Ge11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米硒复合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及营养保健医疗领域，特别是涉及GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]冬凌草属于唇形科香茶菜属，学名又叫碎米亚，主产于河南济源县、信阳县、山西太行山鹤壁地区、陕西太白山区、四川南川县、贵州施秉县、习水县和遵义地区凤岗县等地区。冬凌草味苦、甘、微寒，具有清热解表和消炎止痛的功效，因此可被用于咽喉肿痛、扁桃体炎、蛇虫咬伤和风湿骨痛的治疗。同时，冬凌草还有很好的抗肿瘤作用，在河南济源县等地区被广泛用于食道癌的治疗。
[0003]大量研究表明，含有冬凌草甲素是冬凌草具有抗癌活性和抗炎活性的主要原因。冬凌草甲素属贝壳杉烯二萜类化合物，为无色棱柱状结晶，味道极苦，不溶于水，可溶于乙醚、甲醇、乙醇等有机溶剂，分子式为C2(]H2S06。冬凌草甲素具有良好的抗癌活性，对食管癌、贲门癌、原发性肝癌及乳癌等有明显缓解症状作用，有稳定和缩小瘤体及延长病人生命的效果。同时冬凌草甲素对白血病也具有很好的疗效，可以选择性地杀伤t(8:21)白血病细胞。如果跟化疗药物合用，冬凌草甲素可减轻化疗药物的不良反应，提高疗效，对食管上皮重度增生也有一定的疗效。
[0004]冬凌草甲素具有很好的生物活性，但由于水溶性差，生物利用度低，靶向性差，限制其临床应用，而通过应用纳米给药系统的原理改进剂型，能够克服这种缺陷，同时还能提高药效，提高药物靶向性。
[0005]砸是人体必需的微量元素，对人体的很多生理功能有非常重要的作用。砸被称为化学元素中的抗癌之王，能很好的抑制癌症的发生，且其对肿瘤病人的放化疗也有明显的辅助治疗作用。近年来，纳米药物的制备及其抗癌效果的研究逐渐成为新的研究热点。低毒性却拥有良好生物可利用性和生物活性的纳米砸近年来成为纳米药物研究领域的热点。纳米砸既可作为一类抗癌材料，也可作为药物载体，借助于纳米砸良好的生物可利用性，将药物运送到作用位置，提高药物的生物利用率。
[0006]目前，现有技术中已有关于褪黑素纳米砸、葡苷聚糖纳米砸和甲壳素纳米砸、液相多聚糖纳米砸的相关报道，但采用GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物迄今仍无专利和文献报道。
【发明内容】
[0007]基于此，有必要提供一种GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物及其制备方法和应用。
[0008]—种GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物，该复合物由冬凌草甲素-纳米砸溶液与GE11多肽和羧基活化剂反应制备而成，制备方法包括如下步骤:
[0009](1)将砸化合物、冬凌草甲素、还原剂、稳定剂分别配制成溶液后混合，控制混合体系中砸化合物、冬凌草甲素、还原剂、稳定剂的浓度分别为0.l-10mM、0.l-10mM、0.l_50mM、0.01-10wt%，于0-37°C反应5-20h，得到冬凌草甲素_纳米砸溶液；
[0010](2)将GE11多肽与羧基活化剂分别配制成溶液后，加入至所述冬凌草甲素-纳米砸溶液中，控制反应体系中GE11多肽和羧基活化剂的浓度分别为0.1-lOmg/mL和0.Ι-lOmM，于0-37°C反应5_20h，即得GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物溶液。
[0011]在其中一个实施例中，步骤(1)所述混合体系中砸化合物、冬凌草甲素、还原剂、稳定剂的浓度分别为0.5-2mM、0.l-2mM、5-10mM、0.01-0.lwt% ;步骤⑵所述反应体系中GE11多肽和羧基活化剂的浓度分别为0.l-2mg/mL和l_5mM。
[0012]在其中一个实施例中，所述GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的平均ZETA电位为30-60mV，平均粒径为50_90nm。
[0013]在其中一个实施例中，所述羧基活化剂为1- (3- 二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐?DC)。
[0014]在其中一个实施例中，所述砸化合物为亚砸酸钠；所述还原剂为抗坏血酸；所述稳定剂为壳聚糖。
[0015]在其中一个实施例中，
[0016]将砸化合物配制成溶液的方法为:将砸化合物溶于水中，配制成Ι-lOOmM的亚砸酸钠溶液；
[0017]将冬凌草甲素配制成溶液的方法为:将冬凌草甲素溶于甲醇中，配制成40_60mM的冬凌草甲素溶液；
[0018]将还原剂配制成溶液的方法为:将还原剂溶于水中，配制成Ι-lOOmM的还原剂溶液；
[0019]将稳定剂配制成溶液的方法为:将稳定剂溶于体积分数为0.1-1 %的醋酸水溶液中，配制成浓度为0.l_20wt%的稳定剂溶液；
[0020]将GE11多肽配制成溶液的方法为:将GE11多肽溶于水中，配制成l_100mg/mLGEll多肽溶液；
[0021]将羧基活化剂配制成溶液的方法为:将羧基活化剂溶于水中，配制成10-1000mM
的羧基活化剂溶液。
[0022]本发明还提供所述的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的制备方法，包括如下步骤:
[0023](1)将砸化合物、冬凌草甲素、还原剂、稳定剂分别配制成溶液后混合，按所述砸化合物、冬凌草甲素、还原剂、稳定剂的浓度控制混合体系中砸化合物、冬凌草甲素、还原剂、稳定剂的量，于0_37°C反应5_20h，得到冬凌草甲素-纳米砸溶液；
[0024](2)将GE11多肽与羧基活化剂分别配制成溶液后，加入至所述冬凌草甲素-纳米砸溶液中，按所述GE11多肽和羧基活化剂的浓度控制反应体系中GE11多肽和羧基活化剂的量，于0-37°C反应5-20h，即得GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物溶液。
[0025]在其中一个实施例中，对步骤(1)得到的所述冬凌草甲素-纳米砸溶液和/或步骤(2)得到的所述GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物溶液进行纯化，纯化的方法为:用水进行透析，去除未反应的原料。
[0026]本发明还提供所述的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物在制备具有EGFR靶向、抑制癌细胞增殖或抑制血管内皮细胞增殖功能的药物中的应用。
[0027]本发明还提供具有EGFR靶向、抑制癌细胞增殖、抑制血管内皮细胞增殖中一种或多种功能的药物，其活性成分包括所述的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物。
[0028]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0029]本发明采用GE11多肽对冬凌草甲素-纳米砸复合物进行修饰，制备得到的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物，粒径分布均匀、水溶性好、稳定性佳，经药理研究证明，具有良好的EGFR靶向功能，且能够有效抑制抑制癌细胞和血管内皮细胞的增殖，故该复合物在食品保健以及医疗卫生领域有着潜在的应用前景；另外，所述制备方法还具有简便易行，适宜工业化生产的优点。
【附图说明】
[0030]图1为GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物制备过程的图解；
[0031]图2为GE11多肽、冬凌草甲素、冬凌草甲素-纳米砸复合物和GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的紫外吸收结果；
[0032]图3为GE11多肽、冬凌草甲素、纳米砸、冬凌草甲素-纳米砸复合物和GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的红外吸收结果；
[0033]图4为冬凌草甲素-纳米砸复合物和GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的(A)平均粒径和(B)zeta电位；
[0034]图5为GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的透射电镜形貌图；
[0035]图6为GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物对肝癌IfepG2细胞、乳腺癌MCF-7细胞和脐静脉血管内皮细胞的IC50值；
[0036]图7为GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物对食道癌KYSE150细胞周期分布的影响，(A)对照组，(B)8yMGEll多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物作用组，(C) 16 μ MGE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物作用组，(D) 32 μ MGE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物作用组；
[0037]图8为GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物对食道癌KYSE150细胞线粒体膜电位的影响，(Α)对照组，(Β)8μΜ6Ε11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物作用组，(C) 16 μ MGE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物作用组，(D) 32 μ MGE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物作用组；
[0038]图9为(Α)装载香豆素-6的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的制备过程的图解和(Β)装载香豆素_6的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物作用食道癌KYSE150细胞后细胞内复合物的浓度(结果为每10s个细胞内砸的含量)；
[0039]图10为游离的GE11多肽分子对食道癌KYSE150细胞摄取装载香豆素_6的GE11多肽修饰的冬凌草甲素-纳米砸复合物的影响。