具有经修饰的糖基化的蛋白及其生产方法
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 本申请根据美国法典35 § 119(e)要求2013年2月13日提交的标题为"具有经修 饰的糖基化的蛋白及其生产方法"的美国临时申请系列号61/764, 502的权益，其全部公开 通过提述完整并入本文。
技术领域
[0003] 本公开涉及蛋白和蛋白生产方法的领域。 技术背景
[0004] 蛋白在乳腺中的转基因产生允许大量蛋白的产生，包括治疗性蛋白。然而，在乳腺 中产生的蛋白的糖基化模式有时候与血清产生的蛋白的糖基化模式不同。因此，需要修饰 乳腺产生的蛋白的糖基化的方法。
[0005] 发明简述
[0006] 在一个方面，本公开提供具有经修饰的糖基化的蛋白及其生产方法。一方面，本公 开提供用于生产具有经修饰的糖基化的蛋白的转基因动物和细胞。在一些实施方案中，所 述经修饰的糖基化是增加的唾液酸化。
[0007] 在一个方面，本公开提供生产具有经修饰的糖基化的蛋白的方法，所述方法包含 提供转基因的哺乳动物，其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达，其中 所述转基因哺乳动物在乳腺中表达蛋白，并且从所述转基因哺乳动物的乳腺中收获所述蛋 白。
[0008] 在一个方面，本公开提供生产具有经修饰的糖基化的蛋白的方法，所述方法包括 提供乳腺上皮细胞，其已经经过修饰以具有增加的唾液酸转移酶表达，其中所述乳腺上皮 细胞表达蛋白，并且从所述乳腺上皮细胞中收获所述蛋白。
[0009] 在本文提供的方法的一些实施方案中，与在尚未修饰为具有增加的唾液酸转移酶 表达的转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞中产生的蛋白相比，糖基化是经修饰的。在本文提 供的方法的一些实施方案中，所述经修饰的糖基化是增加的唾液酸化。
[0010] 在一个方面，本公开提供生产具有增加的唾液酸化的蛋白的方法，所述方法包含 提供转基因的哺乳动物，其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达，其中 所述转基因哺乳动物在乳腺中表达蛋白，并且从所述转基因哺乳动物的乳腺中收获具有增 加的唾液酸化的蛋白。
[0011] 在本文提供的方法的一些实施方案中，与在尚未修饰为具有增加的唾液酸转移酶 表达的转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞中产生的蛋白相比，唾液酸化是增加的。
[0012] 在本文提供的方法的一些实施方案中，所述具有经修饰的糖基化的蛋白或具有增 加的唾液酸化的蛋白是人蛋白。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述具有经修饰的 糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白是抗体。在本文提供的方法的一些实施方案 中，所述具有经修饰的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白是抗凝血酶。在本文提 供的方法的一些实施方案中，所述具有经修饰的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋 白是α-1抗胰蛋白酶。
[0013] 在一个方面，本公开提供了根据本文中提供的任何方法生产的具有经修饰的糖基 化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白。
[0014] 在一个方面，本公开提供组合物，其包含根据本文提供的任意方法生产的具有经 修饰的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白，所述组合物进一步包含乳。
[0015] 在一个方面，本公开提供在乳腺中增加唾液酸转移酶活性的方法，所述方法包含 提供转基因哺乳动物，其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达。
[0016] 在一个方面，本公开提供生产唾液酸转移酶的方法，所述方法包含提供转基因哺 乳动物，其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达，以及从所述转基因哺 乳动物的乳腺中收获唾液酸转移酶。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述方法进一 步包括使用唾液酸转移酶来使蛋白唾液酸化。
[0017] 在一个方面，本公开提供在乳腺中增加唾液酸转移酶活性的方法，所述方法包含 生成转基因的哺乳动物，其已经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达。在一 个方面，本公开提供生产唾液酸转移酶的方法，所述方法包含生成转基因的哺乳动物，其已 经经过修饰以在乳腺中具有增加的唾液酸转移酶表达，并从所述转基因哺乳动物的乳腺中 收获唾液酸转移酶。在本文提供的方法的一些实施方案中，所述方法进一步包含使用唾液 酸转移酶来使蛋白唾液酸化。在一些实施方案中，将唾液酸转移酶置于与所述蛋白接触。
[0018] 在一个方面，本公开提供根据本文提供的任意方法生产的唾液酸转移酶。
[0019] 在一个方面，本公开提供组合物，其包含根据本文提供的任意方法生产的唾液酸 转移酶，并进一步包含乳。
[0020] 在本文提供的方法、蛋白、组合物、转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的一些实施方 案中，转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞已经通过将编码唾液酸转移酶的核酸序列引入所述 转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的基因组中来修饰。
[0021 ] 在本文提供的方法、蛋白、组合物、转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的一些实施方 案中，在转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞中表达的蛋白由引入所述转基因哺乳动物或乳腺 上皮细胞的基因组中的核酸序列编码。
[0022] 在一个方面，本公开提供转基因哺乳动物，其已经经过修饰以在乳腺中具有增加 的唾液酸转移酶表达。在本文提供的转基因哺乳动物的一些实施方案中，所述转基因哺乳 动物进一步在乳腺中表达外源性蛋白。在本文提供的转基因哺乳动物的一些实施方案中， 所述外源性蛋白是人蛋白。在本文提供的转基因哺乳动物的一些实施方案中，外源性蛋白 是抗体。在本文提供的转基因哺乳动物的一些实施方案中，所述外源性蛋白是抗凝血酶。在 本文提供的转基因哺乳动物的一些实施方案中，所述外源性蛋白是α-1抗胰蛋白酶。
[0023] 在一个方面，本公开提供乳腺上皮细胞，其已经经过修饰以具有增加的唾液酸转 移酶表达。在本文提供的乳腺上皮细胞的一些实施方案中，所述乳腺上皮细胞进一步表达 外源性蛋白。在本文提供的乳腺上皮细胞的一些实施方案中，所述外源性蛋白是人蛋白。在 本文提供的乳腺上皮细胞的一些实施方案中，外源性蛋白是抗体。在本文提供的乳腺上皮 细胞的一些实施方案中，所述外源性蛋白是抗凝血酶。在本文提供的乳腺上皮细胞的一些 实施方案中，所述外源性蛋白是α-l抗胰蛋白酶。
[0024] 在本文提供的方法、蛋白、组合物、转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的一些实施方 案中，所述转基因哺乳动物是有蹄类动物。在一些实施方案中，所述有蹄类动物是山羊。
[0025] 在本文提供的方法、蛋白、组合物、转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的一些实施方 案中，唾液酸转移酶的表达在乳启动子的控制下。在一些实施方案中，所述乳启动子是山羊 β酷蛋白启动子。
[0026] 在本文提供的方法、蛋白、组合物、转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的一些实施方 案中，所述唾液酸转移酶是β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶（beta-galactosamide alpha-2, 6-sialyltranferase) 〇
[0027] 在本文提供的方法、蛋白、组合物、转基因哺乳动物或乳腺上皮细胞的一些实施方 案中，所述唾液酸转移酶是β-半乳糖酰胺α-2, 3-唾液酸转移酶。
[0028] 本发明的每种限制可以涵盖本发明的各种实施方案。因此，预期每种涉及任意一 种元素或元素组合的本发明的限制可以包括在本发明的每个方面中。本发明在其应用上不 限于以下描述中所列或图中显示的组分的构建和排列的细节。本发明能够有其它实施方案 并能够以各种方式实践或实施。另外，本文使用的措辞和术语用于描述的目的，而不应理解 为限制性的。
[0029] 附图简述
[0030] 图仅为说明性的，对于本公开的启用不是必须的。
[0031] 图1示出了与人蛋白（SEQIDΝ0:2)比较（标示为"对象"的底部序列）ST6f3-半 乳糖酰胺α-2, 6-唾液酸转移酶GENEID: 100861310ST6GAL1[山羊]的序列（SEQID NO: 1)(标示为"查询"的上部序列）。
[0032] 图2提供了ST6β-半乳糖酰胺α-2, 6-唾液酸转移酶基因的图示。
[0033] 图3提供了等电点聚焦（IEF)凝胶，显示具有增加的唾液酸水平的蛋白。图3Α 描述了两块凝胶：左侧组中的凝胶显示了pi标准梯（第1道），α-抗胰蛋白酶（ΑΑΤ，第2 道），以及使用商业化的唾液酸转移酶混合物处理的ΑΑΤ(第3道）。右侧组中的凝胶描述 了pi标准梯（第1道），使用唾液酸转移酶处理前的ΑΑΤ(第2道），使用商业化的唾液酸 转移酶混合物处理后的AAT(第3道），或使用从转基因山羊的乳中纯化的单个唾液酸转移 酶处理后的AAT(第4和5道）。图3B描绘了凝胶，其示出了Alfala:stin(? (AAT的一种唾 液酸化形式）（第1道），使用从产生唾液酸转移酶的转基因山羊的乳处理的AAT(第2道和 第7道），使用来自对照动物的乳处理的AAT(第3和8道），使用来自对照动物的乳和转基 因产生的唾液酸转移酶处理的AAT(第4道），使用缓冲液和转基因产生的唾液酸转移酶处 理的AAT(第5道），以及使用缓冲液处理的AAT(第6道）。
[0034] 图4提供的图解示出了使用转基因产生的唾液酸转移酶在体外使α1抗胰蛋白酶 唾液酸化。
[0035] 图5示出了在乳腺中过表达唾液酸转移酶的转基因山羊（第2列）和对照动物 (第1列）中乳铁蛋白的唾液酸化。
[0036] 图6示出了在产生唾液酸转移酶和ΑΑΤ两者（顶部图）和仅产生ΑΑΤ(底部图） 的山羊的乳腺中，ΑΑΤ的"体内"唾液酸化。
[0037] 图7示出了与血浆衍生的AAT (pdAAT)相比，ST3和ST6唾液酸化的转基因产生的 AAT的药代动力学特性。
[0038] 发明详述
[0039] 在一个方面，本公开提供具有经修饰的糖基化的蛋白及其生产方法。在一个方面， 本公开提供用于生产具有经修饰的糖基化的蛋白的转基因哺乳动物和细胞。
[0040] 在一个方面，本公开提供具有增加的唾液酸化的蛋白及其生产方法。在一个方面， 本公开提供用于生产具有增加的唾液酸化的蛋白的转基因哺乳动物和细胞，其中所述转基 因哺乳动物或细胞经修饰以具有增加的唾液酸转移酶表达。
[0041] 在转基因非人哺乳动物的乳腺中生产蛋白具有允许大量蛋白产生的优势。多种蛋 白可以在乳腺中产生，并且在非人哺乳动物中转基因生产已经用于产生人治疗性蛋白，例 如血清蛋白。转基因产生的血清蛋白的一个例子是一种转基因产生的抗凝血酶， 其已经在美国和欧洲批准应用（见，例如，US5, 843, 705,US6, 441，145,US7, 019, 193和US7,928,064)。
[0042] 在乳腺中转基因产生的蛋白与"天然"蛋白具有相同的氨基酸序列，只要引入转基 因哺乳动物中的编码所述蛋白的核酸与"天然"蛋白相同。然而，如果所述转基因蛋白是糖 蛋白，那么与"天然"蛋白相比，在转基因非人哺乳动物的乳腺中产生的蛋白的糖基化模式 可以有不同。例如，与从血清中分离的相同蛋白相比，乳腺产生的蛋白可以具有更低的唾液 酸化水平（见例如Edmunds,T，etal.，Blood91(12)，1998,4561-4571;Geun-CheolGilet al.，Glycobiology18(7)，2008, 526 - 539)。重组产生的蛋白和天然蛋白之间糖基化的差 异并不是乳腺中产生的重组（转基因）蛋白所独有的。重组蛋白的几乎任何产生方法（例 如在CH0细胞中产生）可以导致与天然蛋白相比的糖基化差异，这仅仅是因为细胞类型之 间糖基化酶的不同可用度和活性。重组产生的蛋白的糖基化的差异可以是相关或不相关