蝴蝶兰成花相关GIGANTEA基因（DhGI1）的编码序列及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，具体是设及一种在蝴蝶兰中表达的成花相关 GIGANTEA基因 （DhGI 1)的克隆，该基因序列的分析，基因表达模式的分析，目的基因表达载 体的构建，植物转化，转基因植株的获得W及相应的生理特性的鉴定。
【背景技术】
[0002] 蝴蝶兰作为一种具有较好经济价值和观赏价值的花弁深受国内外消费者的喜爱， 但其成花需要电力降溫或高山催花，运就大大提高了其生产成本。因此，很多学者就尝试通 过基因工程手段调控蝴蝶兰花期，W降低生产成本。韩颖颖等(2004、2005)在蝴蝶兰花瓣中 得到了查尔酬合酶cDNA(pchs)，并成功转化烟草证明其参与花的形态建成。Zhang等(2010) 在曲alaenopsiS hyb;rida(CV. wedding promenade)中成功分离得到FTORICAULA/LEAFT (化0/LFY)的同源基因化alLFY，通过半定量RT-PCR得出化alLFY是蝴蝶兰成花的关键基因。 转基因方面的研究也取得了一定的进展，Belarmino等(2000)首先成功报道了用农杆菌介 导的方法开展蝴蝶兰转基因；Mishiba等（2005)用未成熟的圆球茎与农杆菌(包含gus和潮 霉素抗性基因）共培养，在筛选培养基上(含20mg/L的潮霉素)PLB再生获得蝴蝶兰抗潮霉素 的抗性植株;Qin等(2010)用叶片诱导出的愈伤组织与含有抗冷基因 LTP的农杆菌共培养， 得到了大量的抗冷蝴蝶兰转基因植株。但是，有关蝴蝶兰GIGANTEA基因 (DhGI 1)的研究还尚 未见报道。
[0003] 目前GI基因及同源基因功能分析主要集中在如拟南芥、金鱼草等长日照植物和水 稻、菊花等短日照植物上，研究表明GI基因在不同物种中的功能差异很大，有时甚至相反， 如在拟南芥GI基因的表达是促进开花，而在水稻则抑制开花。目前GI基因在光期纯感植物 的生物学功能研究尚未见报道，对开花具体调控机理尚不清楚。
[0004] 本发明研究了一种从蝴蝶兰中克隆出来的与成花相关GIGANTEA基因（DhGIl)，转 入拟南芥后引起花期提早。而在本发明公布之前尚未见公开报道过蝴蝶兰成花相关 GIGANTEA基因（DhGIl)的核巧酸序列及其在转基因植株中应用的资料。本申请探明了GI基 因在光期纯感植物的生物学功能，通过对比试验摸索了一套光周期顿感植物诱导其成花方 法。同时，理论上还掲示了蝴蝶兰成花"溫敏"现象的分子机理。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种从蝴蝶兰中克隆出来的与成花相关的 GIGANTEA基因，W及利用该基因在调控植物花期上的应用。
[0006] 解决上述技术问题采用如下技术方案：
[0007] 本蝴蝶兰成花相关GIGANTEA基因化hGI 1)为具有特定序列的DNA分子，编码区全长 402化P，包含一个3483 bp的开放阅读框，具有SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。
[000引本蝴蝶兰成花相关GIGANTEA基因（DhGIl)编码的蛋白质分子，具有SEQ ID NO.2所 示的氨基酸编码序列。
[0009]本蝴蝶兰成花相关GIGANTEA基因（DhGIl)的核巧酸引物序列，保守区设计的一系 列的RACE引物和RT-PCR引物序列见表1和表2。
[0010] 表1.通用引物
[0011]
[0012]
[0013]
[0014] 本蝴蝶兰成花相关GIGANTEA基因（DhGIl)的核巧酸编码序列SEQ ID N0.1转入拟 南芥W改变开花时间的方法按如下步骤进行：
[0015] (1)将蝴蝶兰GIGANTEA基因(DhGIl)的开放阅读框连接入植物表达载体，形成含有 蝴蝶兰DhGIl基因的植物表达载体；
[0016] (2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，用含有表达载体的农杆菌菌液浸泡拟南 芥花序，收集转基因种子；
[0017] (3)通过对拟南芥种子抗生素筛选和PCR鉴定，获得再生转基因植株，开花时间比 野生型拟南芥提早。
[0018] 本发明还提供了一种用于检测样品中是否存在蝴蝶兰化GI1基因的核巧酸序列 SEQ ID N0.1的方法，使用SEQ ID ^).4的核巧酸序列（见表3)对转基因拟南芥0魁进行口〇? 扩增，然后电泳检测目的片段的有无。
[0019] 表3.验证用引物序列
[0020]
[0021]本发明的有益效果是:观察和记录筛选到的转基因化GI1纯合子植株表型特征，发 现化GI1转基因拟南芥比野生型拟南芥提前5-6天开花，DhGIl转基因拟南芥开花所需时间 为30天，而野生型拟南芥开花所需时间为35天。DhGIl转基因拟南芥莲座叶的数量较野生型 少，DhGIl转基因拟南芥莲座叶数为10张，而野生型拟南芥莲座叶数为13张。由此推测， DhGIl基因参与了拟南芥的成花过程，可推断化GI1基因参与了蝴蝶兰的成花调控网络。同 时也可推测通过人为地过量表达或抑制表达化GIl基因，可调控蝴蝶兰花期，能够降低其生 产成本，达到周年生产蝴蝶兰产品目的。另外，可通过GI基因的调控方法，可调节其它光期 纯感观赏园艺植物花期，提高产品品质和经济效益。本申请填补了 GI基因在光期纯感植物 的生物学功能研究的空白，丰富了光周期诱导植物的成花理论和方法。同时，在理论上还掲 示了蝴蝶兰成花"溫敏"现象分子机理。
【附图说明】
[0022] 图1为经低溫处理40天的蝴蝶兰叶片组织提取的总RNA电泳图。
[0023] 图2为3'RACE扩增结果电泳图。
[0024] 图3为5'RACE扩增结果电泳图。
[0025] 图4为DhGIl基因核巧酸序列及所编码的蛋白质序列。
[00%]图5为DhGIl基因在蝴蝶兰不同生长阶段各组织表达模式图。
[0027] 图6上为DhGIl基因在低溫处理过程中根组织表达情况图。
[0028] 图6中为DhGIl基因在低溫处理过程中茎组织表达情况图。
[00巧]图6下为DhGIl基因在低溫处理过程中叶组织表达情况图。
【具体实施方式】
[0030] 下面将与本申请相关的试验情况作一介绍。下列实例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，如Sambrook.J.等主编的《分子克隆实验指南》中所述条件，或按照 制造厂商所建议的条件。
[0031] 试验一
[0032] 一、蝴蝶兰DhGIl基因的克隆
[0033] 1. W蝴蝶兰Doritaenopsis'Tinny Tender'为试验材料，植物材料在光照培养箱 内正常生长，光照培养箱光周期为16h/化（明期/黑暗），光照强度为150±10皿〇1 . πΓ2 · S 一1，光照条件下溫度为22°C，黑暗条件下溫度为18°C。
[0034] 2.总 RNA 提取
[0035] (1)取约lOOmg冻好的蝴蝶兰叶片，液氮研磨充分，将粉末移入到1.5ml离屯、管中；
[0036] (2) W样品体积不超过化izol试剂体积的10%的量，迅速加入lmlT;rizol试剂，并 迅速混匀，室溫条件下净置5min;
[0037] (3)加300μ1的氯仿及加或不加50ιι1β-疏基乙醇，用手剧烈摇荡15秒，室溫条件下 静置5 ±1分钟；
[0038] (4)4°C，12000巧 m 离屯、15 分钟；
[0039] (5)将离屯、分离的上清液500ml转入一新离屯、管，加0.5ml异丙醇和3 Μ化0AC， 抑5.2，室溫条件下沉淀10分钟；
[0040] (6)4°C，12000巧 m 离屯、15 分钟；
[0041 ] (7)弃上清液，加1ml浓度为75 %的乙醇清洗RNA，振荡片刻后，750化pm离屯、5分钟， 细屯、弃上清液；
[0042] (8)室溫静置30min，使RNA沉淀干燥到视力察觉不到水分，加入50μ1 DEPC水溶解， 采用分光光度计测定RNA浓度，并取化1进行琼脂糖电泳检测RNA质量；
[0043] (9)将样品保存于-70°C超低溫冰箱中备用。
[0044] 3.DNA 消化
[0045] 用面aseI (购自TaKaRa公司）去除总RNA中的基因组DNA，方法参照试剂说明书进 行。
[0046] 4.反转录
[0047] 采用匪LV反转录酶(购自Clontech公司）逆转录mRNA成cDNA第一链，方法按照实际 说明书进行。
[004引 5.基因克隆
[0049] (1)3'RACE 扩增 DhGIl 的 3'端
[0050] 根据建立的cDNA文库中的已知片段设计上游特异性引物，WAP为引物反转录出的 cDNA为模板，依次使用3GSP1/AUAP和3GSP2/AUAP进行巢式PCR扩增，然后将扩增出的目的 片段割胶回收，连接转化，克隆，测序。具体引物序列见SEQ ID NO.3。
[0化1] (2) 5'RACE 扩增 DhGIl 的5'端
[0052]根据已知片段设计反转录特异性引物和下游引物，使用5GSP1/AAP进行第一轮PCR 扩增，使用5GSP2/AUAP进行第二轮扩增，然后将扩增出的目的片段割胶回收，连接转化，克 隆，测序。具体引物序列见SEQ ID NO. 3。
[00对 （3)序列拼接
[0054]根据得到的3'序列和5'序列，利用DNAMAN软件进行拼接，得到基因的序列全长。 [005引试验二
[0化6] 二、RT-PCR检测蝴蝶兰DhGIl基因的表达模式
[0057]根据所得到的蝴蝶兰化GI1的序列，用Prime巧软件设计蝴蝶兰化GI1基因的特异 性引物序列见表3。
[0化引 1.总RNA提取
[0059] 具体步骤同试验一之2。
[0060] 2.反转录<