专利名称：修饰的动物促红细胞生成素多肽和其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及经至少一个非天然编码的氨基酸修饰的猫、犬和马促红细胞生成素多肽。
背景技术：
生长激素(GH)超基因家族(贝赞F. (Bazan, F.)，现代免疫学(Immunology Today)，11 :350-354(1991)；莫特 H. R. (Mott，H. R.)和坎贝尔 I. D. (Campbell，I. D.)，结构生物学的当前观点(Current Opinion in Structural Biology) 5 :114-121 (1995)；西文诺曼0. (Silvennoinen, 0.)和艾利J. N. (Ihle，J. N.) (1996)造血细胞因子受体的信号传导(SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS))代表了一组具有类似结构特征的蛋白质。尽管这一家族中仍有较多的成员有待鉴别，但一些家族成员包括下述各物 生长激素、催乳激素、胎盘催乳素、促红细胞生成素(erythropoietin，ΕΡ0)、血栓形成素 (thrombopoietin, ΤΡ0)、白细胞介素 _2 (IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、 IL-IU IL-12(p35亚基)、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、 α干扰素、β干扰素、Y干扰素、ω干扰素、τ干扰素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细Ifi - (granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)和心肌营养素-1(0虹肚0廿叩1^11-1，01-1)( “GH超基因家族”)。尽管GH超基因家族的成员一般具有有限的氨基酸或DNA序列一致性，但其具有类似的二级结构和三级结构。共有的结构特征使得易于鉴别出基因家族的新成员。GH超基因家族的一个成员是猫促红细胞生成素(feline erythropoietin，fEPO)。 天然存在的促红细胞生成素(EPO)是在哺乳动物肾脏和肝中产生的分子量为34千道尔顿 (kDa)的糖蛋白激素。EPO是红细胞生成过程中的关键组分，可诱导祖先红细胞增殖和分化。EPO的活性还与包括球蛋白和碳酸酐酶在内的多种红细胞特异性基因的活化相关。例如参见邦德伦特(Bondurant)等人，分子细胞生物学(Mol. Cell Biol.) 5 :675-683(1985)； 考雷(Koury)等人，细胞生理学杂志(J. Cell. Physiol. ) 126 :259-265 (1986)。促红细胞生成素受体(EpoR)是造血/细胞因子/生长因子受体家族的成员，这一家族包括数种其它生长因子受体，例如白细胞介素(IL)-3、IL-4和IL-6受体、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体以及催乳激素和生长激素受体。参见贝赞(Bazan)，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci USA) 87 :6934-6938 (1990)。细胞因子受体家族的成员含有4个保守半胱氨酸残基和刚好位于跨膜区外部的色氨酸-丝氨酸-X-色氨酸-丝氨酸基序。这些保守序列被认为涉及蛋白质-蛋白质相互作用。例如参见千叶(Chiba)等人，生物化学与生物物理研究通讯(Biochim. Biophys. Res. Comm) 184 :485-490 (1992)。美国专利第5，441，868 号、第 5，547，933 号、第 5，618，698 号和第 5，621，080 号描述了编码人EPO的DNA序列，以及具有天然存在的EPO的部分或全部一级结构构象和生物特性的分离多肽。
EPO的生物作用是来源于其与特定细胞受体的相互作用。人们已经充分了解了 EPO与其受体细胞外结构域(EPObp)之间的相互作用。高分辨率χ射线晶体学数据显示， EPO具有两个受体结合位点，并依序使用分子上的不同位点结合两个受体分子。这两个受体结合位点称为位点I和位点II。位点I包括螺旋D的羧基末端以及部分螺旋A和A-B环， 而位点II涵盖螺旋A的氨基末端区和一部分螺旋C。EPO与其受体的结合是依序发生的， 其中位点I首先结合。接着，位点Π与第二个EPO受体接合，引起受体二聚化以及细胞内信号传导路径的活化，从而产生细胞对激素的反应。重组人EPO可用作治疗剂，并且已经被批准用于治疗人类个体。EPO缺乏会引起贫血，例如，这已经通过外源投予激素成功地进行治疗。贫血可大致分为两类再生性和非再生性贫血。再生性贫血倾向于由失血引起，或是由免疫系统引起红细胞破坏所致。另一方面，非再生性贫血是骨髓没有或无法对贫血作出反应的病症。引起贫血的常见原因是慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)，而其它病例中大部分是由感染猫白血病毒(feline leukemia virus, FeLV)所引起。这两种病症是导致宠物猫死亡的1号O^LV)和2号(CRF)原因。人们已经使用hEPO来治疗猫贫血。 不幸的是，当使用hEPO治疗猫贫血时，会出现有关免疫原性的问题，而且用hEPO治疗的猫中约25%到33%出现红细胞再生障碍性贫血(red cell aplasia，RCA)。曾进行了多项研究，包括用重组hEPO治疗患有CRF的11只猫和6只狗的研究，尽管重组hEPO在某种程度上显示出增加红细胞(RBC)和网织红细胞计数的能力，但11只猫中有5只产生了抗r-hEPO抗体(LD考基尔(LD Cowgill)等人，美国兽医协会杂志(J Am Vet Med Assoc.) 1998年2月 15日；212 ) :521-8)。利用沈只测试猫个体进行了有关重组猫促红细胞生成素(rfEPO) 的安全性和功效的研究，发现尽管RBC和网织红细胞计数也有所升高，但沈只猫中有8只 (即，超过30% )产生了抗r-fEP0抗体(JE雷多夫(JE Randolph)等人，美国兽医研究杂志(Am J Vet Res.) 2004年10月；65(10) =1355-66) 在另一项研究中，对由10只猫构成的研究组投予含有猫促红细胞生成素cDNA的重组2型腺相关病毒(rAAW)载体，发现在所有用载体处理的猫中都检测到了 rAAV2抗体，1只猫患上纯红细胞再生障碍性贫血，而用较低量处理的猫未显示出作用(MC沃克(MC Walker)等人，美国兽医研究杂志(Am J Vet Res. )2005 年 3 月；66 (3) :450-6)。共价连接亲水性聚合物聚(乙二醇)(缩写为PEG)是一种增加许多生物活性分子 (包括蛋白质、肽，尤其是疏水性分子)的水溶性、生物利用率；增加血清半衰期；增加治疗半衰期；调节免疫原性；调节生物活性；或延长循环时间的方法。PEG已被广泛用于医药品或人工移植物以及生物相容性、无毒和无免疫原性极为重要的其它应用中。为了使PEG的所需特性最大化，与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高， 以便赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征，例如增加的水溶性和循环半衰期，同时不会不利地影响母体分子的生物活性。PEG衍生物常常是通过反应性化学官能团(例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N末端和碳水化合物部分)与生物活性分子键联。蛋白质和其它分子通常具有少数反应性位点可供聚合物连接。通常，最适于经由聚合物连接而修饰的位点在受体结合中起到重要作用，并且是保留分子的生物活性所必需的。因此，不加选择地将聚合物链与生物活性分子上的这些反应性位点连接，通常会使经聚合物修饰的分子的生物活性显著降低或甚至完全丧失。R.克拉克(R. Clark)等人，(1996)，牛物化学杂志(T. Biol. Chem.)，271 21969-21977。为了形成具有足够聚合物分子量以赋予目标分子所需优势的结合物，现有技术方法通常涉及将多个聚合物臂与分子随机连接，由此增加了母体分子生物活性降低乃至完全丧失的风险。形成PEG衍生物与蛋白质的连接点的反应性位点可由蛋白质的结构指示。蛋白质 (包括酶)是由各种α-氨基酸序列构成，这些序列的一般结构为H2N--CHR--C00H。一个氨基酸的α氨基部分(H2N-)与相邻氨基酸的羧基部分(一C00H)连接形成酰胺键，其可表示为一(NH--CHR--CO)n--,其中下标“η”可等于数百或数千。R表示的片段可含有关于蛋白质生物活性和连接PEG衍生物的反应性位点。举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位以及α位中存在一NH2部分。 ε -NH2在碱性ρΗ条件下自由反应。用PEG进行蛋白质衍生化领域中的很多技术都是针对开发用于连接蛋白质中存在的赖氨酸残基的ε-NH2部分的PEG衍生物。“用于先进聚乙二醇化技术的聚乙二醇禾口 行生物(Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation) ”，奈克塔分子工程目录(Nektar Molecular Engineering Catalog)，2003，第 1-17页。然而，这些PEG衍生物都具有共有的局限性，即，无法将其选择性地安装于蛋白质表面上存在的常见的多种赖氨酸残基上。在赖氨酸残基对于蛋白质活性极为重要(例如存在于酶活性位点中)的情况下，或在赖氨酸残基对于介导蛋白质与其它生物分子的相互作用起作用的情况下，如在受体结合位点的情况下，这将会成为显著的局限性。现有蛋白质聚乙二醇化方法的另一同等重要的难题在于，PEG衍生物可与除所需残基外的其它残基发生不必要的副反应。组氨酸含有结构以一N(H)--表示的反应性亚氨基部分，而许多与ε -NH2反应的衍生物也可与一N(H)--反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链具有游离硫氢基，结构以-SH表示。在一些情况下，针对赖氨酸ε--ΝΗ2基团的PEG衍生物也与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这样可产生经PEG衍生化的生物活性分子的复杂不均勻混合物，并且有破坏目标生物活性分子活性的风险。需要开发出这样的PEG衍生物，其允许在蛋白质内的单一位点引入化学官能团，随后使一种或一种以上PEG聚合物能够在蛋白质表面上明确界定且可预测的特定位点与生物活性分子选择性偶合。除赖氨酸残基外，此项技术中还曾就开发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N末端)的活性PEG试剂进行了大量尝试。美国专利第6，610，281号。“用于先进聚乙二醇化技术的聚乙二醇和衍生物(Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation)，，，奈克塔分子工禾呈目录(Nektar Molecular Engineering Catalog)，2003，第1_17页。可以使用定点诱变和此项技术中已知的其它技术，将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中，并且由此得到的游离硫氢基部分可与具有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。但这种方法比较麻烦，因为引入游离硫氢基会使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此，需要具有一种将化学官能团引入生物活性分子中的方式，其能使一种或一种以上PEG聚合物与蛋白质选择性偶合，同时还与硫氢基以及蛋白质中常见的其它化学官能团相容(即，不会与之发生不必要的副反应)。从此项技术的抽样(sampling)中可以了解到，所开发的用于连接蛋白质侧链，尤其赖氨酸氨基酸侧链上的一NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分的许多此类衍生物都证实在合成和使用方面存在问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键，这些键将经历水解，并因此分解、降解，或者以其它方式在水性环境(例如血流)中不稳定。一些衍生物可形成较为稳定的键，但会在形成键之前经历水解，这意味着PEG衍生物上的反应性基团可能会在连接蛋白质之前就失活。一些衍生物略带毒性，因此不太适于体内使用。一些衍生物反应过慢而无法实际使用。一些衍生物会因连接到负责蛋白质活性的位点而导致蛋白质活性丧失。一些衍生物对其将连接的位点不具特异性，这也会导致丧失所需活性以及缺乏结果的可再现性。为了克服用聚(乙二醇)部分修饰蛋白质所带来的问题，人们开发出了更为稳定(例如，美国专利第6，602，498号)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如，美国专利6，610，观1)的PEG衍生物。此项技术中无疑需要在生理环境中具化学惰性，而只有在需要的情况下才选择性反应形成稳定化学键的PEG衍生物。近来，已经报导了蛋白质科学中的一种全新技术，这项技术有望克服与蛋白质位点特异性修饰相关的众多局限。具体点说，已将新的组分加入到原核生物大肠杆菌 (Escherichia coli,E. coli)(例如参见 L.王(L.Wang)等人，(2001),科学(Science) 292 498-500)和真核生物酿酒酵母菌(Sacchromyces cerevisia, S. cerevisiae)(例如 J.秦 (J. Chin)等人，—301 :964-7(2003))的蛋白质生物合成机器中，使得所述机器能够在体内将非基因编码氨基酸并入蛋白质中。已使用这一方法，对琥珀密码子TAG作出反应，以高保真度将大量具有新颖化学、物理或生物特性的新氨基酸有效地并入大肠杆菌和酵母中的蛋白质中，所述氨基酸包括光亲和性标记和光敏异构化氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸。例如参见J. W.秦(J. W. Chin)等人，(2002)，美国化学协会杂志(Journal of the American Chemical Society) 124 :9026-9027 ;J. W.秦和 P. G.查鲁兹(P. G. Schultz)， (2002)，化学与生物化学(ChemBioChem)Il :1135-1137 ;J. ff.秦等人，(2002)，美国国家科学院院刊(PNAS United States of America) 99 :11020-11024 ；禾口 L··王(L. ffang)和P. G.查鲁兹(P. G. Schultz)，(2002)，化学通讯(Chem. Comm.)，1_10。这些研究已证实，有可能选择性地以常规方式引入一些化学官能团，例如炔基和叠氮部分，这些官能团不存在于蛋白质中，对20种常见的基因编码氨基酸中所见的所有官能团具化学惰性，并能用于有效且选择性反应而形成稳定共价键。将非基因编码氨基酸并入蛋白质的能力允许引入可向天然存在的官能团(例如赖氨酸的-NH2、半胱氨酸的硫氢基-SH、组氨酸的亚氨基等)提供有价值的替代选择的化学官能团。已知某些化学官能团对20种常见的基因编码氨基酸中所见的官能团呈惰性，但能干净且有效地反应以形成稳定键。例如此项技术中已知，叠氮基和乙炔基在催化量铜存在下，可在水性条件中进行胡伊斯根(Huisgen) [3+2]环加成反应。例如参见托尼诺(Tornoe) 等人，(2002)有机化学(Org. Chem.)67 :3057-3064 和罗斯托瑟夫(Rostovtsev)等人， (2002)德国应用化学(AnSew. Chem. Int. Ed. )41 :2596_2599。举例来说，通过将叠氮部分引入蛋白质结构中，就能够并入对蛋白质中所见的胺、硫氢基、羧酸、羟基具化学惰性，但也可与乙炔部分平稳且有效地反应而形成环加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮基仍保留化学惰性，而且在其它蛋白质侧链存在时在生理条件下不发生反应。本发明将特别针对与EPO的活性和制备有关的问题，并且还针对具有改进的生物或药理学特性(例如改进的治疗半衰期)的hEPO多肽的制备。
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发明内容
本发明提供包含非天然编码氨基酸的fEPO多肽。在一些实施例中，fEPO多肽与第二 fEPO连接。 在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子是一种双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物与第二多肽连接。在一些实施例中，所述第二多肽是 fEPO多肽。在一些实施例中，fEPO多肽包含至少两个氨基酸，连接到包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物。在一些实施例中，至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入fEPO中以下一个或一个以上对应于二级结构的区域中的任一位置1-7 (N末端)、8力6 (A螺旋)、27巧4 (A螺旋与B螺旋之间的区域),55-83 (B螺旋),84-89 (B螺旋与C螺旋之间的区域),90-112 (C螺旋)、113-137 (C螺旋与D螺旋之间的区域)、138-161 (D螺旋)、162-166 (C末端)、39-41 ( β 折叠1)、133-135 ( β折叠2) ,47-52 (微型B环)、114-121 (微型C环),34-38 (Α螺旋与反平行β 折叠之间的环)、51-57(Β'螺旋的C末端、B'螺旋与B螺旋之间的环以及B螺旋的N末端)、82-92(Β螺旋与C螺旋之间的区域)和120-133(C'螺旋与反平行β折叠2 之间的区域)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、 76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、 101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、 139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、 158、159、160、161、162、163、164、165和166。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152、153、154、155、156、157、158，159、160、161、162、163、164、165 和 166。在一些实施例中， 将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者1、2、3、4、5、6、17、 21、24、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58、68、72、76、 80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、113、116、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、136、162、163、164、165 和 166。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入fEPO中以下位置中的一者1、2、3、4、5、6、17、18、 21、24、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58、68、72、76、
1180、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、113、116、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、136、162、163、164、165 和 166。在一些实施例中，本发明的fEPO多肽在以下一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然编码氨基酸21、 24、27、28、30、31、34、36、37、38、40、55、68、72、76、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、
123、124、125、126、127、128、129、130、136和162。在一些实施例中，在这些或其它位置的非天然存在氨基酸与水溶性分子连接，所述位置包括(但不限于)以下位置21、M、38、83、 85、116和119。在一些实施例中，本发明的fEPO多肽在以下一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然编码氨基酸18、53、58、116、121、89、94、72、77、86、91、31、36、132、137、 163、168、120、125、55和60。在一些实施例中，本发明的fEPO多肽在以下一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然编码氨基酸53、58、116、121、89、94、72、77、86、91、31、36、 132、137、163、168、120、125、55和60。在一些实施例中，本发明的fEPO多肽在以下一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然编码氨基酸18、53、58、116、121、89、94、72、77、86、 91、31、36、132、137、163、168、120、125、55和60。在一些实施例中，在这些或其它位置的非天然存在氨基酸与水溶性分子连接，所述位置包括(但不限于)以下位置53、58、116、121、 89、94、72、77、86、91、31、36、132、137、163、168、120、125、55 和 60。在一些实施例中，本发明的fEPO多肽在以下一个或一个以上位置包含一个或一个以上非天然编码氨基酸123、
124、125、126、127、128、1 和130。在一些实施例中，在这些或其它位置的非天然存在氨基酸与水溶性分子连接，所述位置包括(但不限于)以下位置123、1对、125、1沈、127、1观、 129 和 130。在一些实施例中，fEPO多肽包含增加fEPO多肽对促红细胞生成素受体的亲和力的取代、添加或缺失。在一些实施例中，fEPO多肽包含增加fEPO多肽的稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，fEPO多肽包含增加fEPO多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，fEPO多肽包含增加宿主细胞中产生的fEPO多肽的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，fEPO多肽包含SEQ ID NO :2中选自由以下(但不限于)各氨基酸组成的群组的氨基酸取代N24、N36、N38、Q58、Q65、N83、Q86、G113、Q115和S126，及其组合。 在一些实施例中，fEPO多肽包含SEQ ID NO :4中选自由以下(但不限于)各氨基酸组成的群组的氨基酸取代:N24、N36、N38、Q58、Q65、N83、Q86、G113、Q115 和 S126，及其组合。在一些实施例中，可以用天然存在或非天然存在的氨基酸取代fEPO多肽中的氨基酸，只要至少一个取代是用非天然编码氨基酸进行即可。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、胼基、酰胼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码的氨基酸具有以下结构
(CH2)nR1COR2 RaHN ^COR4 其中η为0到10 为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、
经取代烷基和经取代芳基；且民为H、氨基酸、多肽，或氨基末端修饰基团；且R4为H、氨基酸、多肽，或羧基末端修饰基团。 在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含氨氧基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含酰胼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含胼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。 在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构
权利要求
1.一种猫促红细胞生成素(fEPO)多肽，其特征在于，包含非天然编码氨基酸。
2.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述fEPO多肽与至少一另一fEPO 多肽连接。
3.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
4.根据权利要求3所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇) 部分。
5.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子是双官能聚合物。
6.根据权利要求5所述的fEPO多肽，其特征在于，所述双官能聚合物与第二多肽连接。
7.根据权利要求6所述的fEPO多肽，其特征在于，所述第二多肽为非fEPO多肽。
8.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，包含至少两个氨基酸连接到包含聚 (乙二醇)部分的水溶性聚合物。
9.根据权利要求8所述的fEPO多肽，其特征在于，至少一个与所述水溶性聚合物连接的氨基酸为非天然编码氨基酸。
10.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQID NO 2中选自由残基1-7、27-54、84-89、114-137、162-166组成的群组的位置进行取代。
11.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQID NO :2中选自由以下组成的群组的位置进行取代残基1、2、3、4、5、6、8、9、17、21、 24、25、26、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、45、47、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、65、68、72、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、107、110、111、 113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、 132、133、134、136、154、157、158、159、160、162、163、164、165 和 166。
12.根据权利要求11所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQID NO 2中选自由以下组成的群组的位置进行取代残基2、4、17、21、24、27、28、30、31、32、34、 36、37、38、40、50、53、55、58、65、68、72、76、80、82、83、85、86、87、89、113、115、116、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、134、136 和 162，以及其组合。
13.根据权利要求11所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQ ID NO 2中选自由以下组成的群组的位置进行取代残基21、对、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130 和 162，以及其组合。
14.根据权利要求11所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQID NO 2中选自由以下组成的群组的位置进行取代残基21、对、38、83、85、86、89、116、119、 121、124、125、126、127 和 128，以及其组合。
15.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQID NO 2中选自由以下组成的群组的位置进行取代:24、36、38、58、65、83、86、113、115、126和其组合。
16.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述fEPO多肽包含增加所述fEPO多肽对促红细胞生成素受体的亲和力的取代、添加或缺失。
17.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述fEPO多肽包含增加所述fEPO 多肽的稳定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
18.根据权利要求16所述的fEPO多肽，其特征在于，包含在SEQID NO 2中选自由但不限于以下组成的群组的氨基酸取代S9A、F48S、Y49S、A50S、Q59A、A73G、G101A、T106A、 L108A、T132A、R139A、K140A、R143A、S146A、N147A、R150A 和 K154A,以及其组合。
19.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸对水溶性聚合物具反应性，而所述水溶性聚合物另外对20种常见氨基酸中的任一种无反应性。
20.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含羰基、 乙酰基、氨氧基、胼基、酰胼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
21.根据权利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含羰基。
22.根据权利要求21所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸具有以下结构(CH2)nR1COR2 R3HN COR4其中η为0-10 为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、 芳基、经取代烷基和经取代芳基；且民为H、氨基酸、多肽，或氨基末端修饰基团； 且R4为H、氨基酸、多肽，或羧基末端修饰基团。
23.根据权利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。
24.根据权利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含酰胼基。
25.根据权利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含胼基。
26.根据权利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
27.根据权利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。
28.根据权利要求27所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸具有以下结构(CH2)nR1X(CH2)mN3 R2H N xx^COR3其中η为0-10 为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为0、N、S或不存在；m为0-10 ;R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且民为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
29.根据权利要求20所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含炔基。
30.根据权利要求四所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸具有以下结构(CH2)nR1X(CH2)mCCH RzHN'^'^CORa其中η为0-10 为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为0、N、S或不存在m为 0-10出2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团；且民为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。
31.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子的分子量介于约IkDa与约IOOkDa之间。
32.根据权利要求31所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子的分子量介于IkDa与50kDa之间。
33.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通过使包含含羰基氨基酸的 fEPO多肽与包含氨氧基、羟胺基、胼基、酰胼基或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反应而制成。
34.根据权利要求33所述的fEPO多肽，其特征在于，所述氨氧基、羟胺基、胼基、酰胼基或氨基脲基经由酰胺键与所述聚(乙二醇)分子连接。
35.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通过使包含羰基的聚(乙二醇) 分子与包含非天然编码氨基酸的多肽反应而制成，所述非天然编码氨基酸包含氨氧基、羟胺基、酰胼基或氨基脲基。
36.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通过使包含含炔氨基酸的fEPO 多肽与包含叠氮部分的聚(乙二醇)分子反应而制成。
37.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，是通过使包含含叠氮基氨基酸的 fEPO多肽与包含炔部分的聚(乙二醇)分子反应而制成。
38.根据权利要求36或37所述的fEPO多肽，其特征在于，所述叠氮基或炔基是经由酰胺键与所述聚(乙二醇)分子连接。
39.根据权利要求4所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分子是分支或多臂聚合物。
40.根据权利要求39所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)分支聚合物各分支的分子量介于5kDa与30kDa之间。
41.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述多肽是促红细胞生成素拮抗剂。
42.根据权利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQID NO :2中选自由以下组成的群组的位置进行取代残基包括但不限于VII、R14、Y15、D96、 K97、S100、R103、S104、T107、L108 和 R110,以及其组合。
43.根据权利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
44.根据权利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
45.根据权利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，连接到水溶性聚合物的所述非天然编码氨基酸是存在于所述fEPO多肽的位点II区内。
46.根据权利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，连接到水溶性聚合物的所述非天然编码氨基酸通过防止所述fEPO拮抗剂结合于第二个fEPO受体，来防止所述fEPO受体二聚化。
47.根据权利要求41所述的fEPO多肽，其特征在于，除亮氨酸外的氨基酸取代SEQID NO 2 中的 L108。
48.根据权利要求47所述的fEPO多肽，其特征在于，精氨酸取代SEQID NO :2中的 L108。
49.根据权利要求1所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含糖部分。
50.根据权利要求3所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物经由糖部分与所述多肽连接。
51.一种分离的核酸，其特征在于，包含在严格条件下与SEQ ID NO 24,SEQ ID NO :25、 SEQ ID NO J6或SEQ ID NO :27杂交的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包含至少一个选择密码子。
52.根据权利要求51所述的分离的核酸，其特征在于，所述选择密码子选自由以下组成的群组琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子。
53.一种制备根据权利要求4所述的fEPO多肽的方法，其特征在于，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的分离的fEPO多肽与水溶性聚合物接触，所述水溶性聚合物包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分。
54.根据权利要求53所述的方法，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。
55.根据权利要求53所述的方法，其特征在于，所述非天然编码氨基酸残基包含羰基、 氨氧基、酰胼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
56.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述非天然编码氨基酸残基包含羰基部分，且所述水溶性聚合物包含氨氧基、羟胺部分、酰胼部分或氨基脲部分。
57.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述非天然编码氨基酸残基包含炔部分，且所述水溶性聚合物包含叠氮部分。
58.根据权利要求55所述的方法，其特征在于，所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分，且所述水溶性聚合物包含炔部分。
59.根据权利要求M所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇部分的平均分子量介于约IkDa与约IOOkDa之间。
60.根据权利要求58所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇部分为分支或多臂聚合物。
61.一种组合物，其特征在于，包含根据权利要求1所述的fEPO多肽和医药学上可接受的载剂。
62.根据权利要求61所述的组合物，其特征在于，所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
63.一种治疗所患病症受fEPO调节的患者的方法，其特征在于，包含对所述患者投予治疗有效量的根据权利要求61所述的医药组合物。
64.一种细胞，其特征在于，包含根据权利要求51所述的核酸。
65.根据权利要求64所述的细胞，其特征在于，所述细胞包含正交tRNA合成酶和正交 tRNAo
66.一种制备包含非天然编码氨基酸的fEPO多肽的方法，其特征在于，所述方法包含， 在允许表达所述包含非天然编码氨基酸的fEPO多肽的条件下，培养包含一个或一个以上编码fEPO多肽且包含选择密码子的多聚核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的细胞；以及从所述细胞中纯化所述fEPO多肽。
67.一种增加fEPO的血清半衰期或循环时间的方法，其特征在于，所述方法包含用非天然编码氨基酸取代天然存在fEPO中的任一个或多个氨基酸。
68.一种 fEPO 多肽，其特征在于，由具有 SEQ ID NO 24 ；SEQ ID NO 25 ；SEQ ID NO 26 或SEQ ID NO :27中所示序列的多聚核苷酸编码，在所述fEPO多肽中，至少一个氨基酸经非天然编码氨基酸取代。
69.根据权利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
70.根据权利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
71.根据权利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸在SEQID NO 3中选自由以下组成的群组的位置进行取代残基1、2、3、4、5、6、8、9、17、21、24、25、26、 27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、45、47、50、51、52、53、54、55、56、57、58、68、 72、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、107、110、111、113、114、115、 116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、 136、154、157、158、159、160、162、163、164、165 和 166。
72.根据权利要求68所述的fEPO多肽，其特征在于，所述非天然编码氨基酸包含羰基、 氨氧基、酰胼基、胼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
73.根据权利要求70所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)部分的分子量介于约IkDa与约IOOkDa之间。
74.根据权利要求70所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚(乙二醇)部分的分子量介于5kDa与40kDa之间。
75.根据权利要求70所述的fEPO多肽，其特征在于，所述聚乙二醇部分为分支或多臂聚合物。
76.一种医药组合物，其特征在于，包含根据权利要求68所述的fEPO多肽和医药学上可接受的载剂。
77.一种非人促红细胞生成素多肽，其特征在于，具有选自由SEQ ID NO 30 ；SEQ ID N0:31 ；SEQ ID NO 32和SEQ ID NO :33组成的群组的氨基酸序列，其中所述非人促红细胞生成素多肽包含非天然编码氨基酸取代或添加。
全文摘要
本发明提供经修饰的动物促红细胞生成素多肽和其用途。
文档编号C07K14/505GK102232085SQ200980147248
公开日2011年11月2日 申请日期2009年9月25日 优先权日2008年9月26日
发明者凯尔·阿特金森, 安娜-玛莉亚·A.·海斯蒲楠, 彼德·C.·康宁, 德林·李, 斯蒂芬妮·周, 法兰克·宋, 理查·S.·巴奈特, 田锋, 约瑟夫·谢菲尔, 马克·斯拉迪塔 申请人:Ambrx公司, 美国礼来公司