一种编码阿尔法－海螺毒素肽的基因及其应用的制作方法

专利名称：一种编码阿尔法－海螺毒素肽的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及多肽化合物阿尔法一海螺毒素肽Vc1.1的基因工程及其在制药中的应用，属于生物领域。
背景技术：
临床中使用吗啡等药物来缓解癌痛、神经痛等顽固性疼痛会造成耐受、药效短暂以及成瘾等状况，因此具有很大的局限性。自第一个镇痛效果强于吗啡1000倍的镇痛药物Ziconotide成功上市以来，其有效成分欧米加海螺毒素MV II A受到了生物医药界的极大关注。除此之外，有数种其它的海螺毒素也具有不成瘾、低耐受的镇痛效果。例如阿尔法—海螺毒素Vc1.1，它是一个由十六个氨基酸组成的多肽，具有拮抗神经元型烟碱样乙酰胆碱受体(nAChr)的活性。该受体与痛觉的传导相关，抑制该受体可以起到镇痛作用，且在神经细胞受到伤害后，能够加速神经损伤的恢复[Sandall DW，Satkunanathan N，Keays D A，et al.A novel R-Conotoxin identified by gene sequencing isactive in suppressing the vascular response to selective stimulation of sensory nerves in vivo，Biochemistry，2003，426904-6911]。与MV II A比较起来，Vc1.1具有如下特点(1)镇痛效果强；(2)镇痛持续时间长久；(3)给药方便海螺毒素MVIIA的药靶位于中枢神经系统，因此需颅内给药或椎管注射，这大大限制了其使用，而Vc1.1可通过皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射等发挥其镇痛效果，这是由于Vc1.1的所作用的神经元型nAChr位于外周神经系统；(4)低耐受性，无成瘾性；(5)副作用小这是由于Vc1.1药靶确切、作用位点专一、用量低；(6)用途广泛适用于所有的阿片类药敏感型和不敏感型的疼痛，特别是癌痛、艾滋病痛、神经痛、糖尿病相关疼痛以及风湿引起的疼痛等[Satkunanathan N，Livett B，Gayler K，et al.Alpha-conotoxin Vc1.1 alleviatesneuropathic pain and accelerates functional recovery of injured neurones，Brain Research，2005，1059(2)149-158]。
由于天然Vc1.1的产量极少，工业化生产必须通过化学合成或基因工程方法来制备。化学合成反应步骤多、副产物多、纯化技术复杂，对环境污染大、对车间工人的健康不利，因此具有较高的制造成本。尽管采用基因工程方法可以克服化学合成的许多缺点，但目前在工艺上实现起来仍面临许多挑战(1)Vc1.1是16个氨基酸的小肽，分子量仅1.7kD左右，在复性或纯化的过程中，均没有针对此截留分子量的透析袋或超滤膜供选择；(2)没有简便易行的方法对其进行鉴定和检测由于分子量小，在SDS-PAGE电泳中很难聚集成一条窄带，即使Tricine电泳也并非每次都能成功，此外，小分子量区的蛋白Marker难以购买且价格昂贵；(3)Vc1.1是富含二硫键的肽，这使其复性更加困难，而目前可供选择的复性方法中必须用到低截留分子量的透析袋或超滤膜，由前所述，这难以实现；(4)由于分子量小，诱导表达中很容易被细菌胞内蛋白酶降解，难以单独表达，因此必须考虑串联表达或融合表达，这些方法都需切割表达产物以获得目标分子。目前基因工程中用于切割蛋白的主要途径有溴化氰裂解或凝血酶切割等溴化氰专一地裂解蛋白质中甲硫氨酸处的肽键，但试剂本身有剧毒，在制药工业使用上受到严格的限制，且下一步还需要花费较高的成本来去除溴化氰；凝血酶价格较贵、酶切特异性差且容易变性失活。
可能由于存在上述技术瓶颈，目前未见基因工程法制备Vc1.1或与其类似的富含二硫键的小肽化合物的报道。

发明内容
技术问题本发明的目的是针对生产上述镇痛药物的现有技术基础及其局限性，公开一种适用于本方法的Vc1.1基因及其应用。这种基因工程工艺使得从菌体裂解物中制备纯度95％以上的Vc1.1仅需吸附、复性、酶切、洗脱这4个主要步骤即可，因此在大规模生产和临床应用具有很强的竞争力。
技术方案一种编码阿尔法一海螺毒素肽Vc1.1的基因，其特征是，该基因的编码链具有如下的核苷酸序列5’GGTTGCTGCTCTGACCCGCGTTGCAACTACGACCACCCGGAAATCTGCTAA3’。
根据大肠杆菌密码子的偏好性，设计能够以正确的读码框插入pET-32a(+)载体KpnI和EcoRI限制性酶切位点之间的核苷酸序列ggtaccgac gac gac gac aagGGTTGCTGCTCTGACCCGCGTTGCAACTACGACCACCCGGAAATCTGCtaagaattc(顺序为5’到3’)。其中，下划线部分为限制性酶切位点，斜体部分为肠激酶酶切位点，大写字母部分为编码区。这样设计使得Vc1.1基因编码区能够以正确的读码框插入肠激酶位点和EcoRI酶切位点之间。合成上述序列的双链，并制造KpnI和EcoRI的粘性末端，按照分子克隆中常规的双酶切技术，将所得核苷酸序列整合入pET-32a(+)载体KpnI和EcoRI限制性酶切位点之间。测序验证读码框正确性和插入的正确性，从而获得重组载体pET-32-Vc1.1。上述几个步骤示于图1。
将重组载体转化入大肠埃希氏杆菌BL21(DE3)(购于天为时代公司)，获得重组基因工程菌株EBVc1.1。在T7强启动子的开启表达作用下，经过低温24h诱导后，表达的Trx-Vc1.1融合蛋白(硫氧还原蛋白-Vc1.1融合蛋白)可占菌体总蛋白的50％以上。破碎菌体后，立即将该融合蛋白结合到Ni2+亲和层析柱(Ni-NTA或Ni-IDA)上，随后用空气饱和的复性缓冲液(20mM Tris-HCl；0.5M精氨酸；50mM NaCl；pH8.0)洗涤浸泡24h，用肠激酶酶切缓冲液(20mM Tris-HCl；2mM CaCl2；50mM NaCl；pH7.4)洗涤浸泡12h以上，按照每单位肠激酶切割5mg融合蛋白的用量将酶加入柱内，室温反应24h进行充分酶切，期间循环流动酶切缓冲液让其混匀，待柱子的颜色从淡蓝色变为白色或米黄色之后，洗脱即可获得具生物活性的Vc1.1。最后还可以对产物C末端用丝氨酸型羧肽酶进行酰胺化从而获得更高活性和更强稳定性的Vc1.1。
上述的基因在制备镇痛药物中的应用醋酸扭体实验证明，采用本发明中的方法制得的Vc1.1具有与天然Vc1.1同样的生物活性在腹腔注射0.1μM浓度的肽溶液0.5mL/20gbw的药物后，在1h、4h和16h时刻均具有于天然Vc1.1类似的显著镇痛活性(图3)。且镇痛效果以及作用时间均显著强于已经上市的药品Ziconotide(MVIIA)。
除Vc1.1以外，本系统适合于各种具有镇痛活性的海螺毒素肽的制备，包括各种阿尔法类或欧米加类海螺毒素。同时，本系统也有助于各类富含二硫键的肽的制备。
有益效果基因工程中的克隆、诱导表达和破碎菌体并不是本发明所要解决的核心问题。重点部分在于创造了一种具有6个组氨酸结构的融合蛋白，该蛋白的结构用“Trx-6His--EK-Vc1.1”式表示。其中，EK为肠激酶酶切位点，而为防止6His吸附位点与Vc1.1距离太近而影响复性，在EK与6His间还存在pET-32a(+)载体本身表达的柔性序列，用在上述结构示意式中用“--”表示。6His与Ni-NTA或Ni-IDA树脂具有很强的吸附作用，同时这种树脂具有相当大的载量，使得表达的融合蛋白能牢固地、大量地结合在柱上。经柱上复性和肠激酶酶切之后，具有正确构象的Vc1.1分子被洗脱，而Trx蛋白则以“Trx-6His--EK-”的形式仍吸附在层析柱上，这样的过程很方便地实现了目标蛋白的复性以及融合蛋白中目标蛋白与非目标蛋白的分离。随后，用250mM的咪唑将“Trx-6His--EK-”洗脱后，该层析柱还可以继续使用。经实验证实，Ni-NTA经洗涤和再生可以反复使用500次以上。
这种首创的将6His结构置于两个组分之间的融合蛋白构建方式在表达、复性并纯化这类富含二硫键的镇痛小肽上具有以下突出优点1主要操作都在亲和层析柱上进行全部的纯化方法仅需要进行吸附、复性、酶切、洗脱四个步骤，大大减少仪器设备、人员、原料和能源的投入。使得产物纯化步骤少。
本方法的核心部件是金属离子亲和层析柱。这是一种可以反复再生且吸附6His效果优良的层析柱。其特点是载量大本工艺中1mLNi-NTA树脂可以结合8mg重组蛋白；6His与柱子结合牢固本工艺中融合蛋白浸泡72h之后，仍然没有任何物质能够被酶切缓冲液洗脱。
在酶切过程中，柱子的颜色可很方便地作为判定酶切是否完全的依据。Ni-NTA在结合融合蛋白之后呈现淡蓝色，随逐渐被切下来的Vc1.1释放并游离到填料间质溶液空间中，原本的淡蓝色会逐渐转变为白色或米黄色，此时，进行洗脱即可获得具生物活性的Vc1.1。
2产物纯度高利用本发明中的制备方法所得产物经反相HPLC检测(图2)，将峰面积积分后计算得知，一次纯化的纯度可达95.4％。该实验检测波长为215nm，上样量100μL，乙腈洗脱浓度从0％到100％，柱型为SOURCE 5RPC ST。由图可见所得产物具有较高的纯度。相对于化学合成制备方法和一般的基因工程发酵，本方法制可显著降低下游的纯化成本。
3易于对目标产物在高浓度下进行低试剂消耗量的操作由于目标产物牢固地吸附在柱上，更换缓冲系统时产物损失少。由于柱内体积很小，而吸附的蛋白量很大，因此在操作时试剂消耗少。
同时，在纯化过程中，大部分步骤是将表达产物Trx-AP融合蛋白吸附在柱上进行，由于6His与亲和层析柱的高度选择性和特异性吸附，蛋白酶早已随复性缓冲液流出。这样，相对于普通基因工程纯化方法的液相纯化的方法而言，能够有效地减少甚至杜绝大肠杆菌本体蛋白酶对于表达产物的降解。
4对环境污染少，对生产工人没有毒性在本方法中，所有反应都在层析柱的液相中进行，不会产生粉尘，对生产工人没有毒性；制备过程中不使用也不产生有毒、污染性的物质，因此相对于化学合成来说，对环境污染大大减少。
5副产物少，且副产物具有其他用途本方法中唯一的副产物是融合蛋白切割后所剩下的硫氧还原蛋白(Trx蛋白)。在本方法最后一步切割并洗脱完成之后，Trx蛋白仍然吸附在在柱上。因此，本方法在纯化Vc1.1的同时，也实现了Trx蛋白的纯化。Trx蛋白据报道在体内具有抗过氧化、清除自由基、保护组织器官免受氧化损伤的作用，因此也是一种潜在的药物前体。
尽管切割中所用到的肠激酶也随Vc1.1被洗脱，但其用量十分微小，每获得1mg的Vc1.1仅需使用约1μg的肠激酶，这在RP-HPLC中几乎检测不到。
经过经济核算，用本发明所涉及的方法生产Vc1.1的成本为用化学合成法生产成本的1/20。
综上所述，与Trx蛋白融合表达解决了前述的小肽独立表达易被降解的问题；用高浓度的咪唑洗脱产物在SDS-PAGE上相对于酶切之前位置的高低来间接地检测酶切是否成功，这同时也解决了Vc1.1的检测问题；由于复性操作全部在柱上完成，这成功地解决了缺乏低截留分子量的透析袋或超滤膜的问题；更为方便的一点是，融合蛋白被牢固地吸附之后，使得我们可以在很小的柱体积内对其进行任意操作，例如任意更换缓冲系统、任意改变盐浓度、复性、酶切等等。这些操作的试剂用量均很少，这是由于被吸附的蛋白处于一个很高的浓度状态(1mLNi-NTA树脂可以很牢固地结合8mg重组蛋白)，因此，在如此小的柱体积之内，仅需少量的试剂便可实现对于大量蛋白的操作，不用担心产物被稀释而需要浓缩或产物损失的问题。最为重要的一点是，蛋白分子由于被吸附尽管在如此的高浓度下也无法聚集在一起形成沉淀，同时也防止了分子之间的碰撞，在用空气饱和的复性缓冲液充分浸泡之后，Vc1.1分子内完全正确配对的二硫键得以形成。


图1.pET-32a-Vc1.1构建过程左上为KpnI、EcoRI双酶切的具有粘性末端的线性载体；右上为单链合成、退火、连接所构建的包含肠激酶酶切位点编码序列、Vc1.1编码区以及KpnI、EcoRI粘性末端的序列；两者经T4连接酶连接构成pET-32a-Vc1.1重组载体图2.纯化产物RP-HPLC的215nm处的峰图检测波长为215nm，上样量100μL，乙腈洗脱浓度从0％到100％，柱型为SOURCE 5RPC ST图3.1h、4h、16h时刻制备的Vc1.1、天然Vc1.1和MV IIA的镇痛效果对比图中，在所有时刻，所有组与生理盐水在扭体抑制率上的差异均为极显著(p＜0.01)，各个时刻，制备的Vc1.1、天然Vc1.1组差异不显著)，天然Vc1.1组和MVIIA组差异极显著(p＜0.01)
具体实施例方式(一)基因工程菌构建1.据大肠杆菌密码子的偏好性，设计能够以正确的读码框插入pET-32a(+)载体KpnI和EcoRI限制性酶切位点之间的核苷酸序列ggtaccgac gac gac gac aagGGTTGCTGCTCTGACCCGCGTTGCAACTACGACCACCCGGAAATCTGCtaagaattc(顺序为5’到3’)。从而使得Vc1.1基因编码区能够以正确的读码框插入肠激酶位点和EcoRI酶切位点之间。
2.根据上述设计的基因序列，分别合成以下单链DNA(方向5’到3’)S1 CGACG ACGACGACAA GGGTTGCTGC TCTGACCCGC GTTGCAS2 ACGCGGGTCA GAGCAGCAAC CCTTGTCGTC GTCGTCGGTA CAS1 ACTA CGACCACCCG GAAATCTGCT AAGAS2 AATTCTTAGC AGATTTCCGG GTGGTCGTAG TTGCA3.上述所有单链DNA均用多核苷酸激酶在其5’端添加磷酸基团。
4.将步骤3所得DNA按照以下方案进行退火S1和S2进行退火；AS1和AS2进行退火，退火反应程序如下94℃5min；3个循环每个循环1min，每分钟降低8℃；6个循环每个循环1min，每分钟降低4℃；12个循环每个循环1min，每分钟降低2℃；室温30min。
5.记S1和S2退火产物为S，AS1和AS2退火产物为AS。将S与AS连接得到以上序列。
6.按照分子克隆中常规的双酶切技术，将所得核苷酸序列整合入pET-32a(+)载体KpnI和EcoRI限制性酶切位点之间。测序验证读码框正确性和插入的正确性，从而获得重组载体pET-32-Vc1.1。上述几个步骤示意于图1。
7.分别将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组基因工程菌株EBVc1.1。
(二)诱导表达以及表达产物的纯化、复性和融合蛋白切割1.工程菌EBVc1.1在氨苄青霉素的选择压下生长，至对数生长末期(OD600＝0.8)时，加入0.1mM的IPTG进行诱导。22℃诱导24h后，收获菌体。
2.菌体经过2000r/min离心富集后超声破碎。收集包含体，用2M尿素洗涤后溶解于8M尿素和8mM的β-巯基乙醇，室温封口反应12h。
3.将上述反应物结合到Ni-NTA或Ni-IDA亲和层析柱上，随后用用空气饱和的复性缓冲液(20mM Tris-HCl；0.5M精氨酸；50mM NaCl；pH8.0)洗涤浸泡24h以上。
4.用肠激酶酶切缓冲液(20mM Tris-HCl；2mM CaCl2；50mM NaCl；pH7.4)洗涤浸泡12h以上。
5.按照每单位肠激酶切割5mg融合蛋白的用量将酶加入柱内，室温反应48h以进行充分酶切。
6.用肠激酶酶切缓冲液洗脱经过切割下来的肽，纯度可达95％以上。
7.用丝氨酸型羧肽酶催化目标肽的C末端酰胺化反应。
(三)用本发明所述方法制备的Vc1.1与天然Vc1.1经腹腔注射的镇痛效果比较用醋酸扭体法测定药物的镇痛活性。ICR小鼠体重20g左右，雌雄各半，随机分组，每组8只。腹腔或皮下注射0.1μM浓度的肽溶液0.5mL/20gbw。给药后1h时，腹腔注射0.8％的醋酸0.2mL/20gbw，记录15min内的小鼠扭体次数。1h、4h、16h时刻Vc1.1、Vc1.1、Vc1.1和MV II A的镇痛效果，以1h时刻生理盐水组作为对照，测定扭体抑制率。结果如图3所示，人工制得的Vc1.1与天然Vc1.1的镇痛效果类似，其镇痛效果在1h、4h和16h时刻显著强于MVIIA(P＜0.01)。同时，两种Vc1.1的有效作用时间均显著长于MVIIA。
权利要求
1.一种编码阿尔法一海螺毒素肽Vc1.1的基因，其特征是，该基因的编码链具有如下的核苷酸序列5’GGTTGCTGCT CTGACCCGCGTTGCAACTACGACCACCCGGAAATCTGCTAA 3’，该基因编码阿尔法一海螺毒素肽Vc1.1，其氨基酸序列为GCCSDPRDNYDHPEIC。
2.一种包含权利要求1所述基因的载体，其特征是，该载体在相容性宿主细胞中并且当宿主处于合适的生长状态下时能够生成Vc1.1肽或包含该肽序列的蛋白。
3.如权利要求2所述的基因载体，其特征是，该载体是将编码Vc1.1肽的多聚核苷酸按照与硫氧还原蛋白(简称Trx蛋白)基因同相位的读码框和编码链5’到3’的顺序重组在pET-32a(+)载体的肠激酶酶切位点与EcoRI位点之间所构建而成的。
4.一种被如权利要求1或2所述基因载体所转化的宿主，其特征是，该宿主能够生成如权利要求2中所述的多肽或包含该多肽序列的蛋白。
5.如权利要求4所述的宿主，其特征是，该宿主为将载体转化入大肠埃希氏杆菌BL21(DE3)所构建的基因工程菌株EBVc1.1。
6.权利要求4所述宿主的应用，其特征是，将该基因工程菌经过诱导表达Trx-Vc1.1融合蛋白，破碎菌体收集融合蛋白并将其结合到金属离子亲和层析柱上，经过复性、肠激酶切割融合蛋白、洗脱切割产物并进行或不进行C端酰胺化而获得具生物活性的Vc1.1。
7.权利要求1所述的基因在制备镇痛药物中的应用。
8.权利要求6所述的方法在制备富含二硫键的镇痛肽中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种编码阿尔法一海螺毒素肽(Vcl.1)的基因及其利用方法。属于生物领域。Vcl.1是具有2对二硫键的16肽，本发明公开了编码这种肽的基因及其基因工程。该基因的利用方法包括将其重组入表达载体，转化宿主细胞后在其中克隆并表达融合蛋白，经亲和层析、复性并纯化，获得具有拮抗神经元型烟碱样乙酰胆碱受体活性的Vcl.1肽。上述方法具有步骤少、质量稳定、产物纯度高、制备成本低、副产物少以及不污染环境等优点。所制备的Vcl.1在受体研究和药物开发中也具有重要价值。
文档编号C07K7/08GK1807622SQ20051002267
公开日2006年7月26日 申请日期2005年12月28日 优先权日2005年12月28日
发明者杨仑, 张治国, 连桂芳, 徐朗莱 申请人:南京农业大学