一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素ssd609的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体地说是一种制备拥有类似天然状态生理功能的娱 蚁多肤毒素 SSD609的方法。
【背景技术】
[0002] 最近在一种娱蚁亚型Scolopen化a subspinipes dehaani的毒液组学和转录组学 的研究中发现了许多多肤毒素，其中一些对离子通道有调节作用。他们用3V的电压刺激运 种娱蚁的毒腺，然后用微小的吸管收集毒液。将毒液稀释在Tris-HCl(20mM Tris-HCl， lOOmM化Cl，pH 7.6)溶液中之后，离屯、取上清，冻干(300mg冻干的娱蚁粗毒需要大约400只 娱蚁，即平均从一只娱蚁中提取的毒素不到Img，量非常微小）。然后将300mg娱蚁粗毒溶于 3mL Tris-HCl溶液中，用凝胶过滤层析的方法分离。收集分离出来的每一个峰，继续用阴离 子交换层析和反相高效液相色谱C18柱分离，进一步纯化，从而分离出许多毒液中单一的组 分。SSD609是其中之一，能够可逆地抑制KCNQ1/KCNE1钟离子通道电流，拥有潜在的药物治 疗可能性（Pen邑，Κ. ,Κοη邑，Υ. ,Zhai ,L. ,et al .Two novel antimicrobial peptides from centipede venoms[J].Toxicon:official journal of the International Society on Toxinology,55(2-3) :274-279.)。但是运种方法得到的娱蚁毒素 SSD609的量非常微小，本 发明提供的利用大肠杆菌异源表达纯化的方法，操作简便、成本低，能够大量制备出拥有生 理功能的娱蚁多肤毒素 SSD609。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种制备拥有类似天然状态生理功能的娱蚁多肤毒素 SSD609的方法，该方法操作简便，产量多，纯度高，成本低，且拥有类似天然状态下SSD609的 生理功能，可用于该娱蚁毒素的大量制备。
[0004] 实现本发明目的的制备流程图如图1所示，具体技术方案如下：
[000引 （1)获取SSD609蛋白的DNA序列，所述DNA序列如SEQ ID No.l所示；
[0006] (2)将SSD609的DM序列连接到带有化S6亲和标签和洲MO助溶标签的pET28载体 上，构建祀T28-His6-SUM0-FactorXa-SSD609质粒；
[0007] (3)将祀T28-His6-SUM0-化ctor Xa-SSD609质粒转化进入大肠杆菌，培养后采用 异丙基硫代半乳糖巧（Isop;ropyl-0-D-thi〇-galactoside，IPTG)诱导表达，离屯、后收菌； [000引（4)将细菌悬液超声破碎后离屯、取上清液，用儀柱纯化，洗脱后得到化S6-SUM0- SSD609融合蛋白；
[0009] (5化is6-SUM0-SSD609融合蛋白用化ctor Xa酶进行酶切，得到含有化S6-SUM0标签 和SSD609多肤毒素的蛋白混合液。该混合液与儀柱混合，His6-SUM0标签与儀柱结合，而 SSD609多肤毒素则作为流穿液被收集，并用HPLC进一步纯化；
[0010] (6)纯化后的SSD609多肤毒素使用GSH(还原型谷脫甘肤）和GSSG(氧化型谷脫甘 肤)进行二硫键重建，获得状态均一的SSD609多肤毒素；
[0011] (7)再次使用HPLC对SSD609多肤毒素进行纯化，并质谱验证SSD609的分子量大小， 冻干备用。
[0012] 作为优选，所述步骤(3)中蛋白表达的具体方法如下：
[0013] 将pET28-His6-SUM0-化ctor Xa-SSD609质粒转化进入Escherichia coli BL21 (DE3)gold细胞中，37°C培养箱中生长24h;挑选单克隆，在4mL LB小管中扩增后加入到 600mL含50yg/mL卡那霉素的LB液态培养基中，37°C培养，转速为22虹pm;当菌液0D600达到 0.別寸加入终浓度为0.5mM IPTG进行诱导，融合蛋白开始表达，于25°C培养箱中培养;2化后 离屯、机离屯、收菌，400化pm离屯、20min，弃上清液；用35mL裂解液重悬底部的E. coli细胞，收 集细菌悬液，备用。
[0014] 作为优选，所述步骤(4)中蛋白纯化的具体方法如下：
[0015] 将细菌悬液用超声破碎仪破碎，离屯、后取上清，得到含有杂蛋白的蛋白混合液。 Ni2+-NTA胶先用dd出0冲洗，再用Binding buffer平衡。平衡后的Ni2+-NTA胶与蛋白混合液混 合，使化S6-SUM0-SSD609蛋白与Ni2+-NTA胶结合;将结合了蛋白的Ni2+-NTA胶加入重力流穿 柱，用含30mM咪挫的Binding buffer洗去非特异性结合的杂蛋白，再用含有300mM咪挫的 Binding buffer洗脱His6-SUM0-SSD609融合蛋白。
[0016] 作为优选，所述步骤(5)中蛋白酶切和纯化的具体方法如下：
[0017] His6-SUM0-SSD609融合蛋白使用10K MWC0浓缩管（Millipore)离屯、浓缩，用 化ctor-Xa酶的酶切buffer将浓缩后的His6-SUM0-SSD609融合蛋白稀释至10血;Factor-Xa 酶按照1:3000(旨/旨）的比例加入化36-5刪0-550609融合蛋白溶液，20-25°(3酶切16}1，此时 化S6-SUM0-SSD609融合蛋白已被酶切开，分别为化S6-SUM0标签和SSD609多肤毒素；酶切后 的混合蛋白溶液与用Binding buffer平衡好的Ni2+-NTA胶混合化，HiS-SUM0融合标签结合 在Ni2+-NTA胶上，流穿出来的即为多肤毒素 SSD609蛋白。将该SSD609蛋白冻干，加入dd此0溶 解，用册以：进一步纯化:含有多肤毒素550609的溶液在018色谱柱上使用1%到69%线性梯 度的乙腊和0.1 %TFA溶液W5mL/min流速分离;谱峰于214皿和254皿波长检测，人工收集目 的蛋白。
[0018] 作为优选，所述步骤(6)中SSD609二硫键重建的具体方法如下：
[0019] 将得到的SSD609多肤毒素冻干，加入到变复性溶液中。该变复性溶液为0.33M NH4AC和0.5M G址C1混合液，所述多肤毒素 SSD609蛋白在变复性溶液中的浓度在100μΜ-200 μΜ之间。按GSH(还原型谷脫甘肤）：GSSG(氧化型谷脫甘肤）：多肤毒素 SSD609=100:10:1的 摩尔比，称取相应的G細和GSSG加入溶有多肤毒素 SSD609蛋白的变复性溶液中；调节pH至 7.8，4°C静置24-4化;静置后的溶液再次经过HPLC纯化，分离出状态均一的SSD609组分。
[0020] 与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
[0021] 本发明提供的多肤毒素 SSD609制备方法，蛋白表达量高，纯化后毒素纯度高，与直 接从动物毒腺中提取的方法相比，操作步骤简单，蛋白产量大，成本较低，且毒素拥有与天 然状态相似的生理功能。因此本方法可用于制备大量的拥有天然状态生理功能SSD609毒 素。
【附图说明】
[0022] 图1拥有类似天然状态生理功能的娱蚁多肤毒素 SSD609的制备流程图。
[0023] 图2祀T28-His6-SUM0-FactorXa-SSD609质粒构建示意图。IEGR为化ctor-Xa酶 切位点翻译后的氨基酸。
[0024] 图3娱蚁多肤毒素 SSD609纯化的Tricine-SDS-PAGE图。M:low range protein marker化Da);l:30mM咪挫洗脱的杂蛋白；2:300mM咪挫洗脱的目的蛋白；5:FactorXa酶切 之后;6:反挂儀柱后的SSD609; 7:挂在儀柱上的化s-SUMO融合标签。
[00巧]图4 SSD609二硫键重建前后册LC纯化对比图。A为二硫键重建之前，B为二硫键重 建之后。
[0026] 图5 SSD60犯SI-MS图。704.0峰为八价离子峰，804.4为屯价离子峰，938.3为六价 离子峰，1125.7为五价离子峰，1406.9为四价离子峰。所有运些峰的计算值均为5623.8化左 -6" 〇
[0027] 图6电生理方法验证SSD609对KCNQ1 /KC肥1钟离子通道的抑制作用。
【具体实施方式】
[0028] W下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和 权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
[0029] W下实施例中所使用的生物材料及化学制剂，若无特别声明，均为本领域常规产 品，下面将列出部分常用试剂。
[0030] LB培养基:NaCl lOg/L，蛋白腺lOg/L，酵母粉5g/L [0031 ]细胞裂解液:70mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0
[0032] Binding Buffer:20mM Tris，200mM NaCl，p册.0
[0033] 化ctor-Xa酶的酶切buffer:20mMTris-肥l，100mMNaCl，5mMCaCl2，p册.0
[0034] 变复性溶液：〇.33M NH4Ac，0.5M Gn肥 1
[00；3 日]实施例l:祀T28-His6-SUM0-FactorXa-SSD609质粒构建
[0036] 获得娱蚁毒素 SSD609的蛋白序列信息W及DM序列，进行基因合成，其中DM序列 如SEQ ID No.l所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；使用PCR方法在SSD609之前加入 化ctor Xa酶切位点，通过BamH I和化0 I限制性内切酶酶切位点连接到带有化S6亲和标签 和洲M0助溶标签的祀T28载体上，构建得到祀T28-化S6-SUM0-Factor Xa-SSD609质粒（如图 2所示）。测序验证正确。具体氨基酸序列如下:HHHHH服SD沈VN犯AK阳VK阳VK阳THINLKVSDGS SEIFFKI邸TTPLRRLMEAFAKRQGKEMD化R化YDGIRIQADQTP邸LDM邸NDIIEAHREQIGGSIEGRA孤KCE DSLRREIACTKCRDRVRT孤YFYECCTSESTFKKCQTMLHQ
[0037] 其中下划线部分为化S6-SU10亲和标签，斜体部分为化ctor-Xa酶切位点IEGR。
[003引实施例2:SSD609蛋白表达、纯化
[0039] 将上述质粒转化进入Escherichia coli BL21(DE3)gold细胞中，37°C培养箱中生 长2地(卡那霉素抗性）。挑选单克隆，在4mL LB小管中扩增后加入到600mL含50yg/血卡那霉 素的LB液态培养基中，37°C培养，转速为22虹pm。菌液0D600达到0.8时加入终浓度为0.5mM 异丙基硫代半乳糖巧（Isop;ro