一种来源于枯草芽孢杆菌的质膜铝抗性基因在培育耐铝拟南芥中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明提供了一种来源于枯草芽抱杆菌的质膜侣抗性基因 BsYJ邸基因转入植物 拟南芥中并使得运种转基因植物耐侣性增加的应用，属于植物转基因领域。所述质膜侣抗 性基因 BsYJKB含753个碱基，编码的氨基酸残基250个;所述基因的核巧酸序列如序列1所 示，其编码的氨基酸序列如序列2所示。本发明中来源于枯草芽抱杆菌的质膜侣抗性基因 BsYJKB采用人工方法合成，转基因植物拟南芥具备较高的耐侣性。
【背景技术】
[0002] 侣(A1)是地壳中最丰富的元素之一，±壤中侣主要W侣娃酸盐矿物和氧化物等形 态存在，但当±壤发生酸化时，±壤中的活性侣增加，导致侣毒的产生。侣毒不仅影响植株 根系发育，限制作物生长，而且对微生物和动物产生毒害作用。±壤酸化会导致±壤中侣含 量上升，从20世纪80年代到现在，我国±壤酸化越来越严重，尤其发生在南方酸性±壤，± 壤酸化面积占我国耕地面积的40% W上。酸雨也会加速±壤固相侣溶解，在酸雨频发的地 区，湖泊和河流发生严重酸化，侣污染加剧，对生态环境造成严重的危害。
[0003] 酸性±壤中的侣毒害一直是困扰农业生产的问题之一，农业上通常靠大量的施用 生石灰等碱性物质缓解上壤酸度解除侣毒害。运种方法只能改良表层上壤，对深层上壤的 酸化却没有实质性的改变，而目成本高，对环境污染严重。因此，在降低±壤酸度的同时，挖 掘植物自身的潜力，获得耐侣能力强的植物品种，对耐侣品种的开发和利用无疑是更有效 的解决±壤侣污染问题的途径。
[0004] 植物基因工程近年发展迅速，应用植物基因工程提高植物对侣毒害的抗性有着巨 大的开发潜力和广阔的应用前景。可W通过改变基因或蛋白表达的模式提高植物耐侣能 力。随着基因组学、蛋白组学和生物信息学的发展，在不同物种中获得了大量侣胁迫响应基 因的序列。葡萄VvALS3基因是一种质膜的侣抗性基因。细菌在环境中侣的压力下也会形成 相应的抗性机制，枯草芽抱杆菌BsYJKB基因是葡萄VvALS3的同源基因，将其应用于拟南芥 W提高其对侣的耐受性的研究还未见报道。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的在于提供了一种来源于枯草芽抱杆菌的质膜侣抗性基因 BsYJKB转 入拟南芥中并使得运种转基因拟南芥耐侣性增加的应用。
[0006] 本发明方法所述的枯草芽抱杆菌的质膜侣抗性基因由753个碱基组成，为序列表 中的序列1，将此基因命名为BsYJKB。
[0007] 用上述序列1和其开放阅读框编码的氨基酸序列转化的拟南芥植株，W及该基因 在培育耐侣拟南芥中的应用方法均是本发明需要保护的内容。
【附图说明】：
[000引图1为本发明WpYG8468质粒构建的DM表达单元的结构示意图。
[0009] 图2为对拟南芥转基因植株进行半定量PCR验证的电泳图(WT为对照，M2、M10和M15 分别为Ξ组拟南芥转基因植株）。
[0010] 图3为A1处理后转基因拟南芥和非转基因拟南芥主根长度和植株生长状态的变化 (其中A为经A1胁迫处理的拟南芥主根长度变化，B为处理后拟南芥为处理后拟南芥植株生 长状态的变化）。
【具体实施方式】：
[0011] W下结合实施例并附图，对本发明的【具体实施方式】作进一步的详述。
[0012]实例IBsYJ邸基因在拟南芥中的遗传转化：
[0013] 1构建双向启动子化MV 35S(D35S)，将细菌中获得的BsYJKB基因与真核表达双元 载体PYG8468相连转入农杆菌GV3101中，DNA表达单元的结构示意图见图1。
[0014] 2用与拟南芥转基因相同的花序浸染法将BsYJKB基因转入拟南芥中：
[0015] a拟南芥的种植:将拟南芥种子于EP管中消毒后接种于1/2MS培养基上，4°C保湿黑 暗条件下春化3-4天，然后置于16h光照/她黑暗光周期、2000-3000Lux、18°C、RH为70%条件 下培养。一周后，选择生长健壮的幼苗移栽到培养±中。每周诱一次1/2PNS培养液。当幼苗 长至3-4cm时，去除花序，在去除顶端花序四天后进行转化。转化前将已经开花授粉的花和 种子去除干净。
[0016] b农杆菌菌液的制备:制备已转化好相关质粒的农杆菌菌液，在转化前一天摇瓶过 夜，在转化前将农杆菌菌液浓度在0D1.2~1.6之间。用配好的渗透培养基将农杆菌菌液稀 释至0D在0.8左右。
[0017] C拟南芥转化:将农杆菌菌液喷洒拟南芥后立即套袋，隔一周再喷一次。
[001引d转基因阳性植株的筛选:将收获的转基因种子灭菌后用水将种子铺在含20mg/L Hygromycin的MS培养基上，经Hygromycin筛选后仍然长势良好，株高高者可初步确定为阳 性苗。
[0019] 3将经过抗生素筛选得到的拟南芥转基因植株进行半定量PCR验证，设计引物P5: 5'-6(：1^64〔6664〔46了6〔6了6-3'和口6:5'-46464撕6661'撕4466(：〔6-3'扩增，4。"11作为内参， 引物P3:5' -TCGCTGACCGTATGAGCAAAGAA-3'，P4:5' -TGGAATGTGCTGAGGGAAGCA-3'。筛选出已 转化BsYJKB基因的拟南芥植株并进行繁殖(图2)。
[0020]实例2对筛选后得到的拟南芥转基因植株进行侣耐受性试验：
[0021 ] 1A1胁迫下拟南芥转基因植株生长状态的变化
[0022]将转基因拟南芥及野生型拟南芥植株(对照）同时接种到含有50μπιο1 l/iAlCb的 培养基中，处理5天后观察拟南芥根系生长状态的变化W及拟南芥植株鲜重的变化，由图3 可W看出，转基因拟南芥在A1胁迫下的生长状态及根系长度、鲜重等明显优于对照组。
【主权项】
1. 一种来源于枯草芽孢杆菌的质膜铝抗性基因 BsYJKB在培育耐铝拟南芥中的应用，即 符合序列表中序列1的核昔酸序列的基因或编码序列表中序列2蛋白氣基酸序列的蛋白在 培育耐铝拟南芥中的应用。2. 根据权利要求1所述的BsYJKB基因在培育耐铝拟南芥中的应用，其特征在于构建了 双向启动子CaMV 35S (D35S)，将所述的BsYJKB基因与真核表达双元载体pYG8468相连，转 入农杆菌GV3101中，再采用花序浸染法转入拟南芥中。3. 根据权利要求1所述的BsYJKB基因在培育耐铝拟南芥中的应用，其特征在于将所述 的BsYJKB基因转入拟南芥中，对转基因拟南芥和未转基因的野生型拟南芥进行铝胁迫处 理，分析转基因拟南芥生长状态和根系变化以检测其耐错能力的提尚。
【专利摘要】本发明提供了一种来源于枯草芽孢杆菌的质膜铝抗性基因BsYJKB基因转入拟南芥中并使得这种转基因植物耐铝性增加的应用。所述BsYJKB基因序列如序列1所示，其编码的蛋白质序列如序列2所示，将该基因转化拟南芥，获得的转基因植物在含有高浓度Al的平板上，其根长比非转基因植物提高30％以上。本发明的基因可提高植物对Al的吸附，从而提高了转基因植对Al的耐受能力，为植物修复Al污染提供有益的帮助。
【IPC分类】C12N15/31, A01H5/00, C12N15/82, C07K14/32
【公开号】CN105543246
【申请号】CN201511027874
【发明人】汪仁, 李晓丹, 徐晟 , 夏冰, 田开洋, 谈金忠, 徐成华, 严刚, 薛仁忠
【申请人】江苏省中国科学院植物研究所, 江苏省地质矿产局第一地质大队
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月31日