-半乳糖巧酶活性分别接近和超过文献报道的最高 值。该酶与商业纤维素酶协同水解賴杆，能明显提高葡萄糖和木糖产率;催化低聚半乳糖 (GalOS)合成速率是文献报道的10-15倍，达265.2g L-化-1，具有潜在的工业应用价值。
【发明内容】
[0003] 发明目的：
[0004] 本发明的目的是针对现有糖巧水解酶存在热稳定性差、催化效率低、使用成本高 等问题，提供一种高溫糖巧水解酶CoGHlA基因及其表达蛋白与应用，包含高溫糖巧水解酶 CoGHlA基因、基因的重组载体和重组工程菌、高溫糖巧水解酶CoGHlA氨基酸序列经过一个 或多个氨基酸残基取代、缺失及添加形成的具有糖巧水解酶活性的衍生蛋白质，W及该糖 巧水解酶的蛋白表达和应用。具体包括如下：
[000引 1、一种高溫糖巧水解酶CoGHlA的基因，其基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006] 2、一种高溫糖巧水解酶CoG化A，其氨基酸系列如SEQ ID NO.2所示。
[0007] 3、高溫糖巧水解酶CoGHlA氨基酸序列SEQ ID NO.2中的氨基酸经过一个或多个氨 基酸残基取代、缺失及添加形成的具有糖巧水解酶活性的衍生蛋白质。
[0008] 4、一种用于扩增高溫糖巧水解酶CoGHlA基因的方法，其特征在于所使用的引物 为：
[0009] PX13001 5'-GCCGCGCGGCAGCATGAGTTTTCCAAAAG-3'
[0010] PX13002 5'-GCGGCCGCAAGCGTTTATGAATTTTCCTTTATATAC-3'
[0011] 5、一种高溫糖巧水解酶CoGHlA基因序列的重组载体祀T-28b-CoGHlA及其转化而 得的重组工程菌株，所述菌株为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。
[0012] 6、本发明提供制备上述高溫糖巧水解酶CoGHlA表达和纯化的方法。
[0013] 7、高溫糖巧水解酶CoGHlA在生物质水解中的应用，与商业纤维素酶协同水解，能 同时提高葡萄糖和木糖的得率。
[0014] 8、高溫糖巧水解酶CoGHlA在乳糖水解和低聚半乳糖合成中的应用。它能迅速分解 牛
[0015] 奶中的乳糖，利用乳糖合成低聚半乳糖的合成速率是文献报道的10-15倍。
[0016] 技术方案：
[0017] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0018] (1)高溫糖巧水解酶CoGHlA基因重组载体和重组工程菌的构建
[0019] 提取热解纤维素菌C.owensensis的基因组，设计引物分别PCR扩增高溫糖巧水解 酶CoGHlA的基因，再酶切连接到载体祀上，转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，筛选并通 过测序鉴定阳性重组载体，提取重组载体质粒，转化大肠杆菌化2UDE3)感受态细胞，获得 还有重组载体的重组工程菌。
[0020] (2)上述高溫糖巧水解酶CoGHlA的蛋白纯化和酶学活性测定
[0021] 将获得的重组工程菌转接培养，IPTG诱导酶蛋白表达。通过超声波破碎细胞，高速 离屯、和Ni-NTA sepharose 4B亲和层析分离纯化;然后通过SDS-PAGE电泳和分子筛鉴定蛋 白分子大小和聚合态，发现高溫糖巧水解酶CoGHlAW单体或Ξ聚体的形式存在;最后浓缩， 测定蛋白浓度，分析蛋白的酶学性质。
[0022] (3)上述高溫糖巧水解酶CoGHlA在生物质水解中的应用
[0023] W賴杆等生物质为原料，用不同比例的高溫糖巧水解酶CoGHlA和商业纤维素酶酶 解在50-70°C，pH 5-7的条件下酶解48-7化，测定纤维素和半纤维素的酶解率，说明添加高 溫糖巧水解酶CoGHlA对纤维素和半纤维素酶解的促进作用。
[0024] (4)高溫糖巧水解酶CoGHlA在乳糖水解和低聚半乳糖合成中的应用
[002引 W不同浓度4%-50%(w/w)的乳糖为底物，高溫糖巧水解酶Co細lA在70-80°C，pH 5-7条件下下催化lOmin-化，高效液相色谱仪(P化C)分析乳糖、半乳糖、葡萄糖和低聚半乳 糖浓度变化，测定该酶对乳糖水解和低聚半乳糖合成的效率。
[0026] 有益效果:高溫糖巧水解酶CoGHlA在生物质制备可发酵糖和低聚半乳糖生产等方 面具有潜在的工业应用价值。
【附图说明】
[0027] 图1:高溫糖巧水解酶CoGHlA凝胶层析和凝胶电泳图
[0028] 图2:图2高溫糖巧水解酶CoGHlA最适溫度、pH和热稳定性
【具体实施方式】
[0029] 实施例1:高溫糖巧水解酶CoGHlA重组工程菌株的构建
[0030] 细菌基因组DM的提取：
[0031 ] 在75°C，厌氧环境下培养C.owensensis菌，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养 细菌的基因组DNA，-20°C冻存备用。
[0032] PCR引物设计：
[0033]根据公开的C.owensensis基因组序列信息，预测高溫糖巧水解酶Co細1A基因，设 计克隆所用的PCR引物。用于扩增高溫糖巧水解酶CoGHlA基因的引物如下：
[0034] PX13001 5'-GCCGCGCGGCAGCATGAGTTTTCCAAAAG-3'
[0035] PX13002 5'-GCGGCCGCAAGCGTTTATGAATTTTCCTTTATATAC-3'
[0036] 从基因组DM中PCR扩增基因：
[0037] WC.owensensis基因组DNA为模板，应用设计引物进行PCR扩增高溫糖巧水解酶 CoGHlA基因，琼脂糖凝胶电泳检测确认扩增DNA片段，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回 收PCR产物。
[0038] 高溫木聚糖酶Co Xylosidase A基因的酶切与连接：
[0039] 高溫木聚糖酶Co Xylosidase A基因 DNA片段和质粒pET-28b进行双酶切(Nde 1/ 化0 I)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因 DM及质粒载体。将酶切回收后的基因 DNA 和质粒载体用T4DNA连接酶反应连接。
[0040] 高溫糖巧水解酶CoGHlA基因 DNA的处理与连接：
[0041 ]用高保真DNA聚合酶依据所设计引物扩增质粒祀T-28b。用T4DNA聚合